Name: pupal and adult injections for rnai and crispr gene editing in nasonia vitripennis
Uploaded: 2020-12-04T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis at JoVE.com

وقد تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل صناديق بدء UCSD الموجهة إلى O.S.A. ومنحة NSF/BIO 1645331 إلى J.L.R.

1. تربية ناسونيا
<ol><li>إعداد ~ 20 الإناث تزاوج بشكل فريد في أنابيب اختبار الزجاج الصغيرة موصولة بالقطن. ملاحظة: لتقليل مساحة التنشئة، تعد أنابيب 4 مل مثالية 10 × 85 سم. تتميز الإناث بسهولة عن الذكور بسبب الأجنحة الكبيرة ووجود ovipositor(الشكل 1A). ويمكن أيضا أن توجد بروتوكولات مفصلة ل...

<ol>
	<li>Verhulst, E. C., Beukeboom, L. W., van de Zande, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+control+of+haplodiploid+sex+determination+in+the+wasp+Nasonia.">Maternal control of haplodiploid sex determination in the wasp Nasonia.</a> Science. 328 (5978), 620-623 (2010).</li><li>Verhulst, E. C., Lynch, J. A., Bopp, D., Beukeboom, L. W., van de Zande, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+component+of+the+Nasonia+sex+determining+cascade+is+maternally+silenced+and+regulates+transformer+expression.">A new component of the Nasonia sex determining cascade is maternally silenced and regulates transformer expression.</a> PloS One. 8 (5), 63618 (2013).</li><li>Dalla Benetta, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+elimination+mediated+by+gene+expression+from+a+selfish+chromosome.">Genome elimination mediated by gene expression from a selfish chromosome.</a> Science Advances. 6 (14), (2020).</li><li>Aldrich, J. C., Leibholz, A., Cheema, M. S., Ausi&#972;, J., Ferree, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+"selfish"+B+chromosome+induces+genome+elimination+by+disrupting+the+histone+code+in+the+jewel+wasp+Nasonia+vitripennis.">A "selfish" B chromosome induces genome elimination by disrupting the histone code in the jewel wasp Nasonia vitripennis.</a> Scientific Reports. 7, 42551 (2017).</li><li>Ferree, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+genes+uniquely+expressed+in+the+germ-line+tissues+of+the+jewel+wasp+Nasonnia+vitripennis.">Identification of genes uniquely expressed in the germ-line tissues of the jewel wasp Nasonnia vitripennis.</a> G3. 3 (12), 2647-2653 (2015).</li><li>Akbari, O. S., Antoshechkin, I., Hay, B. A., Ferree, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+profiling+of+Nasonia+vitripennis+testis+reveals+novel+transcripts+expressed+from+the+selfish+B+chromosome,+paternal+sex+ratio.">Transcriptome profiling of Nasonia vitripennis testis reveals novel transcripts expressed from the selfish B chromosome, paternal sex ratio.</a> G3. 3 (9), 1597-1605 (2013).</li><li>Dalla Benetta, E., Beukeboom, L. W., van de Zande, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+differences+in+circadian+clock+gene+expression+patterns+and+photoperiodic+diapause+induction+in+Nasonia+vitripennis.">Adaptive differences in circadian clock gene expression patterns and photoperiodic diapause induction in Nasonia vitripennis.</a> The American Naturalist. 193 (6), 881-896 (2019).</li><li>Paolucci, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Latitudinal+variation+in+circadian+rhythmicity+in+Nasonia+vitripennis.">Latitudinal variation in circadian rhythmicity in Nasonia vitripennis.</a> Behavioral Sciences. 9 (11), (2019).</li><li>Werren, J. H., Loehlin, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+parasitoid+wasp+Nasonia:+an+emerging+model+system+with+haploid+male+genetics.">The parasitoid wasp Nasonia: an emerging model system with haploid male genetics.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (10), (2009).</li><li>Lynch, J. A., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+parental+RNA+interference+in+the+wasp+Nasonia+vitripennis.">A method for parental RNA interference in the wasp Nasonia vitripennis.</a> Nature Protocols. 1 (1), 486-494 (2006).</li><li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+heritable+germline+mutations+in+the+jewel+wasp+Nasonia+vitripennis+using+CRISPR/Cas9.">Generation of heritable germline mutations in the jewel wasp Nasonia vitripennis using CRISPR/Cas9.</a> Scientific Reports. 7 (1), 901 (2017).</li><li>Chaverra-Rodriguez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+mutagenesis+of+Nasonia+vitripennis+through+ovarian+delivery+of+CRISPR-Cas9+ribonucleoprotein.">Germline mutagenesis of Nasonia vitripennis through ovarian delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein.</a> Insect Molecular Biology. , (2020).</li><li>Li, M., Bui, M., Akbari, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryo+microinjection+and+transplantation+technique+for+Nasonia+vitripennis+genome+manipulation.">Embryo microinjection and transplantation technique for Nasonia vitripennis genome manipulation.</a> Journal of Visualized Experiments. (130), (2017).</li><li>Werren, J. H., Loehlin, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rearing+Sarcophaga+bullata+fly+hosts+for+Nasonia+(Parasitoid+Wasp).">Rearing Sarcophaga bullata fly hosts for Nasonia (Parasitoid Wasp).