Name: isolation of viable adipocytes and stromal vascular fraction from human visceral adipose tissue suitable for rna analysis and macrophage phenotyping
Uploaded: 2020-10-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Viable Adipocytes and Stromal Vascular Fraction from Human Visceral Adipose Tissue Suitable for RNA Analysis and Macrophage Phenotyping at JoVE.c

Denna studie finansierades av Instituto Nacional de Perinatologia (bidragsnummer: 3300-11402-01-575-17 och 212250-3210-21002-06-15) och CONACyT, Fondo Sectorial de Investigación en Salud y Seguridad Social (FOSISS) (anslagsnummer 2015-3-2-61661).

Detta protokoll har godkänts av IRB vid Instituto Nacional de Perinatologia (212250-3210-21002-06-15). Deltagandet var frivilligt och alla inskrivna kvinnor undertecknade formuläret för informerat samtycke.
1. Insamling av visceral fettvävnad
<ol><li>Erhålla momsbiopsier genom partiell omentektomi under kejsarsnitt från friska vuxna kvinnor med singelgraviditeter utan förlossning.</li>
	<li>Efter livmoderstängning och hemostas, fortsätt med att identifiera större omentum och förl?...

Moms spelar en avgörande roll i metabolisk reglering och inflammation. Ett ökat intresse för fettcellernas och immuncellernas roll i den kroniska inflammation som är förknippad med fetma har lett till utvecklingen av olika tekniker för att separera SVF och fettceller som finns i AT. De flesta tekniker gör det dock inte möjligt att erhålla dessa två olika uppsättningar av celler som är livskraftiga för nedströmstillämpningar från samma momsbiopsi i en enda procedur, vilket kan vara avgörande för studier ...

