Name: pupal and adult injections for rnai and crispr gene editing in nasonia vitripennis
Uploaded: 2020-12-04T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis at JoVE.com

Dette arbeidet ble delvis støttet av UCSDs oppstartsfond rettet mot O.S.A. og NSF/BIO grant 1645331 til J.L.R.

1. Nasonia oppdrett
<ol><li>Sett opp ~ 20 parrede kvinner entall i små glassrør plugget med bomull. MERK: For å redusere oppdrettsplassen er 10 x 85 cm, 4 ml rør optimale. Hunnene skiller seg lett fra menn på grunn av de større vingene og tilstedeværelsen av ovipositoren (Figur 1A). Detaljerte protokoller for oppdrett av N. vitripennis finnes også i annen litteratur13,14,15.<ol...

<ol>
	<li>Verhulst, E. C., Beukeboom, L. W., van de Zande, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+control+of+haplodiploid+sex+determination+in+the+wasp+Nasonia.">Maternal control of haplodiploid sex determination in the wasp Nasonia.</a> Science. 328 (5978), 620-623 (2010).</li><li>Verhulst, E. C., Lynch, J. A., Bopp, D., Beukeboom, L. W., van de Zande, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+component+of+the+Nasonia+sex+determining+cascade+is+maternally+silenced+and+regulates+transformer+expression.">A new component of the Nasonia sex determining cascade is maternally silenced and regulates transformer expression.</a> PloS One. 8 (5), 63618 (2013).</li><li>Dalla Benetta, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+elimination+mediated+by+gene+expression+from+a+selfish+chromosome.">Genome elimination mediated by gene expression from a selfish chromosome.</a> Science Advances. 6 (14), (2020).</li><li>Aldrich, J. C., Leibholz, A., Cheema, M. S., Ausi&#972;, J., Ferree, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+"selfish"+B+chromosome+induces+genome+elimination+by+disrupting+the+histone+code+in+the+jewel+wasp+Nasonia+vitripennis.">A "selfish" B chromosome induces genome elimination by disrupting the histone code in the jewel wasp Nasonia vitripennis.</a> Scientific Reports. 7, 42551 (2017).</li><li>Ferree, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+genes+uniquely+expressed+in+the+germ-line+tissues+of+the+jewel+wasp+Nasonnia+vitripennis.">Identification of genes uniquely expressed in the germ-line tissues of the jewel wasp Nasonnia vitripennis.</a> G3. 3 (12), 2647-2653 (2015).</li><li>Akbari, O. S., Antoshechkin, I., Hay, B. A., Ferree, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+profiling+of+Nasonia+vitripennis+testis+reveals+novel+transcripts+expressed+from+the+selfish+B+chromosome,+paternal+sex+ratio.">Transcriptome profiling of Nasonia vitripennis testis reveals novel transcripts expressed from the selfish B chromosome, paternal sex ratio.</a> G3. 3 (9), 1597-1605 (2013).</li><li>Dalla Benetta, E., Beukeboom, L. W., van de Zande, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+differences+in+circadian+clock+gene+expression+patterns+and+photoperiodic+diapause+induction+in+Nasonia+vitripennis.">Adaptive differences in circadian clock gene expression patterns and photoperiodic diapause induction in Nasonia vitripennis.</a> The American Naturalist. 193 (6), 881-896 (2019).</li><li>Paolucci, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Latitudinal+variation+in+circadian+rhythmicity+in+Nasonia+vitripennis.">Latitudinal variation in circadian rhythmicity in Nasonia vitripennis.</a> Behavioral Sciences. 9 (11), (2019).</li><li>Werren, J. H., Loehlin, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+parasitoid+wasp+Nasonia:+an+emerging+model+system+with+haploid+male+genetics.">The parasitoid wasp Nasonia: an emerging model system with haploid male genetics.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (10), (2009).</li><li>Lynch, J. A., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+parental+RNA+interference+in+the+wasp+Nasonia+vitripennis.">A method for parental RNA interference in the wasp Nasonia vitripennis.</a> Nature Protocols. 1 (1), 486-494 (2006).</li><li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+heritable+germline+mutations+in+the+jewel+wasp+Nasonia+vitripennis+using+CRISPR/Cas9.">Generation of heritable germline mutations in the jewel wasp Nasonia vitripennis using CRISPR/Cas9.</a> Scientific Reports. 7 (1), 901 (2017).</li><li>Chaverra-Rodriguez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+mutagenesis+of+Nasonia+vitripennis+through+ovarian+delivery+of+CRISPR-Cas9+ribonucleoprotein.">Germline mutagenesis of Nasonia vitripennis through ovarian delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein.</a> Insect Molecular Biology. , (2020).</li><li>Li, M., Bui, M., Akbari, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryo+microinjection+and+transplantation+technique+for+Nasonia+vitripennis+genome+manipulation.">Embryo microinjection and transplantation technique for Nasonia vitripennis genome manipulation.</a> Journal of Visualized Experiments. (130), (2017).</li><li>Werren, J. H., Loehlin, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rearing+Sarcophaga+bullata+fly+hosts+for+Nasonia+(Parasitoid+Wasp).">Rearing Sarcophaga bullata fly hosts for Nasonia (Parasitoid Wasp).