Name: pupal and adult injections for rnai and crispr gene editing in nasonia vitripennis
Uploaded: 2020-12-04T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis at JoVE.com

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי קרנות סטארט-אפ UCSD המופנות למענק O.S.A. ו- NSF / BIO 1645331 לג'יי.אל.אר.

1. גידול נסוניה
<ol><li>הגדר ~ 20 נקבות מזווגות באופן ייחודי במבחנות זכוכית קטנות המחוברות מכותנה. הערה: כדי להפחית את שטח גידול, 10 x 85 ס"מ, 4 צינורות מ"ל הם אופטימליים. הנקבות נבדלות בקלות מהזכרים בגלל הכנפיים הגדולות יותר ונוכחותו של הביוביפוסטור(איור 1A). פרוטוקולים מפורטים לגי...

<ol>
	<li>Verhulst, E. C., Beukeboom, L. W., van de Zande, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+control+of+haplodiploid+sex+determination+in+the+wasp+Nasonia.">Maternal control of haplodiploid sex determination in the wasp Nasonia.</a> Science. 328 (5978), 620-623 (2010).</li><li>Verhulst, E. C., Lynch, J. A., Bopp, D., Beukeboom, L. W., van de Zande, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+component+of+the+Nasonia+sex+determining+cascade+is+maternally+silenced+and+regulates+transformer+expression.">A new component of the Nasonia sex determining cascade is maternally silenced and regulates transformer expression.</a> PloS One. 8 (5), 63618 (2013).</li><li>Dalla Benetta, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+elimination+mediated+by+gene+expression+from+a+selfish+chromosome.">Genome elimination mediated by gene expression from a selfish chromosome.</a> Science Advances. 6 (14), (2020).</li><li>Aldrich, J. C., Leibholz, A., Cheema, M. S., Ausi&#972;, J., Ferree, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+"selfish"+B+chromosome+induces+genome+elimination+by+disrupting+the+histone+code+in+the+jewel+wasp+Nasonia+vitripennis.">A "selfish" B chromosome induces genome elimination by disrupting the histone code in the jewel wasp Nasonia vitripennis.</a> Scientific Reports. 7, 42551 (2017).</li><li>Ferree, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+genes+uniquely+expressed+in+the+germ-line+tissues+of+the+jewel+wasp+Nasonnia+vitripennis.">Identification of genes uniquely expressed in the germ-line tissues of the jewel wasp Nasonnia vitripennis.</a> G3. 3 (12), 2647-2653 (2015).</li><li>Akbari, O. S., Antoshechkin, I., Hay, B. A., Ferree, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+profiling+of+Nasonia+vitripennis+testis+reveals+novel+transcripts+expressed+from+the+selfish+B+chromosome,+paternal+sex+ratio.">Transcriptome profiling of Nasonia vitripennis testis reveals novel transcripts expressed from the selfish B chromosome, paternal sex ratio.</a> G3. 3 (9), 1597-1605 (2013).</li><li>Dalla Benetta, E., Beukeboom, L. W., van de Zande, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+differences+in+circadian+clock+gene+expression+patterns+and+photoperiodic+diapause+induction+in+Nasonia+vitripennis.">Adaptive differences in circadian clock gene expression patterns and photoperiodic diapause induction in Nasonia vitripennis.</a> The American Naturalist. 193 (6), 881-896 (2019).</li><li>Paolucci, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Latitudinal+variation+in+circadian+rhythmicity+in+Nasonia+vitripennis.">Latitudinal variation in circadian rhythmicity in Nasonia vitripennis.</a> Behavioral Sciences. 9 (11), (2019).</li><li>Werren, J. H., Loehlin, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+parasitoid+wasp+Nasonia:+an+emerging+model+system+with+haploid+male+genetics.">The parasitoid wasp Nasonia: an emerging model system with haploid male genetics.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (10), (2009).</li><li>Lynch, J. A., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+parental+RNA+interference+in+the+wasp+Nasonia+vitripennis.">A method for parental RNA interference in the wasp Nasonia vitripennis.</a> Nature Protocols. 1 (1), 486-494 (2006).</li><li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+heritable+germline+mutations+in+the+jewel+wasp+Nasonia+vitripennis+using+CRISPR/Cas9.">Generation of heritable germline mutations in the jewel wasp Nasonia vitripennis using CRISPR/Cas9.</a> Scientific Reports. 7 (1), 901 (2017).</li><li>Chaverra-Rodriguez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+mutagenesis+of+Nasonia+vitripennis+through+ovarian+delivery+of+CRISPR-Cas9+ribonucleoprotein.">Germline mutagenesis of Nasonia vitripennis through ovarian delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein.</a> Insect Molecular Biology. , (2020).</li><li>Li, M., Bui, M., Akbari, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryo+microinjection+and+transplantation+technique+for+Nasonia+vitripennis+genome+manipulation.">Embryo microinjection and transplantation technique for Nasonia vitripennis genome manipulation.</a> Journal of Visualized Experiments. (130), (2017).</li><li>Werren, J. H., Loehlin, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rearing+Sarcophaga+bullata+fly+hosts+for+Nasonia+(Parasitoid+Wasp).">Rearing Sarcophaga bullata fly hosts for Nasonia (Parasitoid Wasp).