Vit fettvävnad består inte bara av fettceller eller adipocyter, utan också av en icke-fettcellsfraktion som kallas stromal vaskulär fraktion (SVF), som innehåller en heterogen cellpopulation bestående av makrofager, andra immunceller som regulatoriska T-celler (Tregs) och eosinofiler, preadipocyter och fibroblaster, omgivna av kärl- och bindväv 1,2. Fettvävnad (AT) anses nu vara ett organ som reglerar fysiologiska processer relaterade till metabolism och inflammation genom adipokiner, cytokiner och mikroRNA som produceras och frisätts av olika celler i vävnaden, med autokrina, parakrina och endokrina effekter 3,4. Hos människor omfattar vit fettvävnad den subkutana fettvävnaden (SAT) och den viscerala fettvävnaden (VAT), med viktiga anatomiska, molekylära, cellulära och fysiologiska skillnader mellan dem 2,5. SAT representerar upp till 80 % av humant AT, medan moms ligger i bukhålan, främst i tarmkäxet och omentum, och är metabolisktmer aktiv. Dessutom är moms ett endokrint organ som utsöndrar mediatorer med en betydande inverkan på kroppsvikt, insulinkänslighet, lipidmetabolism och inflammation. Följaktligen leder momsackumulering till bukfetma och fetmarelaterade sjukdomar som typ 2-diabetes, metabolt syndrom, högt blodtryck och risk för hjärt- och kärlsjukdomar, vilket representerar en bättre prediktor för fetmarelaterad dödlighet 6,7,8,9.
Vid homeostatiska förhållanden samarbetar fettceller, makrofager och de andra immuncellerna för att upprätthålla momsmetabolismen genom utsöndring av antiinflammatoriska mediatorer10. En alltför stor momsexpansion främjar dock rekryteringen av aktiverade T-celler, NK-celler och makrofager. Faktum är att i mager moms är förhållandet mellan makrofagerna 5 %, medan detta förhållande stiger upp till 50 % vid fetma, med makrofagpolarisering från antiinflammatorisk till proinflammatorisk fenotyp, vilket genererar en kronisk inflammatorisk miljö10,11.
Som en konsekvens av fetmapandemin har ett häpnadsväckande antal rapporter uppstått som behandlar olika forskningsämnen, inklusive adipocytbiologi, epigenetik, inflammation, endokrina egenskaper och framväxande områden som extracellulära vesiklar, bland annat 8,10,12,13. Men även om momsmiljön definieras av överhörning mellan adipocyter och de bofasta eller anländande makrofagerna, har de flesta studier fokuserat på endast en cellpopulation, och det finns lite information om interaktionen mellan dessa celler i moms och deras patofysiologiska konsekvenser11,14. Dessutom utfördes värdefulla studier som behandlade samspelet mellan adipocyter och makrofager i AT med hjälp av cellinjer, som saknade in vivo-primingförhållandena 11,14,15. En lämplig strategi för att dissekera dessa cellers interaktion eller särskilda bidrag till mervärdesskatt kräver isolering av båda celltyperna från samma fettbiopsi för att utföra in vitro-analyser som så lika som möjligt återspeglar de in vivo-egenskaper som reglerar momsmetabolismen.
Även om de icke-enzymatiska dissociationsmetoderna baserade på mekaniska krafter för att bryta AT säkerställer minimal manipulation, kan dessa metoder inte användas om syftet är att studera SVF-celler, eftersom de har lägre effektivitet i cellåterhämtning och låg cellviabilitet jämfört med enzymatiska metoder, och en större vävnadsvolym behövs16,17. Enzymatisk nedbrytning med kollagenas är en skonsam metod som möjliggör adekvat nedbrytning av kollagen och extracellulära matrisproteiner i fibrösa vävnader såsom WAT18 och används ofta när trypsin är ineffektivt eller skadligt19. Protokollet ger grundläggande felsökningsriktlinjer för effektiv isolering av livskraftiga mogna adipocyter och SVF-celler från humana momsbiopsier i en enda process, med hjälp av en kollagenasenzymatisk nedbrytningsteknik, vilket ger information för att säkerställa höga utbyten (kvantitet, renhet och integritet) av totalt RNA från mogna adipocyter, inklusive mikroRNA, för nedströms uttrycksapplikationer. Samtidigt optimeras protokollet för att identifiera makrofagundergrupper från SVF-celler genom färgning av flera membranbundna markörer för vidare analys med flödescytometri20.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-02-C</td>
			<td>RNase, DNase free and nonpyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td>RNase, DNase free and nonpyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipettes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS4101-50EA</td>
			<td>Individually plastic wrapped</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L universal pipet tip</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>T-300-L-R</td>
			<td>RNase, DNase free and nonpyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L universal pipet tip</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>T-300-R-S</td>
			<td>RNase, DNase free and nonpyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L universal pipet tip</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>T-1000-B-R</td>
			<td>RNase, DNase free and nonpyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-200-C</td>
			<td>RNase, DNase free and nonpyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L universal pipet tip</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>T-200-Y-R</td>
			<td>RNase, DNase free and nonpyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2100 Bioanalyzer Instrument</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2101 Bioanalyzer PC</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2953CA</td>
			<td>2100 Expert Software pre-installed in PC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml Round Bottom Polystyrene Test Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352003&#160;</td>
			<td>Snap cap, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430828-100EA</td>
			<td>Polipropilene, conical bottom and sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid-guanidinium-phenol based reagent</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R2050-1-200</td>
			<td>TRI Reagent or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent RNA 6000 Nano Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1511</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent Small RNA Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1548</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC/Cy7 anti-human CD14 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>325620</td>
			<td>0.4 mg/106 cells, present on monocytes/macrophages, clone HCD14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baker</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>250 ml, non sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3912-100G</td>
			<td>Heat shock fraction, pH 5.2, &#8805;96%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chip priming station</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5065-9951</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type II</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17101-015</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270-100G</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Direct-zol RNA Miniprep</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R2051</td>
			<td>Supplied with 50 mL TRI reagen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting forceps</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Steel, serrated jaws and round ends</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection tray</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Stainless steel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023-500ML</td>
			<td>200&#160;proof, for molecular biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Flow Sheath Fluid</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>342003</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Lysing Solution</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>349202</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSAria III Flow Cytometer/Cell Sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>648282</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FASCDiva Software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>642868</td>
			<td>Software v6.0 pre-installed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z359629-1EA</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual cell counter</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo dissecting scisors</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Stainless steel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Adjustable temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND2000LAPTOP</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Adjustable temperature and speed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P10&#160;variable volume&#160;micropipette&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific-Finnpipette</td>
			<td>4642040</td>
			<td>1 to 10 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000&#160;variable volume&#160;micropipette&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific-Finnpipette</td>
			<td>4642090</td>
			<td>100 to 1000 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P2&#160;variable volume&#160;micropipette&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific-Finnpipette</td>
			<td>4642010</td>
			<td>0.2 to 2 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200&#160;variable volume&#160;micropipette&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific-Finnpipette</td>
			<td>4642080</td>
			<td>20 to 200 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tube storage rack</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>R96PCRFSP</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy5 anti-human HLA-DR Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>307608</td>
			<td>0.0625 mg/106 cells, present on macrophages, clone L243</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy7 anti-human CD45 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304016</td>
			<td>0.1 mg/106 cells, present on leukocytes, clone H130</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3813-10PAK</td>
			<td>Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette controller</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cells Lysis Buffer</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11 814 389 001</td>
			<td>For preferential lysis of red blood cells from human whole blood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Whit adapter for 50 mL conical tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Specimen container</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipette</td>
			<td>Thermo Scientific-Samco</td>
			<td>204-1S</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td>0.4% Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube racks</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>For different tube sizes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mini Shaker</td>
			<td>Cientifica SENNA</td>
			<td>BV101</td>
			<td>-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of viable adipocytes and stromal vascular fraction from human visceral adipose tissue suitable for rna analysis and macrophage phenotyping