</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (10), (2009).</li><li>Werren, J. H., Loehlin, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain+maintenance+of+Nasonia+vitripennis+(Parasitoid+Wasp).">Strain maintenance of Nasonia vitripennis (Parasitoid Wasp).</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (10), (2009).</li><li>Beukeboom, L. W., van de Zande, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+sex+determination+in+the+haplodiploid+wasp+Nasonia+vitripennis+(Hymenoptera:+Chalcidoidea).">Genetics of sex determination in the haplodiploid wasp Nasonia vitripennis (Hymenoptera: Chalcidoidea).</a> Journal of Genetics. 89 (3), 333-339 (2010).</li><li>Leung, K., van de Zande, L., Beukeboom, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life-history+traits+of+the+Whiting+polyploid+line+of+the+parasitoid.">Life-history traits of the Whiting polyploid line of the parasitoid.</a> Entomologia experimentalis et applicata. 167 (7), 655-669 (2019).</li><li>Kennerdell, J. R., Carthew, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+dsRNA-mediated+genetic+interference+to+demonstrate+that+frizzled+and+frizzled+2+act+in+the+wingless+pathway.">Use of dsRNA-mediated genetic interference to demonstrate that frizzled and frizzled 2 act in the wingless pathway.</a> Cell. 95 (7), 1017-1026 (1998).</li><li>Yang, J., Zhao-jun, H. A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiency+of+different+methods+for+dsrna+delivery+in+cotton+bollworm+(Helicoverpa+armigera).">Efficiency of different methods for dsrna delivery in cotton bollworm (Helicoverpa armigera).</a> Journal of Integrative Agriculture. 13 (1), 115-123 (2014).</li><li>Brown, S., Holtzman, S., Kaufman, T., Denell, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+Tribolium+Deformed+ortholog+and+its+ability+to+directly+regulate+Deformed+target+genes+in+the+rescue+of+a+Drosophila+Deformed+null+mutant.">Characterization of the Tribolium Deformed ortholog and its ability to directly regulate Deformed target genes in the rescue of a Drosophila Deformed null mutant.</a> Development Genes and Evolution. 209 (7), 389-398 (1999).</li><li>Hughes, C. L., Kaufman, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+analysis+of+Deformed,+proboscipedia+and+Sex+combs+reduced+in+the+milkweed+bug+Oncopeltus+fasciatus:+novel+roles+for+Hox+genes+in+the+hemipteran+head.">RNAi analysis of Deformed, proboscipedia and Sex combs reduced in the milkweed bug Oncopeltus fasciatus: novel roles for Hox genes in the hemipteran head.</a> Development. 127 (17), 3683-3694 (2000).</li><li>Dzitoyeva, S., Dimitrijevic, N., Manev, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-abdominal+injection+of+double-stranded+RNA+into+anesthetized+adult+Drosophila+triggers+RNA+interference+in+the+central+nervous+system.">Intra-abdominal injection of double-stranded RNA into anesthetized adult Drosophila triggers RNA interference in the central nervous system.</a> Molecular Psychiatry. 6 (6), 665-670 (2001).</li><li>Chaverra-Rodriguez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+delivery+of+CRISPR-Cas9+ribonucleoprotein+into+arthropod+ovaries+for+heritable+germline+gene+editing.">Targeted delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein into arthropod ovaries for heritable germline gene editing.</a> Nature Communications. 9 (1), 3008 (2018).</li><li>Macias, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas9-mediated+gene-editing+in+the+malaria+mosquito+anopheles+stephensi+by+ReMOT+control.">Cas9-mediated gene-editing in the malaria mosquito anopheles stephensi by ReMOT control.</a> G3. 10 (4), 1353-1360 (2020).</li><li>Heu, C. C., McCullough, F. M., Luan, J., Rasgon, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-based+genome+editing+in+the+silverleaf+whitefly+(Bemisia+tabaci).">CRISPR/Cas9-based genome editing in the silverleaf whitefly (Bemisia tabaci).</a> CRISPR Journal. 3 (2), 89-96 (2020).</li><li>Shirai, Y., Daimon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+cardinal+are+responsible+for+the+red-1+and+peach+eye+color+mutants+of+the+red+flour+beetle+Tribolium+castaneum.">Mutations in cardinal are responsible for the red-1 and peach eye color mutants of the red flour beetle Tribolium castaneum.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 529 (2), 372-378 (2020).</li><li>Hunter, W. B., Gonzalez, M. T., Tomich, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAPC-assisted+CRISPR/Cas9+system:+targeted+delivery+into+adult+ovaries+for+heritable+germline+gene+editing+(Arthropoda:+Hemiptera).">BAPC-assisted CRISPR/Cas9 system: targeted delivery into adult ovaries for heritable germline gene editing (Arthropoda: Hemiptera).</a> bioRxiv. , 478743 (2018).</li><li>Chaverra Rodriguez, D., Bui, M., Li, M., Raban, R., Akbari, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+genetic+tools+to+control+ACP.">Developing genetic tools to control ACP.</a> Citrus Research Board Citrograph Magazine. 11 (1), 64-68 (2020).</li></ol>

