Name: isolation of viable adipocytes and stromal vascular fraction from human visceral adipose tissue suitable for rna analysis and macrophage phenotyping
Uploaded: 2020-10-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Viable Adipocytes and Stromal Vascular Fraction from Human Visceral Adipose Tissue Suitable for RNA Analysis and Macrophage Phenotyping at JoVE.c

Bu çalışma Instituto Nacional de Perinatologia (hibe numaraları: 3300-11402-01-575-17 ve 212250-3210-21002-06-15) ve CONACyT, Fondo Sectorial de Investigacion en Salud y Seguridad Social (FOSISS) (hibe numarası 2015-3-2-61661) tarafından desteklenmiştir.

Bu protokol, Instituto Nacional de Perinatologia'nın IRB'si (212250-3210-21002-06-15) tarafından onaylanmıştır. Katılım gönüllülük esasına dayalıydı ve kayıtlı tüm kadınlar bilgilendirilmiş onam formunu imzaladı.
1. Viseral yağ dokusu toplanması
<ol><li>Doğum sancısı olmadan tekil gebelikleri olan sağlıklı yetişkin kadınlardan sezaryen sırasında kısmi omentektomi yoluyla KDV biyopsileri alın.</li>
	<li>Rahim kapanması ve hemostaz yapıldıktan sonra, daha b...

KDV, metabolik düzenleme ve inflamasyonda çok önemli bir rol oynar. Obezite ile ilişkili kronik inflamasyonda adipositlerin ve immün hücrelerin rolüne olan ilginin artması, AT'de bulunan SVF ve yağ hücrelerini ayırmak için farklı tekniklerin geliştirilmesine yol açmıştır. Bununla birlikte, çoğu teknik, adipositler ve SVF hücreleri arasındaki etkileşimlerle ilgili çalışmalar için çok önemli olabilecek tek bir prosedürde aynı KDV biyopsisinden aşağı akış uygulamaları için uygun olan bu...

