Name: pupal and adult injections for rnai and crispr gene editing in nasonia vitripennis
Uploaded: 2020-12-04T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado en parte por los fondos de inicio de UCSD dirigidos a O.S.A. y NSF / BIO 1645331 de subvenciones a J.L.R.

1. Cría de Nasonia
<ol><li>Configure ~ 20 hembras apareadas singularmente en pequeños tubos de ensayo de vidrio tapados con algodón. NOTA: Para reducir el espacio de cría, los tubos de 10 x 85 cm, 4 mL son óptimos. Las hembras se distinguen fácilmente de los machos debido a las alas más grandes y la presencia del ovipositor (Figura 1A). Los protocolos detallados para la cría de N. vitripennis también se pueden encontrar en otrasliteraturas 13,<s...

<ol>
	<li>Verhulst, E. C., Beukeboom, L. W., van de Zande, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+control+of+haplodiploid+sex+determination+in+the+wasp+Nasonia.">Maternal control of haplodiploid sex determination in the wasp Nasonia.</a> Science. 328 (5978), 620-623 (2010).</li><li>Verhulst, E. C., Lynch, J. A., Bopp, D., Beukeboom, L. W., van de Zande, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+component+of+the+Nasonia+sex+determining+cascade+is+maternally+silenced+and+regulates+transformer+expression.">A new component of the Nasonia sex determining cascade is maternally silenced and regulates transformer expression.</a> PloS One. 8 (5), 63618 (2013).</li><li>Dalla Benetta, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+elimination+mediated+by+gene+expression+from+a+selfish+chromosome.">Genome elimination mediated by gene expression from a selfish chromosome.</a> Science Advances. 6 (14), (2020).</li><li>Aldrich, J. C., Leibholz, A., Cheema, M. S., Ausi&#972;, J., Ferree, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+"selfish"+B+chromosome+induces+genome+elimination+by+disrupting+the+histone+code+in+the+jewel+wasp+Nasonia+vitripennis.">A "selfish" B chromosome induces genome elimination by disrupting the histone code in the jewel wasp Nasonia vitripennis.</a> Scientific Reports. 7, 42551 (2017).</li><li>Ferree, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+genes+uniquely+expressed+in+the+germ-line+tissues+of+the+jewel+wasp+Nasonnia+vitripennis.">Identification of genes uniquely expressed in the germ-line tissues of the jewel wasp Nasonnia vitripennis.</a> G3. 3 (12), 2647-2653 (2015).</li><li>Akbari, O. S., Antoshechkin, I., Hay, B. A., Ferree, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+profiling+of+Nasonia+vitripennis+testis+reveals+novel+transcripts+expressed+from+the+selfish+B+chromosome,+paternal+sex+ratio.">Transcriptome profiling of Nasonia vitripennis testis reveals novel transcripts expressed from the selfish B chromosome, paternal sex ratio.</a> G3. 3 (9), 1597-1605 (2013).</li><li>Dalla Benetta, E., Beukeboom, L. W., van de Zande, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+differences+in+circadian+clock+gene+expression+patterns+and+photoperiodic+diapause+induction+in+Nasonia+vitripennis.">Adaptive differences in circadian clock gene expression patterns and photoperiodic diapause induction in Nasonia vitripennis.</a> The American Naturalist. 193 (6), 881-896 (2019).</li><li>Paolucci, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Latitudinal+variation+in+circadian+rhythmicity+in+Nasonia+vitripennis.">Latitudinal variation in circadian rhythmicity in Nasonia vitripennis.