Name: microfluidic co-culture models for dissecting the immune response in in vitro tumor microenvironments
Uploaded: 2021-04-30T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Co-Culture Models for Dissecting the Immune Response in in vitro Tumor Microenvironments at JoVE.com

1. تصميم رقاقة للخلايا الملتصقة والعائمة الثقافات المشتركة 2D
ملاحظة: يتميز تخطيط الاستزراع المشترك ثنائي الأبعاد (الشكل 1A-C) بثلاث غرف (ارتفاع 100 ميكرومتر) مترابطة بمجموعتين من صفائف القنوات الدقيقة (500 × 12 × 10 ميكرومتر...

تحاول الطرق الموصوفة تصميم نهج عام لتلخيص ، بدرجة تعقيد قابلة للتعديل ، جانبين مهمين في مجال علم المناعة السرطاني ، والذي يمكن أن يستفيد من اعتماد نماذج أكثر صلة في المختبر. الأول ينطوي على جانب عدد الخلايا السرطانية ، حيث قد تؤدي معالجة خصائص الخلية المفردة إلى وصف أفضل لعدم التجانس والأ?...

يعتمد تطور فروع الطب المختلفة كتخصصات تجريبية على القدرة على التعامل مع عدد الخلايا ووظائف الأعضاء في ظل ظروف خاضعة للرقابة1. هذه القدرة لها جذورها في توافر نماذج قابلة للقياس قادرة على تلخيص العمليات التي تحدث في أجسامنا.
في عصر العلاج المناعي والتنميط الجيني أحادي الخلية 2 ، تحتاج بيولوجيا السرطان إلى الاستفادة من النماذج الناشئة في المختبر والحسابية للتحقيق في واجهة الورم المناعية في سياق زماني مكاني مناسب 2,3.
البيئة المكروية للورم4 (TME) هي نسيج معقد حيث تتفاعل الخلايا السرطانية باستمرار وتتطور ديناميكيا مع المكونات الخلوية الأخرى (الخلايا المناعية واللحمية والبطانية) وغير الخلوية (المصفوفة خارج الخلية ، ECM). تحدد الطبيعة الديناميكية لهذا المشهد المعقد ما إذا كانت الخلايا المناعية تلعب دور الأصدقاء أو الأعداء للخلايا الخبيثة ، مما يؤثر بشدة على كل من تطور المرض والاستجابة للعلاج. في الوقت الحاضر ، تتقارب الجهود الكبيرة من علماء المناعة السرطانية والمعلوماتية الحيوية وخبراء بيولوجيا الأنظمة لمعالجة الأهمية السريرية لعدم تجانس السرطان 5,6 ، إما في الفضاء (أي في مناطق الورم المتميزة) والوقت (أي في مراحل تطور الورم المتميزة)5,6 ، وتوصيف السرطان والنمط الظاهري للخلايا المناعية ووظيفتها على مستوى خلية واحدة. كمثال على هذا التآزر ، يتم الآن استخدام تقنيات الرؤية الحاسوبية المتقدمة بشكل روتيني لرسم الخرائط المكانية للتسلل المناعي في العينات النسيجية 7,8.
على جبهة النماذج التجريبية ، وسد الدراسات الحيوانية والطرق التقليدية في المختبر ، والتقدم في علم الموائع الدقيقة وتقنيات الزراعة المشتركة تتيح الوصول إلى فئات مختلفة من النماذج الخلوية المهندسة الدقيقة مثل المواد العضوية والأنظمة الفسيولوجية الدقيقة9،10،11 (MPS) والأعضاء على الرقاقة12،13،14 (OOC). يشتركون في السمة المشتركة لتكبير عرض "الصورة الكبيرة" للنظم الإيكولوجية الخلوية وتوسيع الإمكانات في المختبر للتحكم في العوامل البيئية الدقيقة مع استغلال الفحص المجهريعالي المحتوى 15 ونهج معالجة الصور.