Beyaz yağ dokusu sadece yağ hücrelerinden veya adipositlerden değil, aynı zamanda makrofajlardan, düzenleyici T hücreleri (Treg'ler) olarak diğer bağışıklık hücrelerinden ve eozinofillerden, preadipositlerden ve fibroblastlardan oluşan heterojen bir hücre popülasyonu içeren stromal vasküler fraksiyon (SVF) olarak bilinen yağsız bir hücre fraksiyonundan oluşurve vasküler ve bağ dokusu ile çevrilidir 1,2. Yağ dokusu (AT) artık otokrin, parakrin ve endokrin etkileri ile farklı hücreler tarafından üretilen ve dokuya salınan adipokinler, sitokinler ve mikroRNA'lar aracılığıyla metabolizma ve iltihaplanma ile ilgili fizyolojik süreçleri düzenleyen bir organ olarak kabul edilmektedir 3,4. İnsanlarda beyaz yağ dokusu, deri altı yağ dokusu (SAT) ve viseral yağ dokusunu (VAT) içerir ve aralarında önemli anatomik, moleküler, hücresel ve fizyolojik farklılıklar vardır 2,5. SAT, insan AT'sinin %80'ini temsil ederken, VAT karın boşluğunda, özellikle mezenter ve omentumda bulunur ve metabolik olarak daha aktiftir6. Ayrıca VAT, vücut ağırlığı, insülin duyarlılığı, lipid metabolizması ve inflamasyon üzerinde önemli etkisi olan aracıları salgılayan bir endokrin organdır. Sonuç olarak, KDV birikimi abdominal obeziteye ve tip-2 diyabet, metabolik sendrom, hipertansiyon ve kardiyovasküler hastalık riski gibi obezite ile ilişkili hastalıklara yol açar ve obezite ile ilişkili mortalitenin daha iyi bir yordayıcısını temsil eder 6,7,8,9.
Homeostatik koşullarda, adipositler, makrofajlar ve diğer bağışıklık hücreleri, anti-enflamatuar mediatörlerin salgılanması yoluyla KDV metabolizmasını sürdürmek için işbirliği yapar10. Bununla birlikte, aşırı KDV genişlemesi, aktive edilmiş T hücrelerinin, NK hücrelerinin ve makrofajların alımını teşvik eder. Nitekim yağsız KDV'de makrofajların oranı %5 iken, obezitede bu oran %50'ye kadar yükselmekte, makrofaj polarizasyonu ile anti-inflamatuardan pro-inflamatuar fenotipe doğru kronik inflamatuar bir ortam oluşturmaktadır10,11.
Obezite pandemisinin bir sonucu olarak, diğerlerinin yanı sıra adiposit biyolojisi, epigenetik, inflamasyon, endokrin özellikler ve hücre dışı veziküller olarak ortaya çıkan alanlar dahil olmak üzere farklı KDV araştırma konularını ele alan şaşırtıcı sayıda rapor ortaya çıkmıştır 8,10,12,13. Bununla birlikte, KDV ortamı, adipositler ile yerleşik veya gelen makrofajlar arasındaki karışma ile tanımlansa da, çoğu çalışma yalnızca bir hücre popülasyonuna odaklanmıştır ve bu hücrelerin KDV'deki etkileşimi ve patofizyolojik sonuçları hakkında çok az bilgi vardır11,14. Ayrıca, AT'de adiposit-makrofaj etkileşimini ele alan değerli çalışmalar, in vivo hazırlama koşullarından yoksun hücre hatları kullanılarak gerçekleştirilmiştir 11,14,15. Bu hücrelerin KDV'deki etkileşimini veya özel katkısını incelemek için uygun bir strateji, KDV metabolizmasını düzenleyen in vivo özellikleri mümkün olduğunca benzer şekilde yansıtan in vitro tahliller gerçekleştirmek için her iki hücre tipinin de aynı yağ biyopsisinden izole edilmesini gerektirir.
AT'yi kırmak için mekanik kuvvetlere dayanan enzimatik olmayan ayrışma yöntemleri minimum manipülasyon sağlasa da, enzimatik yöntemlere kıyasla hücre geri kazanımında daha düşük etkinliğe ve düşük hücre canlılığına sahip olduklarından ve daha büyük bir doku hacmine ihtiyaç duyulduğundan, amaç SVF hücrelerini incelemek ise bu yöntemler kullanılamaz16,17. Kollajenaz kullanılarak enzimatik sindirim, WAT18 gibi fibröz dokuların kollajen ve hücre dışı matriks proteinlerinin yeterli sindirimine izin veren nazik bir yöntemdir ve tripsin etkisiz veya zararlı olduğundasıklıkla kullanılır 19. Protokol, bir kollajenaz enzimatik sindirim tekniği kullanarak, insan KDV biyopsilerinden canlı olgun adipositlerin ve SVF hücrelerinin tek bir işlemde verimli bir şekilde izole edilmesi için temel sorun giderme yönergeleri sağlar ve aşağı akış ekspresyon uygulamaları için mikroRNA'lar da dahil olmak üzere olgun adipositlerden toplam RNA'nın yüksek verimini (miktar, saflık ve bütünlük) sağlamak için bilgi verir. Eşzamanlı olarak, protokol, akış sitometrisi20 ile daha fazla analiz için çoklu zara bağlı belirteçlerin boyanması yoluyla SVF hücrelerinden makrofaj alt kümelerini tanımlamak için optimize edilmiştir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-02-C</td>
			<td>RNase, DNase free and nonpyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td>RNase, DNase free and nonpyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipettes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS4101-50EA</td>
			<td>Individually plastic wrapped</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L universal pipet tip</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>T-300-L-R</td>
			<td>RNase, DNase free and nonpyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L universal pipet tip</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>T-300-R-S</td>
			<td>RNase, DNase free and nonpyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L universal pipet tip</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>T-1000-B-R</td>
			<td>RNase, DNase free and nonpyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-200-C</td>
			<td>RNase, DNase free and nonpyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L universal pipet tip</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>T-200-Y-R</td>
			<td>RNase, DNase free and nonpyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2100 Bioanalyzer Instrument</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2101 Bioanalyzer PC</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2953CA</td>
			<td>2100 Expert Software pre-installed in PC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml Round Bottom Polystyrene Test Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352003&#160;</td>
			<td>Snap cap, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430828-100EA</td>
			<td>Polipropilene, conical bottom and sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid-guanidinium-phenol based reagent</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R2050-1-200</td>
			<td>TRI Reagent or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent RNA 6000 Nano Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1511</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent Small RNA Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1548</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC/Cy7 anti-human CD14 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>325620</td>
			<td>0.4 mg/106 cells, present on monocytes/macrophages, clone HCD14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baker</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>250 ml, non sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3912-100G</td>
			<td>Heat shock fraction, pH 5.2, &#8805;96%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chip priming station</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5065-9951</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type II</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17101-015</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270-100G</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Direct-zol RNA Miniprep</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R2051</td>
			<td>Supplied with 50 mL TRI reagen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting forceps</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Steel, serrated jaws and round ends</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection tray</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Stainless steel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023-500ML</td>
			<td>200&#160;proof, for molecular biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Flow Sheath Fluid</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>342003</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Lysing Solution</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>349202</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSAria III Flow Cytometer/Cell Sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>648282</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FASCDiva Software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>642868</td>
			<td>Software v6.0 pre-installed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z359629-1EA</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual cell counter</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo dissecting scisors</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Stainless steel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Adjustable temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND2000LAPTOP</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Adjustable temperature and speed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P10&#160;variable volume&#160;micropipette&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific-Finnpipette</td>
			<td>4642040</td>
			<td>1 to 10 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000&#160;variable volume&#160;micropipette&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific-Finnpipette</td>
			<td>4642090</td>
			<td>100 to 1000 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P2&#160;variable volume&#160;micropipette&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific-Finnpipette</td>
			<td>4642010</td>
			<td>0.2 to 2 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200&#160;variable volume&#160;micropipette&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific-Finnpipette</td>
			<td>4642080</td>
			<td>20 to 200 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tube storage rack</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>R96PCRFSP</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy5 anti-human HLA-DR Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>307608</td>
			<td>0.0625 mg/106 cells, present on macrophages, clone L243</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy7 anti-human CD45 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304016</td>
			<td>0.1 mg/106 cells, present on leukocytes, clone H130</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3813-10PAK</td>
			<td>Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette controller</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cells Lysis Buffer</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11 814 389 001</td>
			<td>For preferential lysis of red blood cells from human whole blood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Whit adapter for 50 mL conical tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Specimen container</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipette</td>
			<td>Thermo Scientific-Samco</td>
			<td>204-1S</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td>0.4% Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube racks</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>For different tube sizes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mini Shaker</td>
			<td>Cientifica SENNA</td>
			<td>BV101</td>
			<td>-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of viable adipocytes and stromal vascular fraction from human visceral adipose tissue suitable for rna analysis and macrophage phenotyping