</a> Behavioral Sciences. 9 (11), (2019).</li><li>Werren, J. H., Loehlin, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+parasitoid+wasp+Nasonia:+an+emerging+model+system+with+haploid+male+genetics.">The parasitoid wasp Nasonia: an emerging model system with haploid male genetics.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (10), (2009).</li><li>Lynch, J. A., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+parental+RNA+interference+in+the+wasp+Nasonia+vitripennis.">A method for parental RNA interference in the wasp Nasonia vitripennis.</a> Nature Protocols. 1 (1), 486-494 (2006).</li><li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+heritable+germline+mutations+in+the+jewel+wasp+Nasonia+vitripennis+using+CRISPR/Cas9.">Generation of heritable germline mutations in the jewel wasp Nasonia vitripennis using CRISPR/Cas9.</a> Scientific Reports. 7 (1), 901 (2017).</li><li>Chaverra-Rodriguez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+mutagenesis+of+Nasonia+vitripennis+through+ovarian+delivery+of+CRISPR-Cas9+ribonucleoprotein.">Germline mutagenesis of Nasonia vitripennis through ovarian delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein.</a> Insect Molecular Biology. , (2020).</li><li>Li, M., Bui, M., Akbari, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryo+microinjection+and+transplantation+technique+for+Nasonia+vitripennis+genome+manipulation.">Embryo microinjection and transplantation technique for Nasonia vitripennis genome manipulation.</a> Journal of Visualized Experiments. (130), (2017).</li><li>Werren, J. H., Loehlin, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rearing+Sarcophaga+bullata+fly+hosts+for+Nasonia+(Parasitoid+Wasp).">Rearing Sarcophaga bullata fly hosts for Nasonia (Parasitoid Wasp).</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (10), (2009).</li><li>Werren, J. H., Loehlin, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain+maintenance+of+Nasonia+vitripennis+(Parasitoid+Wasp).">Strain maintenance of Nasonia vitripennis (Parasitoid Wasp).</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (10), (2009).</li><li>Beukeboom, L. W., van de Zande, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+sex+determination+in+the+haplodiploid+wasp+Nasonia+vitripennis+(Hymenoptera:+Chalcidoidea).">Genetics of sex determination in the haplodiploid wasp Nasonia vitripennis (Hymenoptera: Chalcidoidea).</a> Journal of Genetics. 89 (3), 333-339 (2010).</li><li>Leung, K., van de Zande, L., Beukeboom, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life-history+traits+of+the+Whiting+polyploid+line+of+the+parasitoid.">Life-history traits of the Whiting polyploid line of the parasitoid.</a> Entomologia experimentalis et applicata. 167 (7), 655-669 (2019).</li><li>Kennerdell, J. R., Carthew, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+dsRNA-mediated+genetic+interference+to+demonstrate+that+frizzled+and+frizzled+2+act+in+the+wingless+pathway.">Use of dsRNA-mediated genetic interference to demonstrate that frizzled and frizzled 2 act in the wingless pathway.</a> Cell. 95 (7), 1017-1026 (1998).</li><li>Yang, J., Zhao-jun, H. A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiency+of+different+methods+for+dsrna+delivery+in+cotton+bollworm+(Helicoverpa+armigera).">Efficiency of different methods for dsrna delivery in cotton bollworm (Helicoverpa armigera).