</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (10), (2009).</li><li>Werren, J. H., Loehlin, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain+maintenance+of+Nasonia+vitripennis+(Parasitoid+Wasp).">Strain maintenance of Nasonia vitripennis (Parasitoid Wasp).</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (10), (2009).</li><li>Beukeboom, L. W., van de Zande, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+sex+determination+in+the+haplodiploid+wasp+Nasonia+vitripennis+(Hymenoptera:+Chalcidoidea).">Genetics of sex determination in the haplodiploid wasp Nasonia vitripennis (Hymenoptera: Chalcidoidea).</a> Journal of Genetics. 89 (3), 333-339 (2010).</li><li>Leung, K., van de Zande, L., Beukeboom, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life-history+traits+of+the+Whiting+polyploid+line+of+the+parasitoid.">Life-history traits of the Whiting polyploid line of the parasitoid.</a> Entomologia experimentalis et applicata. 167 (7), 655-669 (2019).</li><li>Kennerdell, J. R., Carthew, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+dsRNA-mediated+genetic+interference+to+demonstrate+that+frizzled+and+frizzled+2+act+in+the+wingless+pathway.">Use of dsRNA-mediated genetic interference to demonstrate that frizzled and frizzled 2 act in the wingless pathway.</a> Cell. 95 (7), 1017-1026 (1998).</li><li>Yang, J., Zhao-jun, H. A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiency+of+different+methods+for+dsrna+delivery+in+cotton+bollworm+(Helicoverpa+armigera).">Efficiency of different methods for dsrna delivery in cotton bollworm (Helicoverpa armigera).</a> Journal of Integrative Agriculture. 13 (1), 115-123 (2014).</li><li>Brown, S., Holtzman, S., Kaufman, T., Denell, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+Tribolium+Deformed+ortholog+and+its+ability+to+directly+regulate+Deformed+target+genes+in+the+rescue+of+a+Drosophila+Deformed+null+mutant.">Characterization of the Tribolium Deformed ortholog and its ability to directly regulate Deformed target genes in the rescue of a Drosophila Deformed null mutant.</a> Development Genes and Evolution. 209 (7), 389-398 (1999).</li><li>Hughes, C. L., Kaufman, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+analysis+of+Deformed,+proboscipedia+and+Sex+combs+reduced+in+the+milkweed+bug+Oncopeltus+fasciatus:+novel+roles+for+Hox+genes+in+the+hemipteran+head.">RNAi analysis of Deformed, proboscipedia and Sex combs reduced in the milkweed bug Oncopeltus fasciatus: novel roles for Hox genes in the hemipteran head.</a> Development. 127 (17), 3683-3694 (2000).</li><li>Dzitoyeva, S., Dimitrijevic, N., Manev, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-abdominal+injection+of+double-stranded+RNA+into+anesthetized+adult+Drosophila+triggers+RNA+interference+in+the+central+nervous+system.">Intra-abdominal injection of double-stranded RNA into anesthetized adult Drosophila triggers RNA interference in the central nervous system.</a> Molecular Psychiatry. 6 (6), 665-670 (2001).</li><li>Chaverra-Rodriguez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+delivery+of+CRISPR-Cas9+ribonucleoprotein+into+arthropod+ovaries+for+heritable+germline+gene+editing.">Targeted delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein into arthropod ovaries for heritable germline gene editing.</a> Nature Communications. 9 (1), 3008 (2018).</li><li>Macias, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas9-mediated+gene-editing+in+the+malaria+mosquito+anopheles+stephensi+by+ReMOT+control.">Cas9-mediated gene-editing in the malaria mosquito anopheles stephensi by ReMOT control.</a> G3. 10 (4), 1353-1360 (2020).</li><li>Heu, C. C., McCullough, F. M., Luan, J., Rasgon, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-based+genome+editing+in+the+silverleaf+whitefly+(Bemisia+tabaci).">CRISPR/Cas9-based genome editing in the silverleaf whitefly (Bemisia tabaci).</a> CRISPR Journal. 3 (2), 89-96 (2020).</li><li>Shirai, Y., Daimon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+cardinal+are+responsible+for+the+red-1+and+peach+eye+color+mutants+of+the+red+flour+beetle+Tribolium+castaneum.">Mutations in cardinal are responsible for the red-1 and peach eye color mutants of the red flour beetle Tribolium castaneum.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 529 (2), 372-378 (2020).</li><li>Hunter, W. B., Gonzalez, M. T., Tomich, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAPC-assisted+CRISPR/Cas9+system:+targeted+delivery+into+adult+ovaries+for+heritable+germline+gene+editing+(Arthropoda:+Hemiptera).">BAPC-assisted CRISPR/Cas9 system: targeted delivery into adult ovaries for heritable germline gene editing (Arthropoda: Hemiptera).</a> bioRxiv. , 478743 (2018).</li><li>Chaverra Rodriguez, D., Bui, M., Li, M., Raban, R., Akbari, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+genetic+tools+to+control+ACP.">Developing genetic tools to control ACP.</a> Citrus Research Board Citrograph Magazine. 11 (1), 64-68 (2020).</li></ol>