</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (10), (2009).</li><li>Werren, J. H., Loehlin, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain+maintenance+of+Nasonia+vitripennis+(Parasitoid+Wasp).">Strain maintenance of Nasonia vitripennis (Parasitoid Wasp).</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (10), (2009).</li><li>Beukeboom, L. W., van de Zande, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+sex+determination+in+the+haplodiploid+wasp+Nasonia+vitripennis+(Hymenoptera:+Chalcidoidea).">Genetics of sex determination in the haplodiploid wasp Nasonia vitripennis (Hymenoptera: Chalcidoidea).</a> Journal of Genetics. 89 (3), 333-339 (2010).</li><li>Leung, K., van de Zande, L., Beukeboom, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life-history+traits+of+the+Whiting+polyploid+line+of+the+parasitoid.">Life-history traits of the Whiting polyploid line of the parasitoid.</a> Entomologia experimentalis et applicata. 167 (7), 655-669 (2019).</li><li>Kennerdell, J. R., Carthew, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+dsRNA-mediated+genetic+interference+to+demonstrate+that+frizzled+and+frizzled+2+act+in+the+wingless+pathway.">Use of dsRNA-mediated genetic interference to demonstrate that frizzled and frizzled 2 act in the wingless pathway.</a> Cell. 95 (7), 1017-1026 (1998).</li><li>Yang, J., Zhao-jun, H. A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiency+of+different+methods+for+dsrna+delivery+in+cotton+bollworm+(Helicoverpa+armigera).">Efficiency of different methods for dsrna delivery in cotton bollworm (Helicoverpa armigera).</a> Journal of Integrative Agriculture. 13 (1), 115-123 (2014).</li><li>Brown, S., Holtzman, S., Kaufman, T., Denell, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+Tribolium+Deformed+ortholog+and+its+ability+to+directly+regulate+Deformed+target+genes+in+the+rescue+of+a+Drosophila+Deformed+null+mutant.">Characterization of the Tribolium Deformed ortholog and its ability to directly regulate Deformed target genes in the rescue of a Drosophila Deformed null mutant.</a> Development Genes and Evolution. 209 (7), 389-398 (1999).</li><li>Hughes, C. L., Kaufman, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+analysis+of+Deformed,+proboscipedia+and+Sex+combs+reduced+in+the+milkweed+bug+Oncopeltus+fasciatus:+novel+roles+for+Hox+genes+in+the+hemipteran+head.">RNAi analysis of Deformed, proboscipedia and Sex combs reduced in the milkweed bug Oncopeltus fasciatus: novel roles for Hox genes in the hemipteran head.</a> Development. 127 (17), 3683-3694 (2000).</li><li>Dzitoyeva, S., Dimitrijevic, N., Manev, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-abdominal+injection+of+double-stranded+RNA+into+anesthetized+adult+Drosophila+triggers+RNA+interference+in+the+central+nervous+system.">Intra-abdominal injection of double-stranded RNA into anesthetized adult Drosophila triggers RNA interference in the central nervous system.</a> Molecular Psychiatry. 6 (6), 665-670 (2001).</li><li>Chaverra-Rodriguez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+delivery+of+CRISPR-Cas9+ribonucleoprotein+into+arthropod+ovaries+for+heritable+germline+gene+editing.">Targeted delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein into arthropod ovaries for heritable germline gene editing.</a> Nature Communications. 9 (1), 3008 (2018).</li><li>Macias, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas9-mediated+gene-editing+in+the+malaria+mosquito+anopheles+stephensi+by+ReMOT+control.">Cas9-mediated gene-editing in the malaria mosquito anopheles stephensi by ReMOT control.</a> G3. 10 (4), 1353-1360 (2020).</li><li>Heu, C. C., McCullough, F. M., Luan, J., Rasgon, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-based+genome+editing+in+the+silverleaf+whitefly+(Bemisia+tabaci).">CRISPR/Cas9-based genome editing in the silverleaf whitefly (Bemisia tabaci).</a> CRISPR Journal. 3 (2), 89-96 (2020).</li><li>Shirai, Y., Daimon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+cardinal+are+responsible+for+the+red-1+and+peach+eye+color+mutants+of+the+red+flour+beetle+Tribolium+castaneum.">Mutations in cardinal are responsible for the red-1 and peach eye color mutants of the red flour beetle Tribolium castaneum.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 529 (2), 372-378 (2020).</li><li>Hunter, W. B., Gonzalez, M. T., Tomich, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAPC-assisted+CRISPR/Cas9+system:+targeted+delivery+into+adult+ovaries+for+heritable+germline+gene+editing+(Arthropoda:+Hemiptera).">BAPC-assisted CRISPR/Cas9 system: targeted delivery into adult ovaries for heritable germline gene editing (Arthropoda: Hemiptera).</a> bioRxiv. , 478743 (2018).</li><li>Chaverra Rodriguez, D., Bui, M., Li, M., Raban, R., Akbari, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+genetic+tools+to+control+ACP.">Developing genetic tools to control ACP.</a> Citrus Research Board Citrograph Magazine. 11 (1), 64-68 (2020).</li></ol>