</a> Journal of Integrative Agriculture. 13 (1), 115-123 (2014).</li><li>Brown, S., Holtzman, S., Kaufman, T., Denell, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+Tribolium+Deformed+ortholog+and+its+ability+to+directly+regulate+Deformed+target+genes+in+the+rescue+of+a+Drosophila+Deformed+null+mutant.">Characterization of the Tribolium Deformed ortholog and its ability to directly regulate Deformed target genes in the rescue of a Drosophila Deformed null mutant.</a> Development Genes and Evolution. 209 (7), 389-398 (1999).</li><li>Hughes, C. L., Kaufman, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+analysis+of+Deformed,+proboscipedia+and+Sex+combs+reduced+in+the+milkweed+bug+Oncopeltus+fasciatus:+novel+roles+for+Hox+genes+in+the+hemipteran+head.">RNAi analysis of Deformed, proboscipedia and Sex combs reduced in the milkweed bug Oncopeltus fasciatus: novel roles for Hox genes in the hemipteran head.</a> Development. 127 (17), 3683-3694 (2000).</li><li>Dzitoyeva, S., Dimitrijevic, N., Manev, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-abdominal+injection+of+double-stranded+RNA+into+anesthetized+adult+Drosophila+triggers+RNA+interference+in+the+central+nervous+system.">Intra-abdominal injection of double-stranded RNA into anesthetized adult Drosophila triggers RNA interference in the central nervous system.</a> Molecular Psychiatry. 6 (6), 665-670 (2001).</li><li>Chaverra-Rodriguez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+delivery+of+CRISPR-Cas9+ribonucleoprotein+into+arthropod+ovaries+for+heritable+germline+gene+editing.">Targeted delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein into arthropod ovaries for heritable germline gene editing.</a> Nature Communications. 9 (1), 3008 (2018).</li><li>Macias, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas9-mediated+gene-editing+in+the+malaria+mosquito+anopheles+stephensi+by+ReMOT+control.">Cas9-mediated gene-editing in the malaria mosquito anopheles stephensi by ReMOT control.</a> G3. 10 (4), 1353-1360 (2020).</li><li>Heu, C. C., McCullough, F. M., Luan, J., Rasgon, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-based+genome+editing+in+the+silverleaf+whitefly+(Bemisia+tabaci).">CRISPR/Cas9-based genome editing in the silverleaf whitefly (Bemisia tabaci).</a> CRISPR Journal. 3 (2), 89-96 (2020).</li><li>Shirai, Y., Daimon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+cardinal+are+responsible+for+the+red-1+and+peach+eye+color+mutants+of+the+red+flour+beetle+Tribolium+castaneum.">Mutations in cardinal are responsible for the red-1 and peach eye color mutants of the red flour beetle Tribolium castaneum.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 529 (2), 372-378 (2020).</li><li>Hunter, W. B., Gonzalez, M. T., Tomich, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAPC-assisted+CRISPR/Cas9+system:+targeted+delivery+into+adult+ovaries+for+heritable+germline+gene+editing+(Arthropoda:+Hemiptera).">BAPC-assisted CRISPR/Cas9 system: targeted delivery into adult ovaries for heritable germline gene editing (Arthropoda: Hemiptera).</a> bioRxiv. , 478743 (2018).</li><li>Chaverra Rodriguez, D., Bui, M., Li, M., Raban, R., Akbari, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+genetic+tools+to+control+ACP.">Developing genetic tools to control ACP.</a> Citrus Research Board Citrograph Magazine. 11 (1), 64-68 (2020).</li></ol>