مع الاستخدام المتزايد مؤخرا من nasonia vitripennis ككائن حي نموذجي لمختلف الأسئلة البيولوجية2،3،7،17، هناك حاجة لتطوير وتحسين أساليب الحقن لتمكين بروتوكول مبسط وفعال للتحليل الوظيفي لجينات N. vitripennis. الأساليب الحالية ا...

CRISPR/Cas9 تحرير الجينات هي تقنية قوية للدراسات الوراثية الوظيفية، وخاصة في العديد من الكائنات الحية نموذج ارتفاع مثل دبور جوهرة، Nasonia vitripennis. سهولة تربية وتوافر الجينوم الكامل يجعل دبور جوهرة نظام تجريبي مهم لتوضيح الآليات الجزيئية للعمليات البيولوجية المختلفة. على سبيل المثال، N. vitripennis وقد استخدمت مؤخرا لكشف الأساس اللاجيني لنظام تحديد الجنس haplodiploid1،2، وبيولوجيا الكروموسومات B3،4،5،6، والأساس الوراثي للتنظيم circadian والموسمية7،8. بعض الميزات التي تجعل N. vitripennis قابلة للعمل مع تشمل وقت الجيل القصير (~ 2 أسابيع عند 25 درجة مئوية)، وارتفاع معدلات الإنجاب، وسهولة فصل الجنس في مرحلة pupal، والقدرة على diapause وتخزين سلالات في 4 درجة مئوية. تبدأ دورة الحياة مع الدبابير الإناث تطفل الخوادر من الذبابة ، بولاتا التابوت. من خلال ovipositor بهم ، تضع الإناث ما يصل إلى 50 بيضة في حالة الجراء من الذبابة. البيض تتطور إلى اليرقات التي تتغذى على الجراء S. بولاتا، تستمر في التطور على مدى الأيام القليلة المقبلة، ومن ثم pupate، تليها eclosion الكبار والظهور من puparium المضيف9.
الأدوات الجزيئية لإجراء الدراسات الجينية الوظيفية في N. vitripennis, مثل تدخل الحمض النووي الريبي (RNAAi)10 و CRISPR/Cas911,12, متوفرة, ولكنها محدودة, ويرجع ذلك في المقام الأول إلى صعوبات في إجراء الميكروبيكشنات الجنينية13. كما N. vitripennis البيض تتطلب مضيف الجرو للتنمية، والتلاعب البيض هو صعب للغاية. يجب جمع الأجنة مرحلة ما قبل blastoderm من الخوادر blowfly المضيف، وميكرونجيكت بسرعة، ونقلها على الفور مرة أخرى إلى المضيف للتنمية13. تتطلب هذه الخطوات الدقة والتدريب المتخصص لتجنب إتلاف الأجنة المجهرية أو يستضيف الجرو13. وعلاوة على ذلك ، فإن البيض صغير جدا وهش ، خاصة بعد الاحتراط الدقيق ، مع السيتوبلازم اللزج جدا مما يسبب انسداد مستمر لإبرة الحقن13. هذه الميزات تجعل الاختبارات الدقيقة الجنينية صعبة بشكل استثنائي ، مما يتطلب مشغلين مدربين تدريبا عاليا ومعدات متخصصة غائبة في معظم مختبرات N. vitripennis.
ومن شأن تحسين أساليب الحقن البديلة لتوصيل الكواشف CRISPR أن يسهم في توطيد N. vitripennis ككائن حي نموذجي. التلاعب من الخوخ والبالغين هو أقل تحديا من التلاعب الأجنة ويمكن تحقيقه مع الإعداد حقن الأساسية. هنا، يتم وصف بروتوكولين لحقن الخوادر والبالغين: واحد ينطوي على معدات متخصصة للحقن، والآخر ينطوي على استخدام تجميع أنبوب التنفس مزودة إبرة شعرية زجاجية. استخدام أنبوب التنفس مناسب بشكل خاص للمختبرات التي لا يمكنها الوصول إلى المعدات المتخصصة للأنابيب الدقيقة للجنين. يتم إظهار الحقن الفعالة لمراحل النمو المختلفة من N. vitripennis، بما في ذلك الخوخ الأبيض أو الأسود والدبابير البالغة. الدبابير في مرحلة الجرو الأبيض مناسبة بشكل خاص لتجارب الضربة القاضية بوساطة RNAi. على الرغم من أن RNAi في ناسونيا وصفت لأول مرة من قبل لينش وديسبلان في 200610, لا يوجد إجراء بصري متاح لكيفية إجراء حقن RNAi. وقد استخدمت مؤخرا RNAi لاكتشاف الجين haploidizer من B-كروموسوم PSR(نسبة الجنس الأبوي) 3 ودراسة مشاركة الجين على مدار الساعة, الفترة, في N. vitripennis الإيقاعات البيولوجية7.