في الوقت الحاضر ، بدأت أحدث أنظمة MPS و OOC في تضمين الجوانب المناعية ، ودمج أنواع فرعية مختلفة من الخلايا المناعية في الأنسجة الموجودة والثقافات المشتركة ، وذلك لاستكشاف وقياس مجموعة متنوعة من العمليات مثل الأمراض الالتهابية ، والتئام الجروح ، والمناعة المخاطية ، والاستجابة للسموم أو المنتجات الغذائية اليومية16. تم تطوير نماذج TME-on-a-chip 10،11،12،13،14،15،16،17 ، المدمجة أيضا مع الأوعية الدقيقة القابلة للكسر18،19،20،21 ، للتحقيق في التفاعلات المعتمدة على نوع الخلية ، والاضطرابات الفيزيائية والكيميائية ، والنشاط السام للخلايا تسلل الخلايا الليمفاوية22 ، وكذلك العوامل المناعية ذات الصلةسريريا 23.
هنا ، نقدم بروتوكولات متعددة الاستخدامات ، تمتد من تحميل الخلايا في الرقائق إلى أدوات معالجة الصور ، لاستغلال الثقافات المشتركة المتقدمة للسوائع الدقيقة المناعية للورم في إعدادات 2D (القسم 1) و 3D (القسم 2)16 ، متوافقة مع المراقبة الديناميكية متعددة المعلمات24 وتصور الوظائف الخلوية. يتم تحقيق ذلك مع الحفاظ على سهولة الاستخدام والمرونة في كل من إدارة العينات وتحليل البيانات ، والاستفادة من برامج فيجي المجانية وصناديق أدواتها25,26.
تم تصميم جهاز الموائع الدقيقة ، الموصوف في القسم 1 ، لأداء الثقافات المشتركة ثنائية الأبعاد للسرطان الملتصق والخلايا المناعية العائمة. تم التحقق من صحة هذه المنصة للقياس في المختبر لسلوك الخلايا المناعية في وجود طفرات جينية27 و / أو نقص المناعة28. هنا ، نوضح خطوات تتبع الخلايا المناعية في صور المجال الساطع ذات الفاصل الزمني ، من خلال استغلال طريقة شبه تلقائية تعتمد على Trackmate (مكون إضافي تم تنفيذه في برنامج فيجي). يتيح هذا الإجراء استخراج الواصفات الحركية للهجرة المناعية 29 والاستجابة (أي أوقات التفاعل) لاستهداف الخلايا السرطانية ، المعالجة أم لا بمحفزات موت الخلايا المناعية27.
الأهم من ذلك أن هذه المعلمات ، المستخرجة من صور السلاسل الزمنية ، يمكن معالجتها باستخدام آلات رياضية متقدمة. كمثال على إمكانات هذا النهج ، نشرت مجموعاتنا مؤخرا تحليلا يعتمد على الأساليب الرياضية من العمليات العشوائية والميكانيكا الإحصائية لنمذجة خصائص الشبكة الخلوية وتقديم وصف معلمات لسلوك الخلايا المناعية (أي المشي العشوائي المتحيز أو غير المرتبط ، الحركة المنسقةللغاية أو غير المنسقة 30,31).
يعتمد إعداد 3D ، المقدم في القسم الثاني ، على بروتوكول الثقافة المشتركة لإعادة إنشاء TMEs أكثر تعقيدا من المناعة المضمنة في منطقتين هلاميتين مع مجموعات مختلفة من أنواع الخلايا والأدوية بطريقة تنافسية. هنا ، يتم وصف خطوات معالجة الصور لقياس ، في نقاط زمنية مختلفة ، تسلل الخلايا المناعية الملطخة في خلايا سرطان الجلد البشرية A375M المزروعة داخل Matrigel ، لتقييم مجموعات العوامل المضادة للأورام32. تم اختيار خط A375M ، وهو خط خلية مشتق من A375P يتميز بنمط ظاهري نقيلي للغاية لتقييم قدرتها النقيلية في وجود الخلايا المناعية32.