עם השימוש המוגבר האחרון של Nasonia vitripennis כאורגניזם מודל לשאלות ביולוגיות שונות2,3,7,17, יש צורך לפתח ולייעל שיטות הזרקה כדי לאפשר פרוטוקול פשוט ויעיל לניתוח תפקודי של N. vitripennis גנים. השיטות הנוכחיות הכרוכות במיקרו-א?...

CRISPR / Cas9 עריכת גנים היא טכנולוגיה רבת עוצמה למחקרים גנטיים תפקודיים, במיוחד באורגניזמים מודל עולה רבים כגון צלופת התכשיט, Nasonia vitripennis. קלות ההתרבות והזמינות של גנום שלם הופכים את צלופת התכשיט למערכת ניסיונית חשובה להבהרת המנגנונים המולקולריים של תהליכים ביולוגיים שונים. לדוגמה, N. vitripennis שימש לאחרונה כדי לפענח את הבסיס האפיגנטי של מערכת קביעת מין haplodiploid1,2, הביולוגיה של כרומוזומי B3,4,5,6, ואת הבסיס הגנטי עבור ויסות ביולוגי ועונתי7,8. חלק מהתכונות שהופכות N. vitripennis נוח לעבוד עם כוללים זמן הדור הקצר (~ 2 שבועות ב 25 °C (69 °F), שיעורי רבייה גבוהים, הפרדת מין קלה בשלב pupal, ואת היכולת diapause ולאחסן זנים ב 4 °C (69 °F). מחזור החיים מתחיל עם צרעות נקבה טפילים הגומות של blowfly, סרקופגה bullata. דרך הביצית שלהם, הנקבות מטילות עד 50 ביצים במקרה הפופאלי של הזיוף. ביצים מתפתחות לזחלים הניזונים מגולם S. bullata, ממשיכים להתפתח במהלך הימים הקרובים, ולאחר מכן גור, ואחריו eclosion למבוגרים והופעתו מן puparium המארח9.
כלים מולקולריים לביצוע מחקרים גנטיים תפקודיים ב- N. vitripennis, כגון הפרעות RNA (RNAi)10 ו- CRISPR/Cas911,12, זמינים, אך מוגבלים, בעיקר בשל קשיים בביצוע microinjections עוברי13. כמו N. vitripennis ביצים דורשים מארח pupal לפיתוח, מניפולציה ביצה הוא מאוד מאתגר. יש לאסוף עוברי במה שלפני הפיצוץ מהגלמים המארחים, לעבור במהירות מיקרו-אינג'פקט, ולהעבירם מיד חזרה למארח לפיתוח13. צעדים אלה דורשים דיוק והכשרה מיוחדת כדי למנוע פגיעה בעוברים microinjected או המארחים pupal13. יתר על כן, הביצים קטנות מאוד ושבירות, במיוחד לאחר microinjections, עם ציטופלסמה צמיגה מאוד גורם סתימת מתמשך של מחט הזרקת13. תכונות אלה הופכות את המיקרו-אינג'ים העובריים למאתגרים במיוחד, ודורשים מפעילים מיומנים וציוד מיוחד הנעדר ברוב מעבדות N. vitripennis.
אופטימיזציה של שיטות הזרקה חלופיות לאספקת ריאגנטים CRISPR יתרום לאיחוד של N. vitripennis כאורגניזם מודל. המניפולציה של גולם ומבוגרים היא פחות מאתגרת מאשר מניפולציה עוברים והוא יכול להתבצע עם הגדרת הזרקה בסיסית. כאן מתוארים שני פרוטוקולים להזרקת גלמים ומבוגרים: האחד כולל ציוד מיוחד לזריקות, והשני כולל שימוש במכלול צינור שאיפה המצויד במחט נימי זכוכית. השימוש בצינור שאיפה מתאים במיוחד למעבדות שאין להן גישה לציוד מיוחד למיקרו-אינג'ים של עוברים. זריקות יעילות של שלבים התפתחותיים שונים של N. vitripennis, כולל גולים לבנים או שחורים וצעות למבוגרים, הם הפגינו. צרעות בשלב הגומה הלבנה מתאימות במיוחד לניסויי הפלה בתיווך RNAi. למרות RNAi ב Nasonia תואר לראשונה על ידי לינץ 'ו Desplan בשנת 200610, אין הליך חזותי זמין עבור איך זריקות RNAi מבוצעים. RNAi שימש לאחרונה כדי לגלות את הגן haploidizer של PSR כרומוזום B (יחס מין אבהי)3 וללמוד את המעורבות של גן השעון, נקודה, במקצבים ביולוגיים N. vitripennis 7.