Viseral yağ dokusu (VAT), metabolik, hormonal ve immün süreçleri kontrol eden farklı biyoaktif molekülleri serbest bırakan, esas olarak olgun adipositler ve stromal vasküler fraksiyon (SVF) hücrelerinden oluşan aktif bir metabolik organdır; Şu anda, bu süreçlerin yağ dokusu içinde nasıl düzenlendiği belirsizdir. Bu nedenle, her hücre popülasyonunun yağ dokusunun patofizyolojisine katkısını değerlendiren yöntemlerin geliştirilmesi çok önemlidir. Bu protokol, izolasyon adımlarını açıklar ve bir kollajenaz enzimatik sindirim tekniği kullanılarak insan KDV biyopsilerinden canlı olgun adipositlerin ve SVF'nin tek bir işlemde verimli bir şekilde izole edilmesi için gerekli sorun giderme yönergelerini sağlar. Ayrıca, protokol ayrıca makrofaj alt kümelerini tanımlamak ve gen ekspresyonu çalışmaları için olgun adiposit RNA izolasyonu gerçekleştirmek için optimize edilmiştir, bu da bu hücre popülasyonları arasındaki etkileşimi inceleyen çalışmaların yapılmasına izin verir. Kısaca, KDV biyopsileri yıkanır, mekanik olarak kıyılır ve tek hücreli bir süspansiyon oluşturmak için sindirilir. Santrifüjlemeden sonra, olgun adipositler, SVF peletinden yüzdürme yoluyla izole edilir. RNA ekstraksiyon protokolü, aşağı akış ekspresyon deneyleri için adipositlerden yüksek miktarda toplam RNA (miRNA'lar dahil) verimi sağlar. Aynı zamanda, SVF hücreleri, akış sitometrisi analizi yoluyla makrofaj alt kümelerini (pro- ve anti-inflamatuar fenotip) karakterize etmek için kullanılır.

Bu protokol, parsiyel omentektomi sonrası sağlıklı gebe kadınlardan elde edilen KDV biyopsilerinden canlı olgun adipositleri ve SVF hücrelerini tek bir işlemde izole etmek için kollajenaz sindirimi ve ardından diferansiyel santrifüjleme kullanan enzimatik bir yöntemi açıklar. Bu durumda, RNA ekstraksiyonu için adipositleri ve makrofaj fenotiplemesi için SVF'yi kullanıyoruz.
RNA ekstraksiyon protokolü, yeterli saflıkta, yüksek bütünlükte RNA ve olgun adipositlerden mikroR...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Viable Adipocytes and Stromal Vascular Fraction from Human Visceral Adipose Tissue Suitable for RNA Analysis and Macrophage Phenotyping at JoVE.c