يمكن استخدام الخوادر السوداء والدبابير البالغة للحث على تحرير الجينات الجرثومية CRISPR/Cas9 باستخدام ReMOT Control (تحويل المبيض بوساطة المستقبلات للشحن) وبروتوكولات BAPC (كبسولات الببتيد الأمفيفيلية المتفرعة). وقد وصفت هذه الطرق تسليم المبيض اثنين مؤخرا لتكون فعالة في ناسونيا لتوليد الطفرات الجرثومية في الجين المستهدف, cinnabar7,12. هنا ، يتم توفير بروتوكول مبسط للحقن بما في ذلك إجراء بصري لمنهجية خطوة بخطوة لكل من الحقن الجروية وحقن البالغين التي يمكن استخدامها لتوليد دراسات علم الوراثة الوظيفية في Nasonia وعلى الأرجح في الدبابير الطفيليات الأخرى ، دون الحاجة إلى معدات متخصصة وتجاوز التجميل الجنيني الدقيق.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 x 15 mm Stackable Petri Dishes, Polystyrene, Mono, Sterile</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>960-97693-083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminosilicate glass capillary tubing 1 mm(outside diameter) x 0.58 mm (inner diameter)</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>BF100-58-10</td>
			<td>Can also use Borosilicate or Quartz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5177-5EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BAPC</td>
			<td>phoreus biotech</td>
			<td>BAPtofect-25 0.5 mg Kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cas9 Protein with NLS</td>
			<td>PNABio</td>
			<td>CP01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting needle</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10806-330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase/RNase-Free distilled Water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Femtojet Express programmable microinjector</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Femtotips Microloader tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>E5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine-tip paintbrush</td>
			<td>ZEM</td>
			<td>2595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flesh fly pupae,&#160;Sarcophaga bullata</td>
			<td>Ward&#39;s Science</td>
			<td>470180-392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Food colorant dye</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Test Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>982010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glue</td>
			<td>Elmer&#39;s</td>
			<td></td>
			<td>washable, no toxic school glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-1000 or P-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-550-A3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ51</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pupal and adult injections for rnai and crispr gene editing in nasonia vitripennis