Visceral fettvävnad (VAT) är ett aktivt metaboliskt organ som huvudsakligen består av mogna adipocyter och stromala vaskulära fraktionsceller (SVF), som frisätter olika bioaktiva molekyler som styr metaboliska, hormonella och immunprocesser; För närvarande är det oklart hur dessa processer regleras i fettväven. Därför är utvecklingen av metoder som utvärderar varje cellpopulations bidrag till fettvävnadens patofysiologi avgörande. Detta protokoll beskriver isoleringsstegen och ger nödvändiga felsökningsriktlinjer för effektiv isolering av livskraftiga mogna adipocyter och SVF från humana momsbiopsier i en enda process, med hjälp av en kollagenasenzymatisk matsmältningsteknik. Dessutom är protokollet också optimerat för att identifiera makrofagundergrupper och utföra mogen adipocyt-RNA-isolering för genuttrycksstudier, vilket gör det möjligt att utföra studier som dissekerar interaktionen mellan dessa cellpopulationer. Kortfattat tvättas momsbiopsier, mals mekaniskt och smälts för att generera en encellssuspension. Efter centrifugering isoleras mogna adipocyter genom flotation från SVF-pelleten. RNA-extraktionsprotokollet säkerställer ett högt utbyte av totalt RNA (inklusive miRNA) från adipocyter för nedströms uttrycksanalyser. Samtidigt används SVF-celler för att karakterisera makrofagundergrupper (pro- och antiinflammatorisk fenotyp) genom flödescytometrianalys.

Detta protokoll beskriver en enzymatisk metod som använder kollagenasnedbrytning följt av differentiell centrifugering för att i en enda process isolera livsdugliga mogna adipocyter och SVF-celler från momsbiopsier erhållna från friska gravida kvinnor efter partiell omentektomi. I det här fallet använder vi adipocyterna för RNA-extraktion och SVF för makrofagfenotypning.
RNA-extraktionsprotokollet gjorde det möjligt att erhålla RNA med tillräcklig renhet, hög integritet och mikro...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Viable Adipocytes and Stromal Vascular Fraction from Human Visceral Adipose Tissue Suitable for RNA Analysis and Macrophage Phenotyping at JoVE.c

Isolation of Viable Adipocytes and Stromal Vascular Fraction from Human Visceral Adipose Tissue Suitable for RNA Analysis and Macrophage Phenotyping

Detta protokoll ger en effektiv kollagenasnedbrytningsmetod för isolering av livskraftiga adipocyter och stromala vaskulära fraktions-SVF-celler från humant visceralt fett i en enda process, inklusive metodik för att erhålla högkvalitativt RNA från adipocyter och fenotypifiering av SVF-makrofager genom färgning av flera membranbundna markörer för analys med flödescytometri.