ניתן להשתמש בגולם שחור ובצרעות למבוגרים כדי לגרום לעריכת גנים של נבטים CRISPR/Cas9 באמצעות ReMOT Control (התמרת השחלות בתיווך קולטן של מטען) ופרוטוקולי BAPC (כמוסות פפטיד אמפיפיליות מסועפות). שתי שיטות אלה משלוח השחלות תוארו לאחרונה להיות יעיל Nasonia ליצירת מוטציות נבט בגן היעד, cinnabar7,12. כאן, פרוטוקול פשוט מסופק עבור זריקות כולל הליך חזותי של מתודולוגיה צעד אחר צעד עבור זריקות ומבוגרים כאחד שניתן להשתמש בהם כדי ליצור מחקרים גנטיים תפקודיים Nasonia וסביר צרעות טפיליות אחרות, ללא צורך בציוד מיוחד ועקיפת microinjections עוברי.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 x 15 mm Stackable Petri Dishes, Polystyrene, Mono, Sterile</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>960-97693-083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminosilicate glass capillary tubing 1 mm(outside diameter) x 0.58 mm (inner diameter)</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>BF100-58-10</td>
			<td>Can also use Borosilicate or Quartz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5177-5EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BAPC</td>
			<td>phoreus biotech</td>
			<td>BAPtofect-25 0.5 mg Kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cas9 Protein with NLS</td>
			<td>PNABio</td>
			<td>CP01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting needle</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10806-330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase/RNase-Free distilled Water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Femtojet Express programmable microinjector</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Femtotips Microloader tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>E5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine-tip paintbrush</td>
			<td>ZEM</td>
			<td>2595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flesh fly pupae,&#160;Sarcophaga bullata</td>
			<td>Ward&#39;s Science</td>
			<td>470180-392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Food colorant dye</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Test Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>982010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glue</td>
			<td>Elmer&#39;s</td>
			<td></td>
			<td>washable, no toxic school glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-1000 or P-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-550-A3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ51</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pupal and adult injections for rnai and crispr gene editing in nasonia vitripennis