Med den nylig økte bruken av Nasonia vitripennis som modellorganisme for ulike biologiske spørsmål2,3,7,17, er det behov for å utvikle og optimalisere injeksjonsmetoder for å muliggjøre en forenklet og effektiv protokoll for funksjonell analyse av N. vitripennis gener. De nåværende metodene som involverer embryonal mikroinjeksjon av genredigeringsreagenser er utfordren...

CRISPR/Cas9 genredigering er en kraftig teknologi for funksjonelle genetiske studier, spesielt i mange stigende modellorganismer som juvel veps, Nasonia vitripennis. Den enkle oppdretten og tilgjengeligheten av et komplett genom gjør juvelvevepsen til et viktig eksperimentelt system for å belyse molekylære mekanismer i forskjellige biologiske prosesser. For eksempel har N. vitripennis nylig blitt brukt til å avdekke det epigenetiske grunnlaget for haplodiploid sexbestemmelsessystem1,2, biologien til B-kromosomene3,4,5,6og det genetiske grunnlaget for circadian og sesongregulering7,8. Noen av funksjonene som gjør N. vitripennis egnet til å jobbe med inkluderer kort generasjons tid (~ 2 uker ved 25 °C), høye reproduksjonshastigheter, enkel kjønnsseparasjon på puppetrinnet og evnen til å diapause og lagre stammer ved 4 °C. Livssyklusen begynner med kvinnelige hvepe som parasiterer blowflyens pupper, Sarcophaga bullata. Gjennom sin ovipositor legger kvinner opptil 50 egg i puppetuiet av blowflyen. Egg utvikler seg til larver som spiser på S. bullata pupa, fortsetter å utvikle seg i løpet av de neste dagene, og deretter puperer, etterfulgt av voksen eklosjon og fremvekst fra verten puparium9.
Molekylære verktøy for å utføre funksjonelle genetiske studier i N. vitripennis, for eksempel RNA-interferens (RNAi)10 og CRISPR / Cas911,12, er tilgjengelige, men er begrenset, hovedsakelig på grunn av vanskeligheter med å utføre embryonale mikroinjeksjoner13. Siden N. vitripennis egg krever en pupal vert for utvikling, egg manipulasjon er svært utfordrende. Pre-blastoderm stadium embryoer må samles fra verten blowfly pupper, raskt mikroinjisert, og umiddelbart overført tilbake til verten for utvikling13. Disse trinnene krever presisjon og spesialisert trening for å unngå å skade de mikroinjiserte embryoene eller puppevertene13. Videre er eggene svært små og skjøre, spesielt etter mikroinjeksjoner, med en veldig viskøs cytoplasma som forårsaker en kontinuerlig tilstopping av injeksjonsnålen13. Disse funksjonene gjør embryonale mikroinjeksjoner usedvanlig utfordrende, og krever høyt utdannede operatører og spesialisert utstyr som er fraværende i de fleste N. vitripennis laboratorier.
Optimalisering av alternative injeksjonsmetoder for levering av CRISPR-reagenser vil bidra til konsolidering av N. vitripennis som modellorganisme. Manipulering av pupper og voksne er mindre utfordrende enn å manipulere embryoer og kan oppnås med et grunnleggende injeksjonsoppsett. Her er to protokoller beskrevet for injeksjon av pupper og voksne: den ene involverer spesialisert utstyr for injeksjoner, og den andre involverer bruk av en aspiratorrørmontering utstyrt med en glasskapillær nål. Bruken av et aspiratorrør er spesielt egnet for laboratorier som ikke har tilgang til spesialisert utstyr for embryomikroinjeksjoner. Effektive injeksjoner av ulike utviklingsstadier av N. vitripennis, inkludert hvit eller svart pupper og voksenveps, demonstreres. Wasps på den hvite puppetrinnet er spesielt egnet for RNAi-medierte knockdown-eksperimenter. Selv om RNAi i Nasonia først ble beskrevet av Lynch og Desplan i 200610, er det ingen visuell prosedyre tilgjengelig for hvordan RNAi-injeksjoner utføres. RNAi ble nylig brukt til å oppdage haploidizer genet av B-kromosomet PSR (Paternal Sex Ratio)3 og for å studere involvering av klokkegenet, periode, i N. vitripennis biologiske rytmer7.