يمكن أن تكون النماذج الموصوفة متوافقة تماما مع مصادر الخلايا المختلفة (الفئران وخطوط الخلايا البشرية الخالدة أو الأولية ، والمواد العضوية ، والطعوم الخارجية ، وغيرها). في الدراسات الحديثة لمختبرنا ، من خلال الجمع بين الفحص المجهري للفيديو عالي المحتوى وتحليل الصور ، تم تطبيق تخطيط 3D التنافسي للتحقيق: i) استجابة مناعية مضادة للورم (السمية الخلوية بوساطة الأجسام المضادة ، ADCC) وتشريح دور الخلايا الليفية في مقاومة علاج تراستوزوماب في نماذج سرطان الثدي HER2 + على الرقاقة33 ؛ عمل الخلايا النخاعية (أي الضامة المرتبطة بالسرطان) في آليات التهرب من الورم وتجنيد الخلايا التائية34 ؛ فعالية أنظمة العلاج المناعي ، وتحديدا على أساس الخلايا المتغصنة المكيفة بالإنترفير α ون (IFN-DCs) ، المزروعة بخلايا سرطان القولون المعالجة بالعقاقير في مصفوفات الكولاجين ، وتقييم الحركة الفعالة وأحداث البلعمة اللاحقة35 ؛ iv) الهجرة الكيميائية للحمضات المشتقة من نخاع العظم نحو خلايا سرطان الجلد المعالجة أو غير المعالجةIL-33 36.
يمكن أن تكون هذه النماذج المتقدمة بمثابة نوافذ مراقبة لفهم دور النسيج المناعي في ورم خبيث للسرطان وآليات المقاومة ، ولكن هناك حاجة إلى بذل جهود لترجمة النتائج إلى العيادات ، وسد الفجوة مع البحث الأساسي37.
كسيناريو ناشئ ، فإن تسخير قوة الفحص المجهري الآلي عالي المحتوى إلى جانب استخدام أنظمة دقيقة أكثر صلة من الناحية الفسيولوجية يفتح تحديات محتملة جديدة للتعامل مع ومعالجة وتفسير مئات ، بل آلاف ، غيغابايت من البيانات متعددة المعلمات ، والتي يمكن إنشاؤها من حملة تجريبية واحدة. وهذا يعني وجود صلة مباشرة لتجارب OOC مع الذكاء الاصطناعي38،39،40،41،42 (الذكاء الاصطناعي) () - الخوارزميات القائمة على كل من التحليل الآلي المتقدم ، وتوليد الميزات التي يمكن أن تغذي بدورها في نماذج السيليكو للتفاعل المناعي للسرطان 43 ، مع تطبيقات جديدة مثيرة في الأفق ، مثل تطوير فحوصات فحص الأدوية التنبؤية 44.
يركز تدفق الجهود المتزايد باستمرار على تصميم نماذج الأمراض جنبا إلى جنب مع تحسين الاستراتيجيات لتنفيذ شاشات الاضطراب واسعة النطاق مع قراءات متعددة الخلايا أحادية الخلية. سيساعد هذا بلا شك في تطوير ، ونأمل ، التنفيذ السريري ، مصحوبا بدرجة مناسبة من توحيد الطريقة ، لنهج منهجي لعلم المناعة على رقاقة لاكتساب رؤى جديدة حول الاضطرابات المناعية وآليات نشر السرطان.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell culture materials&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tubes</td>
			<td>Corning-Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>CLS430828</td>
			<td>centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-aza-2&#39;-deoxycytidine DAC</td>
			<td>Millipore-Sigma; St. Louis, MO</td>
			<td>A3656</td>
			<td>DNA-hypomethylating agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Corning-Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>CLS3506</td>
			<td>culture dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 cm2 cell culture treated flask</td>
			<td>Corning, New York, NY</td>
			<td>430641U</td>
			<td>culture flasks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A365M</td>
			<td>American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA</td>
			<td> 
			CVCL_B222</td>
			<td>human melanoma cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxorubicin hydrochloride</td>
			<td>Millipore-Sigma; St. Louis, MO</td>
			<td>D1515</td>
			<td>anthracycline antibiotic&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium DMEM</td>
			<td>EuroClone Spa, Milan, Italy</td>
			<td>ECM0728L</td>
			<td>Culture medium for SK-MEL-28&#160; cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffer Saline w/o Calcium w/o Magnesium</td>
			<td>EuroClone Spa, Milan, Italy</td>
			<td>ECB4004L</td>
			<td>saline buffer solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>EuroClone Spa, Milan, Italy</td>
			<td>ECS0180L</td>