צרעת התכשיטים, נסוניה ויטריפניס, הפכה למערכת מודל יעילה לחקר אפיגנטיקה של קביעת מין haplo-diploid, ביולוגיה של כרומוזום B, אינטראקציות מארח סימביונט, דגימה, סינתזת ארס. למרות הזמינות של מספר כלים מולקולריים, כולל CRISPR /Cas9, מחקרים גנטיים תפקודיים עדיין מוגבלים באורגניזם זה. המגבלה העיקרית של יישום טכנולוגיית CRISPR/Cas9 ב- N. vitripennis נובעת מהאתגרים של מיקרו-אינג'ים עובריים. זריקות של עוברים קשות במיוחד באורגניזם זה ובכלל בצרעות טפיליות רבות, בשל גודל עובר קטן והדרישה של גולם מארח להתפתחות עוברית. כדי להתמודד עם אתגרים אלה, Cas9 ribonucleoprotein משלוח מורכב לתוך השחלות הנשיות על ידי הזרקת מבוגרים, ולא microinjection עוברי, היה אופטימיזציה, וכתוצאה מכך הן עריכות נבט סומטי תורשה. הליכי ההזרקה היו אופטימיזציה של גורים וצרעות נקבה באמצעות בקרת ReMOT (טרנסדוקציה השחלות בתיווך קולטן של מטען) או BAPC (קפסולות פפטיד אמפיפיליות מסועפות). שיטות אלה מוצגות כאלטרנטיבות יעילות להזרקת עוברים, המאפשרות מוטציות חיידקים ספציפיות לאתר ותורמיות.

נייר זה מציג שתי שיטות קלות עבור pupal ו microinjection למבוגרים, או באמצעות femtojet או צינור שאיפה. השיטה הראשונה מאפשרת הזרקה מדויקת יותר של נוזל, אשר חשוב עבור עקביות RNAi, ואילו השני מאפשר הזרקה של כמויות גדולות יותר של נוזל לתוך גולם Nasonia או מבוגרים.
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-...

Watch this Scientific Journal Video about Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis at JoVE.com

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

כאן, אנו מתארים שיטות להזרקות יעילות של פופלים ומבוגרים בנסוניה ויטריפניס כחלופות נגישות למיקרו-אינטרנציקציה של עוברים, המאפשרות ניתוח פונקציונלי של גנים בעלי עניין באמצעות השתקת RNA באמצעות הפרעת RNA (RNAi) או נוקאאוט גנים באמצעות עריכת גנום CRISPR/Cas9.

זריקות פואפאל ומבוגרים לעריכת גנים RNAi ו- CRISPR בנסוניה ויטריפניס

The jewel wasp, Nasonia vitripennis, has become an efficient model system to study epigenetics of haplo-diploid sex determination, B-chromosome biology, ...