دبور جوهرة، Nasonia vitripennis،أصبح نظام نموذج فعال لدراسة علم الوراثة اللاجينية لتحديد الجنس haplo-diploid، بيولوجيا كروموسوم B، التفاعلات المضيفة- symbiont، speciation، وتوليف السم. على الرغم من توافر العديد من الأدوات الجزيئية، بما في ذلك CRISPR/Cas9، لا تزال الدراسات الوراثية الوظيفية محدودة في هذا الكائن الحي. وينبع القيد الرئيسي لتطبيق تكنولوجيا CRISPR/Cas9 في N. vitripennis من تحديات الميكروبيكشن الجنيني. حقن الأجنة صعبة بشكل خاص في هذا الكائن الحي وبشكل عام في العديد من الدبابير الطفيليات ، بسبب صغر حجم الجنين ومتطلبات جروة مضيفة للتطور الجنيني. ولمعالجة هذه التحديات، تم تحسين الولادة المعقدة للريبونوكليوبروتين Cas9 إلى المبيضين الإناث عن طريق حقن البالغين، بدلا من الحقن المجهري الجنيني، مما أدى إلى تعديلات جرثومية جسدية وقابلة للتكرار. تم تحسين إجراءات الحقن في الخوادر والدبابير الأنثوية باستخدام إما التحكم في ReMOT (تحويل المبيض بوساطة المستقبلات للشحن) أو BAPC (كبسولات الببتيد الأمفيفيلية المتفرعة). وتبين أن هذه الأساليب بدائل فعالة لحقن الأجنة، مما يتيح حدوث طفرات جرثومية محددة الموقع وقابلة للتكسيت.

تقدم هذه الورقة طريقتين سهلتين للتشخيص المجهري للجرو والكبار ، إما باستخدام femtojet أو أنبوب أسبيراتور. الطريقة الأولى تسمح بحقن أكثر دقة من السائل، وهو أمر مهم لاتساق RNAi، في حين أن الطريقة الثانية تسمح بحقن كميات أكبر من السائل في الجراء Nasonia أو البالغين.
<p class="jove_conte...

Watch this Scientific Journal Video about Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis at JoVE.com

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

هنا، ونحن نصف أساليب لحقن الجرو والكبار كفاءة في Nasonia vitripennis كبدائل يمكن الوصول إليها للتحنيم الدقيق الجنين، وتمكين التحليل الوظيفي للجينات ذات الأهمية باستخدام إما الحمض النووي الريبي إسكات عن طريق تدخل الحمض النووي الريبي (RNAAi) أو خروج المغلوب الجينات عن طريق CRISPR / Cas9 تحرير الجينوم.

حقن الجرو والكبار لRNAi و CRISPR تحرير الجينات في Nasonia vitripennis

The jewel wasp, Nasonia vitripennis, has become an efficient model system to study epigenetics of haplo-diploid sex determination, B-chromosome biology, ...