			<td>ancillary for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll</td>
			<td>GE-Heathcare</td>
			<td>17-1440-02</td>
			<td>separation of mononuclear cells from human blood.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hemocytometer</td>
			<td>Neubauer</td>
			<td></td>
			<td>Cell counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparinized vials</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA</td>
			<td></td>
			<td>Vials for venous blood collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>interferon alpha-2b</td>
			<td>Millipore-Sigma; St. Louis, MO</td>
			<td>SRP4595</td>
			<td>recombinant human cytokine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 100X</td>
			<td>EuroClone Spa, Milan, Italy</td>
			<td>ECB3000D</td>
			<td>ancillary for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lympholyte cell separation media</td>
			<td>Cedarlane Labs, Burlington, Canada</td>
			<td></td>
			<td>Separation of lymphocytes by density gradient centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphoprep</td>
			<td>Axis-Shield PoC AS, Oslo, Norway</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning, New York, NY</td>
			<td>354230</td>
			<td>growth factor reduced basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231&#160;</td>
			<td>American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA</td>
			<td>&#160;HTB-26</td>
			<td>human breast cancer cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/ Streptomycin 100X&#160;&#160;</td>
			<td>EuroClone Spa, Milan, Italy</td>
			<td>ECB3001D</td>
			<td>ancillary for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet aid</td>
			<td>Drummond Scientific Co., Broomall, PA</td>
			<td>4-000-201</td>
			<td>Liquid handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKH26 Red Fluorescent cell linker</td>
			<td>Millipore-Sigma; St. Louis, MO</td>
			<td>PKH26GL</td>
			<td>red fluorescent cell dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKH67 Green fluorescent cell linker</td>
			<td>Millipore-Sigma; St. Louis, MO</td>
			<td>PKH67GL</td>
			<td>green fluorescent cell dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>EuroClone Spa, Milan, Italy</td>
			<td>ECM2001L</td>
			<td>Culture medium for MDA-MB-231 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>serological pipettes (2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL)</td>
			<td>Corning- Millipore-Sigma; St. Louis, MO</td>
			<td>CLS4486; CLS4487; CLS4488; CLS4489; CLS4490</td>
			<td>Liquid handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile tips (1-10 &#956;L, 10-20 &#956;L, 20-200 &#956;L, 1000 &#956;L)</td>
			<td>EuroClone Spa, Milan, Italy</td>
			<td>ECTD00010; ECTD00020; ECTD00200; ECTD01005</td>
			<td>tips for micropipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA</td>
			<td>15250061</td>
			<td>cell stain to assess cell viability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>EuroClone Spa, Milan, Italy</td>
			<td>ECM0920D</td>
			<td>dissociation reagent for adherent cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS-FL fluorescence microscope</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA</td>
			<td></td>
			<td>Fluorescent microscope for living cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humified cell culture incubator&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA</td>
			<td>311 Forma Direct Heat COIncubator; TC 230</td>
			<td>Incubation of cell cultures at 37 &#176;C, 5% CO2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Juli Microscope</td>
			<td>Nanoentek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory refrigerator (4 &#176;C)</td>