Svart pupper og voksne veps kan brukes til å indusere CRISPR/Cas9 germline genredigering ved hjelp av ReMOT Control (Receptor-Mediated Ovary Transduction of Cargo) og BAPC (Branched Amphiphilic Peptide Capsules) protokoller. Disse to eggstokkleveringsmetodene har nylig blitt beskrevet å være effektive i Nasonia for å generere bakteriemutasjoner i målgenet, cinnabar7,12. Her er en forenklet protokoll gitt for injeksjoner, inkludert en visuell prosedyre for en trinnvis metodikk for både pupal og voksen injeksjoner som kan brukes til å generere funksjonelle genetikkstudier i Nasonia og sannsynligvis i andre parasitoidveps, uten å kreve spesialisert utstyr og omgå embryonale mikroinjeksjoner.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 x 15 mm Stackable Petri Dishes, Polystyrene, Mono, Sterile</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>960-97693-083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminosilicate glass capillary tubing 1 mm(outside diameter) x 0.58 mm (inner diameter)</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>BF100-58-10</td>
			<td>Can also use Borosilicate or Quartz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5177-5EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BAPC</td>
			<td>phoreus biotech</td>
			<td>BAPtofect-25 0.5 mg Kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cas9 Protein with NLS</td>
			<td>PNABio</td>
			<td>CP01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting needle</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10806-330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase/RNase-Free distilled Water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Femtojet Express programmable microinjector</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Femtotips Microloader tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>E5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine-tip paintbrush</td>
			<td>ZEM</td>
			<td>2595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flesh fly pupae,&#160;Sarcophaga bullata</td>
			<td>Ward&#39;s Science</td>
			<td>470180-392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Food colorant dye</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Test Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>982010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glue</td>
			<td>Elmer&#39;s</td>
			<td></td>
			<td>washable, no toxic school glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-1000 or P-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-550-A3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ51</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pupal and adult injections for rnai and crispr gene editing in nasonia vitripennis

Juvelvevepsen, Nasonia vitripennis, har blitt et effektivt modellsystem for å studere epigenetikk av haplo-diploid sexbestemmelse, B-kromosombiologi, vertssympymiske interaksjoner, spesiering og giftsyntese. Til tross for tilgjengeligheten av flere molekylære verktøy, inkludert CRISPR / Cas9, er funksjonelle genetiske studier fortsatt begrenset i denne organismen. Den største begrensningen ved bruk av CRISPR/Cas9-teknologi i N. vitripennis stammer fra utfordringene ved embryonale mikroinjeksjoner. Injeksjoner av embryoer er spesielt vanskelig i denne organismen og generelt i mange parasitoidveps, på grunn av liten embryostørrelse og kravet om en vertsvalpe for embryonal utvikling. For å løse disse utfordringene ble Cas9 ribonucleoprotein kompleks levering til kvinnelige eggstokkene ved vokseninjeksjon, i stedet for embryonal mikroinjeksjon, optimalisert, noe som resulterte i både somatiske og arvelige bakterieredigeringer. Injeksjonsprosedyrene ble optimalisert i pupper og kvinnelige veps ved hjelp av enten ReMOT Control (Receptor-Mediated Ovary Transduction of Cargo) eller BAPC (Branched Amphiphilic Peptide Capsules). Disse metodene viser seg å være effektive alternativer til embryoinjeksjon, noe som muliggjør stedsspesifikke og arvelige bakteriemutasjoner.