Research on non-canonical insect model, like parasitoid wasp, is limited because embryonic microinjection is very challenging. Our method bypasses this problem, enabling site-specific and heritable germline mutations. Injecting pupae or adult females is fast and removes the requirement for expensive equipment or specialized training required to achieve successful embryonic microinjections.This technique will allow no specialized labs that do not have access to expensive equipment to do functional studies in any insect species they are using as a model. After the optimization, this method can be used to study functional genetics of many other genes in Nasonia. We also think this method may be used to deliver nucleic acids for genetic transformation of Nasonia or other insects.Begin by setting up approximately 20 mated females singularly in small glass test tubes plugged with cotton. Add two S.bullata hosts per tube and maintain the wasps at 25 degrees Celsius and 30%relative humidity with a 12:12 light dark cycle for two to three days. After two to three days, gently remove the females using a fine tipped brush to avoid continuous over position and a synchrony in offspring development.Removed females can optionally be re-hosted or stored at five degrees Celsius for up to a month. Maintain the parasitized host at 25 degrees Celsius and 30%relative humidity with a 12:12 light dark cycle for seven days if the desired injection stage requires white pupae, for 13 days, if the required developmental stage is black pupae, or 14 days for young, newly emerged adults. When the desired stage is reached, crack open the host puparium with a dissecting needle to recover N.vitripennis pupae and adults.Prepare a glass slide by applying a line of school glue at the center. Spread the glue with the dissecting needle to obtain a thick layer, which will be used to align the pupae. Let the glue dry for approximately two minutes before transferring the pupae.Under a dissecting microscope, use a dissecting needle to apply glue on the back of the head of the pupa. Attach the pupa to the glue layer on the slide with its abdomen facing up. Align 20 to 30 pupae side-by-side on the slide.Place the slide with the pupae and a Petri dish to let the glue drive for approximately 10 minutes. Before starting the injections, test the adherence of the pupae to the glue by pushing them gently with the dissecting needle. If most of the pupae are loosened, prepare a new slide.Alternatively, remove all loose pupae and proceed to inject those that are properly attached to the slide. Load one capillary glass tube into a needle puller and pull needles following the manufacturer's instructions. Load the needle with five microliters of the prepared injection mixture using microloader pipette tips.Open the needle, sliding the tip on a surface made from two overlapping slides. Alternatively, open the tip of the needle with a pair of fine forceps to create a sharp edge. Place the slide with the aligned pupae under a dissecting microscope, then insert the needle into the femtojet's injection tube and tighten the grip head.Looking at the needle under the microscope, turn on the femtojet and set the compensation pressure and injection pressure parameters by rotating the rotary knobs. Carefully insert the needle between the second and third visible abdominal segments with a vertical angle of about 30 degrees. Inject with a continuous flow until the whole abdomen turns green in the case of white stage pupae or until the abdomen increases in size in the case of black pupae.Stop injecting when it is clear that the abdomen cannot take any more liquid or when the liquid starts flowing out of the body. Move carefully to the next pupa and repeat these steps. Transfer the slide with the injected pupae to a Petri dish.Cover the dish with its lid and place it at 25 degrees Celsius until wasp emergence. For adult preparation, separate groups of 20 virgin females in a clean small test tube with a fine paint brush. Place a glass slide on top of ice and align the female side by side on the cold slide with abdomens facing up under a dissecting scope.Load one needle with the ribonucleoprotein solution using a microloading tip and insert the needle into the connector pack of the aspirator tube assembly. Support the females from the opposite side with blunted dissecting needles, while injecting slowly into the abdomen. Avoid touching the ovipositor.This will severely damage this critical reproductive structure. Carefully insert the needle between the second and third visible abdominal segments with a vertical angle of about 30 degrees. Inject the solution into the female abdomen, stopping when no more liquid can enter or when leaking of surplus solution is observed.Move carefully to the next female and repeat these steps. When finished, gently transfer a single injected females to a new tube with one host using a paintbrush. Leave them to recover at room temperature for approximately one hour, confirm survival, and return the tubes to the rearing incubator.After adult eclosion from the injected pupae, place single wasps into a glass to plugged with cotton and insert one S.bullata host. For CRISPR/Cas9 knockout experiments, allow females to parasitize the host for one day and replace the host each day for three consecutive days. Place the parasitized host, set 25 degrees Celsius until emergence of the G0 male offspring, approximately 13 to 14 days.Under a dissecting microscope, screen G0 males for the mutated phenotypes. The cinnabar gene is responsible for eye pigmentation. Wasps with brown eyes are wild-type and wasps with bright red eyes or variations between red and brown eyes are mutants.This protocol can be used for either pupal or adult microinjection. Survival rates of this procedure range from 15 to 100%The efficiency of achieving the desired phenotype via RNAi or CRISPR without requiring laborious egg injections is shown here. When injecting pupae or adult females, the needle should be sharp and be introduced in a way that liquid should not leak immediately after injecting.If this happens, remove the needle, ensure that the tip is fine and sharp, change it if necessary or inject in a different location. Function analysis can be performed on the gene of interest targeted from this procedure. This will answer a question about the gene function and if the gene is necessary for the specific phenotype studied.