			<td>FDM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Safety Cabinet (Class II)</td>
			<td>Steril VBH 72 MP</td>
			<td></td>
			<td>Laminar flow hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerable centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostatic bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfabrication materials&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Aminopropyl)triethoxysilane (Aptes)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A3648</td>
			<td>silanizing agent for bonding PDMS to plastic coverslip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium quartz masks / 4&#34;x4&#34;, HRC / No AZ&#160;</td>
			<td>MB W&#38;A,&#160; Germany</td>
			<td></td>
			<td>optical masks for photolithography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip, D 263 M Schott glass,&#160; (170 &#177; 5 &#181;m)</td>
			<td>Ibidi, Germany</td>
			<td>10812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide solution 30%</td>
			<td>Carlo Erba Reagents</td>
			<td>412081</td>
			<td>reagents for piranha solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl isobutyl ketone</td>
			<td>Carlo Erba Reagents</td>
			<td>461945</td>
			<td>PMMA e-beam resist developer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Glass Slides (Pack of 50 slides) 76.2 mm x 25.4 mm&#160;</td>
			<td>Sail Brand</td>
			<td>7101</td>
			<td>substrates for bonding chips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miltex Biopsy Punch with Plunger, ID 1.0mm</td>
			<td>Tedpella</td>
			<td></td>
			<td>dermal biopsy punches for chip reservoirs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMMA&#160; 950 kDa</td>
			<td>Allresist,Germany</td>
			<td>AR-P. 679.04</td>
			<td>Positive electronic resists for patterning optical masks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymer untreated coverslips</td>
			<td>Ibidi, Germany</td>
			<td>10813</td>
			<td>substrates for bonding chips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prime CZ-Si Wafer,&#160; 4&#8221;, (100), Boron Doped</td>
			<td>Gambetti Xenologia Srl, Italy</td>
			<td>30255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propan-2-ol</td>
			<td>Carlo Erba Reagents</td>
			<td>415238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propylene glycol monomethyl ether acetate (PGMEA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>484431-4L</td>
			<td>SU-8 resists developer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 3005</td>
			<td>Micro resist technology,Germany</td>
			<td>C1.02.003-0001</td>
			<td>Negative Photoresists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 3050</td>
			<td>Micro resist technology,Germany</td>
			<td>C1.02.003-0005</td>
			<td>Negative Photoresists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suite of Biopunch, ID 4.0 mm, 6.0 mm, 8.0 mm</td>
			<td>Tedpella</td>
			<td>15111-40, 15111-60, 15111-80</td>
			<td>dermal biopsy punches for chip reservoirs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid 96%</td>
			<td>Carlo Erba Reagents</td>
			<td>410381</td>
			<td>reagents for piranha solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>Dowsil, Dow Corning</td>
			<td>11-3184-01</td>
			<td>Silicone Elastomer (PDMS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimethylchlorosilane (TMCS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>92360-100ML</td>
			<td>silanizing agent for SU-8 patterned masters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfabrication equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 kV e-beam litography</td>