Dette papiret presenterer to enkle metoder for pupal og voksen mikroinjeksjon, enten ved hjelp av en femtojet eller et aspiratorrør. Den første metoden tillater en mer presis injeksjon av væske, noe som er viktig for RNAi-konsistens, mens den andre tillater injeksjon av større mengder væske i Nasonia-pupper eller voksne.
Representative resultater presentert i tabell 1 viser god overlevelsesrate (fr...

Watch this Scientific Journal Video about Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis at JoVE.com

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

Her beskriver vi metoder for effektive pupal- og vokseninjeksjoner i Nasonia vitripennis som tilgjengelige alternativer til embryomikroinjeksjon, noe som muliggjør funksjonell analyse av gener av interesse ved hjelp av enten RNA-silencing via RNA-interferens (RNAi) eller gen knockout via CRISPR / Cas9 genomredigering.

Pupal og voksen injeksjoner for RNAi og CRISPR Genredigering i Nasonia vitripennis

The jewel wasp, Nasonia vitripennis, has become an efficient model system to study epigenetics of haplo-diploid sex determination, B-chromosome biology, ...

Research

JoVE Journal

Biology

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes (A. gambiae)

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes A. gambiae

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video ...

Localized RNAi and Ectopic Gene Expression in the Medicinal Leech

In this video, we show the use of a pneumatic capillary gun for the accurate biolistic delivery of reagents into live tissue. We use the procedure to ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

RNAi-mediert Gene knockdown og<em&gt; In Vivo</em&gt; Diurese Assay i voksen hunn<em&gt; Aedes aegypti</em&gt; Mygg

This video protocol demonstrates an effective technique to knockdown a particular gene in an insect and conduct a novel bioassay to measure excretion ...

In Vivo SiRNA Transfection and Gene Knockdown in Spinal Cord via Rapid Noninvasive Lumbar Intrathecal Injections in Mice

In Vivo SiRNA Transfection and Gene Knockdown in Spinal Cord via Rapid Noninvasive Lumbar Intrathecal Injections in Mice

I Vivo siRNA Transfection og Gene Knockdown i Spinal Cord via Rapid Noninvasiv Lumbar Intratekal Injeksjoner i Mus

This report describes a step-by-step guide to the technique of acute intrathecal needle injections in a noninvasive manner, i.e. independent of catheter ...

Intravenous Injections in Neonatal Mice

Intravenøse injeksjoner i Neonatal Mus

Intravenous injection is a clinically applicable manner to deliver therapeutics. For adult rodents and larger animals, intravenous injections are ...

Silencing the Spark: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish

Deaktivere spark: CRISPR/Cas9 Genova redigere i svakt Electric Fish

Electroreception and electrogenesis have changed in the evolutionary history of vertebrates. There is a striking degree of convergence in these ...

Nuclei Isolation from Adult Mouse Kidney for Single-Nucleus RNA-Sequencing

Kjerneisolasjon fra voksen musnyre for RNA-sekvensering med en kjerne

The kidneys regulate diverse biological processes such as water, electrolyte, and acid-base homeostasis. Physiological functions of the kidney are ...

Effective Oral RNA Interference (RNAi) Administration to Adult Anopheles gambiae Mosquitoes

Effective Oral RNA Interference RNAi Administration to Adult Anopheles gambiae Mosquitoes

Effektiv Oral RNA Interference (RNAi) Administrasjon til Voksne Anopheles gambiae Mygg

RNA interference has been a heavily utilized tool for reverse genetic analysis for two decades. In adult mosquitoes, double-stranded RNA (dsRNA) ...

Dissecting, Fixing, and Visualizing the Drosophila Pupal Notum

Dissecting, Fixing, and Visualizing the Drosophila Pupal Notum

Dissekere, fikse og visualisere Drosophila Pupal Notum

The pupae of Drosophila melanogaster are immobile for several days during metamorphosis, during which they develop a new body with a thin transparent ...