Research on non-canonical insect model, like parasitoid wasp, is limited because embryonic microinjection is very challenging. Our method bypasses this problem, enabling site-specific and heritable germline mutations. Injecting pupae or adult females is fast and removes the requirement for expensive equipment or specialized training required to achieve successful embryonic microinjections.This technique will allow no specialized labs that do not have access to expensive equipment to do functional studies in any insect species they are using as a model. After the optimization, this method can be used to study functional genetics of many other genes in Nasonia. We also think this method may be used to deliver nucleic acids for genetic transformation of Nasonia or other insects.Begin by setting up approximately 20 mated females singularly in small glass test tubes plugged with cotton. Add two S.bullata hosts per tube and maintain the wasps at 25 degrees Celsius and 30%relative humidity with a 12:12 light dark cycle for two to three days. After two to three days, gently remove the females using a fine tipped brush to avoid continuous over position and a synchrony in offspring development.Removed females can optionally be re-hosted or stored at five degrees Celsius for up to a month. Maintain the parasitized host at 25 degrees Celsius and 30%relative humidity with a 12:12 light dark cycle for seven days if the desired injection stage requires white pupae, for 13 days, if the required developmental stage is black pupae, or 14 days for young, newly emerged adults. When the desired stage is reached, crack open the host puparium with a dissecting needle to recover N.vitripennis pupae and adults.Prepare a glass slide by applying a line of school glue at the center. Spread the glue with the dissecting needle to obtain a thick layer, which will be used to align the pupae. Let the glue dry for approximately two minutes before transferring the pupae.Under a dissecting microscope, use a dissecting needle to apply glue on the back of the head of the pupa. Attach the pupa to the glue layer on the slide with its abdomen facing up. Align 20 to 30 pupae side-by-side on the slide.Place the slide with the pupae and a Petri dish to let the glue drive for approximately 10 minutes. Before starting the injections, test the adherence of the pupae to the glue by pushing them gently with the dissecting needle. If most of the pupae are loosened, prepare a new slide.Alternatively, remove all loose pupae and proceed to inject those that are properly attached to the slide. Load one capillary glass tube into a needle puller and pull needles following the manufacturer's instructions. Load the needle with five microliters of the prepared injection mixture using microloader pipette tips.Open the needle, sliding the tip on a surface made from two overlapping slides. Alternatively, open the tip of the needle with a pair of fine forceps to create a sharp edge. Place the slide with the aligned pupae under a dissecting microscope, then insert the needle into the femtojet's injection tube and tighten the grip head.Looking at the needle under the microscope, turn on the femtojet and set the compensation pressure and injection pressure parameters by rotating the rotary knobs. Carefully insert the needle between the second and third visible abdominal segments with a vertical angle of about 30 degrees. Inject with a continuous flow until the whole abdomen turns green in the case of white stage pupae or until the abdomen increases in size in the case of black pupae.Stop injecting when it is clear that the abdomen cannot take any more liquid or when the liquid starts flowing out of the body. Move carefully to the next pupa and repeat these steps. Transfer the slide with the injected pupae to a Petri dish.Cover the dish with its lid and place it at 25 degrees Celsius until wasp emergence. For adult preparation, separate groups of 20 virgin females in a clean small test tube with a fine paint brush. Place a glass slide on top of ice and align the female side by side on the cold slide with abdomens facing up under a dissecting scope.Load one needle with the ribonucleoprotein solution using a microloading tip and insert the needle into the connector pack of the aspirator tube assembly. Support the females from the opposite side with blunted dissecting needles, while injecting slowly into the abdomen. Avoid touching the ovipositor.This will severely damage this critical reproductive structure. Carefully insert the needle between the second and third visible abdominal segments with a vertical angle of about 30 degrees. Inject the solution into the female abdomen, stopping when no more liquid can enter or when leaking of surplus solution is observed.Move carefully to the next female and repeat these steps. When finished, gently transfer a single injected females to a new tube with one host using a paintbrush. Leave them to recover at room temperature for approximately one hour, confirm survival, and return the tubes to the rearing incubator.After adult eclosion from the injected pupae, place single wasps into a glass to plugged with cotton and insert one S.bullata host. For CRISPR/Cas9 knockout experiments, allow females to parasitize the host for one day and replace the host each day for three consecutive days. Place the parasitized host, set 25 degrees Celsius until emergence of the G0 male offspring, approximately 13 to 14 days.Under a dissecting microscope, screen G0 males for the mutated phenotypes. The cinnabar gene is responsible for eye pigmentation. Wasps with brown eyes are wild-type and wasps with bright red eyes or variations between red and brown eyes are mutants.This protocol can be used for either pupal or adult microinjection. Survival rates of this procedure range from 15 to 100%The efficiency of achieving the desired phenotype via RNAi or CRISPR without requiring laborious egg injections is shown here. When injecting pupae or adult females, the needle should be sharp and be introduced in a way that liquid should not leak immediately after injecting.If this happens, remove the needle, ensure that the tip is fine and sharp, change it if necessary or inject in a different location. Function analysis can be performed on the gene of interest targeted from this procedure. This will answer a question about the gene function and if the gene is necessary for the specific phenotype studied.