			<td>Raith-Vistec EBPG 5HR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hotplate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical litography system</td>
			<td>EV-420 double-face contact mask-aligner</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reactive Ion Etching system</td>
			<td>Oxford plasmalab 80 plus system</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum dessicator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microfluidic co-culture models for dissecting the immune response in in vitro tumor microenvironments

تتطلب نماذج الأمراض المعقدة أدوات متطورة قادرة على تقديم رؤى ذات صلة من الناحية الفسيولوجية والمرضية وقابلة للتنفيذ ، وكشف النقاب عن عمليات غير مرئية. تثبت فحوصات الخلايا المتقدمة التي تحاكي عن كثب مشهد الجسم الحي نفسها كطرق جديدة لتصور وقياس التفاعل ثنائي الاتجاه بين الورم والمضيف الذي يؤثر على تطور السرطان. هنا نصف بروتوكولين متعددي الاستخدامات لإعادة إنشاء ثقافات مشتركة 2D و 3D يمكن التحكم فيها بدرجة عالية في الأجهزة الدقيقة ، مما يحاكي تعقيد البيئة المكروية للورم (TME) ، تحت المراقبة المناعية الطبيعية والناجمة عن العلاج. في القسم 1 ، يتم توفير إعداد تجريبي لمراقبة الحديث المتبادل بين الخلايا السرطانية الملتصقة والمجموعات المناعية العائمة ، عن طريق الفحص المجهري الساطع للفاصل الزمني. كسيناريو تطبيقي ، نقوم بتحليل آثار العلاجات المضادة للسرطان ، مثل ما يسمى بمحفزات موت الخلايا السرطانية المناعية على تجنيد وتنشيط الخلايا المناعية. في القسم 2 ، يتم تجميع البيئات الدقيقة المناعية للورم 3D في تخطيط تنافسي. تتم مراقبة التسلل المناعي التفاضلي من خلال لقطات مضان تصل إلى 72 ساعة ، لتقييم الاستراتيجيات العلاجية المركبة. في كلا الإعدادين ، يتم توضيح خطوات معالجة الصور لاستخراج عدد كبير من معلمات الخلايا المناعية (على سبيل المثال ، هجرة الخلايا المناعية وتفاعلها ، والاستجابة للعوامل العلاجية). يمكن تصميم هذه الطرق البسيطة والقوية بشكل أكبر لمحاكاة تعقيد TME الذي يشمل عدم تجانس ومرونة السرطان والأنواع الفرعية للخلايا اللحمية والمناعية ، بالإضافة إلى تفاعلاتها المتبادلة كمحركات لتطور السرطان. يمكن أن يؤدي امتثال هذه التقنيات سريعة التطور للتصوير عالي المحتوى للخلايا الحية إلى إنشاء مجموعات بيانات إعلامية كبيرة ، مما يؤدي إلى ظهور تحديات جديدة. في الواقع ، فإن مثلث "الثقافات المشتركة / الفحص المجهري / تحليل البيانات المتقدم" يحدد الطريق نحو معلمة مشكلة دقيقة قد تساعد في بروتوكولات علاجية مصممة خصيصا. نتوقع أن يؤدي التكامل المستقبلي للمناعة ضد السرطان على رقاقة مع الذكاء الاصطناعي للمعالجة عالية الإنتاجية إلى تآزر خطوة كبيرة إلى الأمام في الاستفادة من القدرات كأدوات تنبؤية وما قبل السريرية للدقة وعلم الأورام الشخصي.

التسلل المناعي للورم هو معلمة للاستجابة المضادة للورم المضيف. الأورام غير متجانسة في التكوين والكثافة والموقع والحالة الوظيفية للكريات البيض المتسللة التي يمكن أن تكمن التفاعلات مع الخلايا السرطانية في المعلومات ذات الصلة سريريا للتنبؤ بمسار المرض والاستجابة للعلاج. وبهذا المعنى ، يمك...

Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Co-Culture Models for Dissecting the Immune Response in in vitro Tumor Microenvironments at JoVE.com

Microfluidic Co-Culture Models for Dissecting the Immune Response in in vitro Tumor Microenvironments

في عصر العلاج المناعي والتنميط الجينومي أحادي الخلية ، تتطلب بيولوجيا السرطان أدوات جديدة في المختبر وحسابية للتحقيق في واجهة الورم المناعية في سياق زماني مكاني مناسب. نحن نصف بروتوكولات لاستغلال الثقافات المشتركة للسوائع الدقيقة المناعية للورم في إعدادات 2D و 3D ، متوافقة مع المراقبة الديناميكية متعددة المعلمات للوظائف الخلوية.

نماذج الاستزراع المشترك للموائع الدقيقة لتشريح الاستجابة المناعية في البيئات الدقيقة للورم في المختبر

Complex disease models demand cutting-edge tools able to deliver physiologically and pathologically relevant, actionable insights, and unveil otherwise ...