Research

JoVE Journal

Biology

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes (A. gambiae)

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes A. gambiae

פרוטוקול מבחני RNAi ב למבוגרים יתושים (א gambiae)

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video ...

Localized RNAi and Ectopic Gene Expression in the Medicinal Leech

לוקליזציה RNAi ו ביטוי גנים מחוץ לרחם של עלוקה מרפא

In this video, we show the use of a pneumatic capillary gun for the accurate biolistic delivery of reagents into live tissue. We use the procedure to ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

מדורים פרפין-Embedded קפואים של תסיסנית סקס שרירים

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

RNAi מתווכת מציאה ין Transgenesis ידי Microinjection ב נמטודות Necromenic Pristionchus פקיפיקוס</em

Although it is increasingly affordable for emerging model organisms to obtain completely sequenced genomes, further in-depth gene function and expression ...

RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

RNAi בתיווך ג&#39;ין מציאה ו<em&gt; In vivo</em&gt; Diuresis Assay ב נקבה בוגרת<em&gt; Aedes aegypti</em&gt; יתושים

This video protocol demonstrates an effective technique to knockdown a particular gene in an insect and conduct a novel bioassay to measure excretion ...

In Vivo SiRNA Transfection and Gene Knockdown in Spinal Cord via Rapid Noninvasive Lumbar Intrathecal Injections in Mice

In Vivo SiRNA Transfection and Gene Knockdown in Spinal Cord via Rapid Noninvasive Lumbar Intrathecal Injections in Mice

בVivo siRNA Transfection וג&#39;ין מציאה בחוט השדרה באמצעות ראפיד פולשנית מותני intrathecal זריקות בעכברים

This report describes a step-by-step guide to the technique of acute intrathecal needle injections in a noninvasive manner, i.e. independent of catheter ...

Intravenous Injections in Neonatal Mice

זריקות תוך ורידים בעכברים בילוד

Intravenous injection is a clinically applicable manner to deliver therapeutics. For adult rodents and larger animals, intravenous injections are ...

Silencing the Spark: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish

השתקה הניצוץ: CRISPR/Cas9 הגנום עריכה בדגים חשמליים חלש

Electroreception and electrogenesis have changed in the evolutionary history of vertebrates. There is a striking degree of convergence in these ...

Nuclei Isolation from Adult Mouse Kidney for Single-Nucleus RNA-Sequencing

בידוד גרעינים מכליה של עכבר בוגר לריצוף RNA של גרעין יחיד

The kidneys regulate diverse biological processes such as water, electrolyte, and acid-base homeostasis. Physiological functions of the kidney are ...

Dissecting, Fixing, and Visualizing the Drosophila Pupal Notum

Dissecting, Fixing, and Visualizing the Drosophila Pupal Notum

ניתוח, תיקון והדמיה של ה-Drosophila Pupal Notum

The pupae of Drosophila melanogaster are immobile for several days during metamorphosis, during which they develop a new body with a thin transparent ...