Research

JoVE Journal

Biology

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes (A. gambiae)

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes A. gambiae

بروتوكول للفحوصات رني في البعوض الكبار (A. الغامبية)

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video ...

Localized RNAi and Ectopic Gene Expression in the Medicinal Leech

رني المترجمة خارج الرحم والتعبير الجيني في المستنزف الطبية

In this video, we show the use of a pneumatic capillary gun for the accurate biolistic delivery of reagents into live tissue. We use the procedure to ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

البارافين ، جزءا لا يتجزأ من والمجمدة أقسام ذبابة الفاكهة</emالعضلات الكبار>

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

وساطة رني ضربة قاضية بواسطة الجينات وTransgenesis Microinjection في نيماتودا Necromenic Pristionchus pacificus</em

Although it is increasingly affordable for emerging model organisms to obtain completely sequenced genomes, further in-depth gene function and expression ...

RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

رني ضربة قاضية بوساطة الجينات و<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; فحص إدرار البول في الإناث البالغات<em&gt; الزاعجة المصرية</em&gt; البعوض

This video protocol demonstrates an effective technique to knockdown a particular gene in an insect and conduct a novel bioassay to measure excretion ...

In Vivo SiRNA Transfection and Gene Knockdown in Spinal Cord via Rapid Noninvasive Lumbar Intrathecal Injections in Mice

In Vivo SiRNA Transfection and Gene Knockdown in Spinal Cord via Rapid Noninvasive Lumbar Intrathecal Injections in Mice

في فيفو سيرنا ترنسفكأيشن والجينات ضربة قاضية في الحبل الشوكي عن طريق السريع موسع قطني داخل القراب الحقن في الفئران

This report describes a step-by-step guide to the technique of acute intrathecal needle injections in a noninvasive manner, i.e. independent of catheter ...

Intravenous Injections in Neonatal Mice

الحقن في الوريد في الفئران حديثي الولادة

Intravenous injection is a clinically applicable manner to deliver therapeutics. For adult rodents and larger animals, intravenous injections are ...

Silencing the Spark: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish

إسكات شراره: CRISPR/كاس 9 الجينوم التحرير في الأسماك الكهربائية ضعيف

Electroreception and electrogenesis have changed in the evolutionary history of vertebrates. There is a striking degree of convergence in these ...

Nuclei Isolation from Adult Mouse Kidney for Single-Nucleus RNA-Sequencing

عزل النوى من كلية الفأر البالغة لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النواة

The kidneys regulate diverse biological processes such as water, electrolyte, and acid-base homeostasis. Physiological functions of the kidney are ...

Dissecting, Fixing, and Visualizing the Drosophila Pupal Notum

Dissecting, Fixing, and Visualizing the Drosophila Pupal Notum

تشريح وإصلاح وتصور ذبابة الفاكهة العذراء Notum

The pupae of Drosophila melanogaster are immobile for several days during metamorphosis, during which they develop a new body with a thin transparent ...