Con el reciente aumento del uso de Nasonia vitripennis como organismo modelo para diversas cuestiones biológicas2,3,7,17,existe la necesidad de desarrollar y optimizar los métodos de inyección para permitir un protocolo simplificado y eficiente para el análisis funcional de los genes de N. vitripennis. Los métodos actuales que involucran la microinyección embrionaria de ...

La edición de genes CRISPR/Cas9 es una poderosa tecnología para estudios genéticos funcionales, especialmente en muchos organismos modelo ascendentes como la avispa joya, Nasonia vitripennis. La facilidad de cría y la disponibilidad de un genoma completo hacen de la avispa joya un importante sistema experimental para dilucidar los mecanismos moleculares de diferentes procesos biológicos. Por ejemplo, N. vitripennis se ha utilizado recientemente para desentrañar la base epigenética del sistema de determinación de sexo haplodiploide1,2,la biología de los cromosomas B3,4,5,6,y la base genética para la regulación circadiana y estacional7,8. Algunas de las características que hacen que N. vitripennis sea susceptible de trabajar incluyen un corto tiempo de generación (~ 2 semanas a 25 ° C), altas tasas de reproducción, fácil separación sexual en la etapa pupal y la capacidad de diapausa y almacenar cepas a 4 ° C. El ciclo de vida comienza con las avispas hembras parasitando las pupas de la luciérnga, Sarcophaga bullata. A través de su ovipositor, las hembras ponen hasta 50 huevos en el caso pupal de la 8ra. Los huevos se convierten en larvas que se alimentan de la pupa de S. bullata, continúan desarrollándose durante los próximos días, y luego pupan, seguidos de eclosión adulta y la aparición del pupario huésped9.
Se dispone de herramientas moleculares para realizar estudios genéticos funcionales en N. vitripennis,tales como la interferencia de ARN (ARNi)10 y CRISPR/Cas911,12,pero son limitadas, principalmente debido a las dificultades en la realización de microinyecciones embrionarias13. Como los huevos de N. vitripennis requieren un huésped pupal para el desarrollo, la manipulación de huevos es muy difícil. Los embriones en etapa pre-blastodermo deben ser recolectados de las pupas de la luciérnga del huésped, microinyectados rápidamente y transferidos inmediatamente de vuelta al huésped para su desarrollo13. Estos pasos requieren precisión y entrenamiento especializado para evitar dañar los embriones microinyectados o los hospedadores pupales13. Además, los óvulos son muy pequeños y frágiles, especialmente después de microinyecciones, con un citoplasma muy viscoso que provoca una obstrucción continua de la aguja de inyección13. Estas características hacen que las microinyecciones embrionarias sean excepcionalmente desafiantes, requiriendo operadores altamente capacitados y equipos especializados que están ausentes en la mayoría de los laboratorios de N. vitripennis.
La optimización de métodos alternativos de inyección para la administración de reactivos CRISPR contribuiría a la consolidación de N. vitripennis como organismo modelo. La manipulación de pupas y adultos es menos difícil que la manipulación de embriones y se puede lograr con una configuración básica de inyección. Aquí, dos protocolos se describen para la inyección de pupas y adultos: uno que implica el equipo especializado para las inyecciones, y el otro que implica el uso de un conjunto del tubo del aspirador cabido con una aguja capilar de cristal. El uso de un tubo aspirador es particularmente adecuado para laboratorios que no tienen acceso a equipos especializados para microinyecciones de embriones. Se demuestran inyecciones eficientes de diferentes etapas de desarrollo de N. vitripennis,incluyendo pupas blancas o negras y avispas adultas. Las avispas en la etapa de pupa blanca son particularmente adecuadas para experimentos de derribo mediados por RNAi. Aunque RNAi en Nasonia fue descrito por primera vez por Lynch y Desplan en 200610, no hay ningún procedimiento visual disponible para cómo se realizan las inyecciones de RNAi. RNAi fue utilizado recientemente para descubrir el gen haploidizador del cromosoma B PSR (Paternal Sex Ratio)3 y para estudiar la implicación del gen reloj, período,en los ritmos biológicos de N. vitripennis 7.
Las pupas negras y las avispas adultas se pueden utilizar para inducir la edición de genes de línea germinal CRISPR/Cas9 utilizando los protocolos ReMOT Control (Receptor-Mediated Ovary Transduction of Cargo) y BAPC (Branched Amphiphilic Peptide Capsules). Estos dos métodos de administración de ovarios se han descrito recientemente como eficaces en Nasonia para generar mutaciones en la línea germinal en el gen diana, el cinabrio7,12. Aquí, se proporciona un protocolo simplificado para las inyecciones que incluye un procedimiento visual de una metodología paso a paso para inyecciones pupales y adultas que se pueden utilizar para generar estudios de genética funcional en Nasonia y probablemente en otras avispas parasitoides, sin requerir equipo especializado y evitando microinyecciones embrionarias.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 x 15 mm Stackable Petri Dishes, Polystyrene, Mono, Sterile</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>960-97693-083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminosilicate glass capillary tubing 1 mm(outside diameter) x 0.58 mm (inner diameter)</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>BF100-58-10</td>
			<td>Can also use Borosilicate or Quartz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5177-5EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BAPC</td>
			<td>phoreus biotech</td>
			<td>BAPtofect-25 0.5 mg Kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cas9 Protein with NLS</td>
			<td>PNABio</td>
			<td>CP01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting needle</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10806-330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase/RNase-Free distilled Water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Femtojet Express programmable microinjector</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Femtotips Microloader tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>E5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine-tip paintbrush</td>
			<td>ZEM</td>
			<td>2595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flesh fly pupae,&#160;Sarcophaga bullata</td>
			<td>Ward&#39;s Science</td>
			<td>470180-392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Food colorant dye</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Test Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>982010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glue</td>
			<td>Elmer&#39;s</td>
			<td></td>
			<td>washable, no toxic school glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-1000 or P-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-550-A3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ51</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pupal and adult injections for rnai and crispr gene editing in nasonia vitripennis