Isolering av livskraftiga adipocyter och stromal vaskulär fraktion från human visceral fettvävnad lämplig för RNA-analys och makrofagfenotypning

Visceral adipose tissue (VAT) is an active metabolic organ composed mainly of mature adipocytes and stromal vascular fraction (SVF) cells, which release ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Isolation of Human Islets from Partially Pancreatectomized Patients

Isolering av mänskliga Islets från Delvis Pancreatectomized Patienter

Investigations into the pathogenesis of type 2 diabetes and islets of Langerhans malfunction 1 have been hampered by the limited availability of type 2 ...

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts (CAFs) from Human Mammary Fibroblasts

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts CAFs from Human Mammary Fibroblasts

Experimentell generationens Cancer Associated-fibroblasts (CAFS) från Human bröst fibroblasts

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of ...

Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue

Isolering av kardiomyocetisk Kärnor från Post-mortem Tissue

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events ...

Encapsulation Thermogenic Preadipocytes for Transplantation into Adipose Tissue Depots

Inkapslings Thermogenic preadipocyter för transplantation till fettvävnad Depåer

Cell encapsulation was developed to entrap viable cells within semi-permeable membranes. The engrafted encapsulated cells can exchange low molecular ...

Isolation and Cellular Phenotyping of Mesenchymal Stem Cells Derived from Synovial Fluid and Bone Marrow of Minipigs

Isolering och Cellular fenotypning av mesenkymala stamceller från ledvätska och benmärgen hos minigrisar

Mesenchymal stem cells (MSCs) have been established after isolation from various tissue sources, including bone marrow and synovial fluid. Recently, ...

Stromal Vascular Fraction-enriched Fat Grafting for the Treatment of Symptomatic End-neuromata

Stromaceller vaskulär bråkdel-berikad fett ympning för behandling av symtomatisk slutet-neuromata

The purpose of this study was to methodically illustrate and highlight the crucial steps of stromal vascular fraction (SVF)-enriched fat grafting as a ...

Assessment of Human Adipose Tissue Microvascular Function Using Videomicroscopy

Bedömning av Human fettväv mikrovaskulära funktion med hjälp av Videomicroscopy

While obesity is closely linked to the development of metabolic and cardiovascular disease, little is known about mechanisms that govern these processes. ...

Isolation of Atrial Cardiomyocytes from a Rat Model of Metabolic Syndrome-related Heart Failure with Preserved Ejection Fraction

Isolering av förmaksflimmer hjärtmuskelcellerna från en råtta modell av metabola syndromet-relaterade hjärtsvikt med bevarad ejektionsfraktion

In this article, we describe an optimized, Langendorff-based procedure for the isolation of single-cell atrial cardiomyocytes (ACMs) from a rat model of ...

Clinical Protocol of Producing Adipose Tissue-Derived Stromal Vascular Fraction for Potential Cartilage Regeneration

Kliniska protokoll för att producera fettvävnad-Derived Stromal vaskulär bråkdel för potentiella brosk regenerering

Osteoarthritis (OA) is one of the most common debilitating disorders.&#160;Recently, numerous attempts have been made to improve the functions of the ...

Isolation of Adipose Derived Regenerative Cells for the Treatment of Erectile Dysfunction Following Radical Prostatectomy

Isolering av fetthärledda regenerativa celler för behandling av erektil dysfunktion efter radikal prostatektomi

Stem cells are used in many research areas within regenerative medicine in part because these treatments can be curative rather than symptomatic. Stem ...