Isolation of Viable Adipocytes and Stromal Vascular Fraction from Human Visceral Adipose Tissue Suitable for RNA Analysis and Macrophage Phenotyping

Bu protokol, adipositlerden yüksek kaliteli RNA elde etme metodolojisi ve akış sitometrisi ile analiz için çoklu membrana bağlı belirteçlerin boyanması yoluyla SVF-makrofajların fenotipleştirilmesi dahil olmak üzere, canlı adipositlerin ve stromal vasküler fraksiyon-SVF hücrelerinin insan viseral yağından tek bir işlemde izolasyonu için etkili bir kollajenaz sindirim yöntemi sağlar.

İnsan Viseral Yağ Dokusundan Canlı Adiposit ve Stromal Vasküler Fraksiyonun RNA Analizi ve Makrofaj Fenotiplemesine Uygun İzolasyonu

Visceral adipose tissue (VAT) is an active metabolic organ composed mainly of mature adipocytes and stromal vascular fraction (SVF) cells, which release ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Isolation of Human Islets from Partially Pancreatectomized Patients

Kısmen Pancreatectomized hastalar İnsan Islets izolasyonu

Investigations into the pathogenesis of type 2 diabetes and islets of Langerhans malfunction 1 have been hampered by the limited availability of type 2 ...

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts (CAFs) from Human Mammary Fibroblasts

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts CAFs from Human Mammary Fibroblasts

İnsan Meme Fibroblastlar Karsinom İlişkili Fibroblastlar Deneysel Nesil (CAFs)

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of ...

Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue

Post-mortem Doku gelen kardiyomiyosit Çekirdeklerin İzolasyonu

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events ...

Encapsulation Thermogenic Preadipocytes for Transplantation into Adipose Tissue Depots

Yağ Dokusu Depolarında içine Nakli Enkapsülasyon termojenik Preadipositler

Cell encapsulation was developed to entrap viable cells within semi-permeable membranes. The engrafted encapsulated cells can exchange low molecular ...

Isolation and Cellular Phenotyping of Mesenchymal Stem Cells Derived from Synovial Fluid and Bone Marrow of Minipigs

Mini-domuzlarda sinovyal sıvı ve Kemik İliği Elde Edilen Mezenkimal Kök Hücrelerin İzolasyonu ve Hücresel Fenotiplendirme

Mesenchymal stem cells (MSCs) have been established after isolation from various tissue sources, including bone marrow and synovial fluid. Recently, ...

Stromal Vascular Fraction-enriched Fat Grafting for the Treatment of Symptomatic End-neuromata

Stromal vasküler kesir zenginleştirilmiş şişman semptomatik sonu-neuromata tedavisi için aşılama

The purpose of this study was to methodically illustrate and highlight the crucial steps of stromal vascular fraction (SVF)-enriched fat grafting as a ...

Assessment of Human Adipose Tissue Microvascular Function Using Videomicroscopy

İnsan yağ dokusu mikrovasküler işlevini kullanarak Videomicroscopy değerlendirilmesi

While obesity is closely linked to the development of metabolic and cardiovascular disease, little is known about mechanisms that govern these processes. ...

Isolation of Atrial Cardiomyocytes from a Rat Model of Metabolic Syndrome-related Heart Failure with Preserved Ejection Fraction

Bir fare modeli Metabolik sendromu ile ilgili kalp yetmezliği ile korunmuş ejeksiyon fraksiyonu atriyal Cardiomyocytes izolasyonu

In this article, we describe an optimized, Langendorff-based procedure for the isolation of single-cell atrial cardiomyocytes (ACMs) from a rat model of ...

Clinical Protocol of Producing Adipose Tissue-Derived Stromal Vascular Fraction for Potential Cartilage Regeneration

Yağ dokusundan elde edilen Stromal vasküler kesir için potansiyel kıkırdak rejenerasyon üreten klinik protokol

Osteoarthritis (OA) is one of the most common debilitating disorders.&#160;Recently, numerous attempts have been made to improve the functions of the ...

Isolation of Adipose Derived Regenerative Cells for the Treatment of Erectile Dysfunction Following Radical Prostatectomy

Radikal Prostatektomi Sonrası Erektil Disfonksiyon Tedavisinde Yağ Kaynaklı Rejeneratif Hücrelerin İzolasyonu

Stem cells are used in many research areas within regenerative medicine in part because these treatments can be curative rather than symptomatic. Stem ...