La avispa joya, Nasonia vitripennis,se ha convertido en un sistema modelo eficiente para estudiar la epigenética de la determinación del sexo haplo-diploide, la biología del cromosoma B, las interacciones huésped-simbionte, la especiación y la síntesis de veneno. A pesar de la disponibilidad de varias herramientas moleculares, incluyendo CRISPR/Cas9, los estudios genéticos funcionales todavía son limitados en este organismo. La principal limitación de la aplicación de la tecnología CRISPR/Cas9 en N. vitripennis se deriva de los desafíos de las microinyecciones embrionarias. Las inyecciones de embriones son particularmente difíciles en este organismo y en general en muchas avispas parasitoides, debido al pequeño tamaño del embrión y el requisito de una pupa huésped para el desarrollo embrionario. Para abordar estos desafíos, se optimizó la entrega del complejo de ribonucleoproteína Cas9 en los ovarios femeninos por inyección adulta, en lugar de microinyección embrionaria, lo que resultó en ediciones de línea germinal somáticas y heredables. Los procedimientos de inyección se optimizaron en pupas y avispas hembras utilizando ReMOT Control (Receptor-Mediated Ovary Transduction of Cargo) o BAPC (Branched Amphiphilic Peptide Capsules). Estos métodos han demostrado ser alternativas eficaces a la inyección de embriones, lo que permite mutaciones de la línea germinal hereditarias y específicas del sitio.

Este papel presenta dos métodos fáciles para la microinyección pupal y adulta, usando un femtojet o un tubo del aspirador. El primer método permite una inyección más precisa de líquido, que es importante para la consistencia de RNAi, mientras que el segundo permite la inyección de mayores cantidades de líquido en pupas nasonia o adultos.
Los resultados representativos presentados en la Tabla 1 ...

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Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

Aquí, se describen los métodos para las inyecciones pupales y adultos eficientes en Nasonia vitripennis como alternativas accesibles a la microinyección embrionaria, lo que permite el análisis funcional de los genes de interés utilizando ya sea arn-silenciamiento a través de la interferencia de ARN (RNAi) o knockout gen a través de CRISPR / Cas9 edición del genoma.

Inyecciones pupales y para adultos para RNAi y edición de genes CRISPR en Nasonia vitripennis

The jewel wasp, Nasonia vitripennis, has become an efficient model system to study epigenetics of haplo-diploid sex determination, B-chromosome biology, ...

Research

JoVE Journal

Biology

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes (A. gambiae)

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes A. gambiae

Protocolo para ensayos de RNAi en mosquitos adultos (A. gambiae)

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video ...

Investigación

Biología

Localized RNAi and Ectopic Gene Expression in the Medicinal Leech

Localizada RNAi y la expresión génica ectópico en la sanguijuela medicinal

In this video, we show the use of a pneumatic capillary gun for the accurate biolistic delivery of reagents into live tissue. We use the procedure to ...

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Las secciones incluidas en parafina y congeladas de Drosophila Los músculos de Adultos

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RNAi mediada por Gene y Derribo<em&gt; En Vivo</em&gt; Ensayo de diuresis en Mujeres Adultas<em&gt; Aedes aegypti</em&gt; Los mosquitos

This video protocol demonstrates an effective technique to knockdown a particular gene in an insect and conduct a novel bioassay to measure excretion ...

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En Vivo transfección siRNA y Gene Derribo en la médula espinal a través de Rapid no invasiva lumbar intratecal inyecciones en ratones

This report describes a step-by-step guide to the technique of acute intrathecal needle injections in a noninvasive manner, i.e. independent of catheter ...

Intravenous Injections in Neonatal Mice

Las inyecciones intravenosas en ratones recién nacidos

Intravenous injection is a clinically applicable manner to deliver therapeutics. For adult rodents and larger animals, intravenous injections are ...

Silencing the Spark: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish

Silenciar la chispa: Edición del genoma CRISPR/Cas9 en peces débilmente eléctricos

Electroreception and electrogenesis have changed in the evolutionary history of vertebrates. There is a striking degree of convergence in these ...

Nuclei Isolation from Adult Mouse Kidney for Single-Nucleus RNA-Sequencing

Aislamiento de núcleos de riñón de ratón adulto para secuenciación de ARN de un solo núcleo

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Effective Oral RNA Interference (RNAi) Administration to Adult Anopheles gambiae Mosquitoes

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Administración efectiva de ARN oral de interferencia (ARNi) a mosquitos adultos Anopheles gambiae

RNA interference has been a heavily utilized tool for reverse genetic analysis for two decades. In adult mosquitoes, double-stranded RNA (dsRNA) ...

Dissecting, Fixing, and Visualizing the Drosophila Pupal Notum

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Disección, fijación y visualización del Drosophila Pupal Notum

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