يوفر هذا البروتوكول إعدادات تجريبية لأداء ثقافات مشتركة 2D و 3D يمكن التحكم فيها في الأجهزة الدقيقة لتصور ومراقبة المحادثات المتقاطعة للخلايا المناعية للورم وتحليل آثار العلاجات المضادة للسرطان. توفر هذه التقنية تصورا سهلا وفي الوقت الفعلي لتجنيد الخلايا المناعية وتفاعلاتها ويمكن استخدامها للعينات البشرية والمستمدة من المريض. وهو متوافق مع معظم المجاهر الحديثة.وسيقوم بتوضيح الإجراء فرانشيسكو نوتو ، طالب دكتوراه في قسم الأورام والطب الجزيئي ، المعهد العالي للصحة ، ونيكوليتا ماندوكا وإستير ماكافيو ، طلاب الدكتوراه في جامعة كاتوليكا ديل ساكرو كور ، قسم الطب الانتقالي والجراحة. يتم تنشيط الرقائق مسبقا بالبلازما في منظف البلازما أو آلة حفر الحديد التفاعلية في غرفة نظيفة. يتم استخدام خلايا الطحال وخط الخلايا السرطانية هنا لمحاكاة البروتوكولات الموضحة في النص.قبل تحميل تعليق الخلايا ، اسحب الوسائط من جميع الخزانات الستة. ثم قم بتحميل 1 × 10 ببطء إلى الخلايا السرطانية الخامسة المعاد تعليقها في 10 إلى 50 ميكرولتر من وسط النمو في الخزان الأيسر العلوي والبئر السفلي. على الجانب الأيمن ، ماصة بلطف 1 × 10 إلى الخلايا المناعية العائمة السادسة المعاد تعليقها في 50 ميكرولتر من وسط النمو في بئرين.عند إضافة جميع الخلايا ، املأ جميع الخزانات الستة لكل شريحة بما يصل إلى 100 إلى 150 ميكرولتر من وسط النمو وتحقق من توزيع الخلايا بشكل صحيح داخل كل حجرة استزراع. احتضان الشريحة لمدة ساعة واحدة للسماح للنظام بالاستقرار قبل تسجيل الفاصل الزمني. لتصوير الخلايا الحية ، قم بتركيب الورم المناعي على لوحة الرقاقة على مرحلة المجهر.قم بتخصيص إعداد سير عمل الاستحواذ في واجهة برنامج المجهر مثل برنامج تحليل الخلايا الحية Incucyte. حدد نوافذ المراقبة ومعدل الإطارات الأمثل والمدة الزمنية ، اعتمادا على المعلمات المناسبة للتجربة وأنواع الخلايا قيد الدراسة. صور الخلايا للفترة الزمنية التجريبية المناسبة.قم بإعداد حصتين من matrigel المخففة بوسط يحتوي على دواء أو مزيج من الأدوية للحالتين التجريبيتين باستخدام نصائح باردة. الخلايا السرطانية الماصة المتوافقة بلطف مع الصبغة الحية والمصبوغة بالفلورسنت معلقة في محلول مصفوفة على الجليد للحصول على توزيع متجانس للخلايا. باستخدام لوحة الرقاقة على كتلة تبريد أو على سلة بها ثلج ، قم بحقن محلول مصفوفة الخلايا السرطانية المعالج بالأدوية ببطء في منافذ الهلام اليمنى واليسرى باستخدام أطراف ماصة صغيرة باردة سعة 10 ميكرولتر.اضغط برفق لدفع محلول المصفوفة من جانب واحد من القناة إلى الجانب الآخر. عندما يتم تحميل جميع الخلايا السرطانية ، ضع الجهاز في الحاضنة في وضع رأسي لمدة 30 دقيقة. في نهاية الحضانة ، بمجرد اكتمال هلام المصفوفة ، املأ القنوات المتوسطة لجميع الخزانات الستة ب 50 ميكرولتر من وسط الاستزراع.تحقق من سلامة الجل المبلمر وتوزيع الخلايا السرطانية تحت المجهر. ثم ضع الرقائق في حاضنة حتى يكتمل تحضير الخلايا المناعية. بعد الحضانة ، استنشاق الوسيط من كل بئر.ضع الطرف بالقرب من مدخل القناة المتوسطة الوسطى واستخدم ضغطا معتدلا لحقن 10 ميكرولترات من 10 برفق إلى الخلايا المناعية السادسة الموسومة بصبغة فلورية متباينة. حقن 50 إلى 100 ميكرولتر من الوسط في كل من الآبار الأربعة للقنوات الجانبية ، و 40 إلى 90 ميكرولترا من الوسط في البئر المركزي العلوي ، و 50 إلى 100 ميكرولتر من الوسط في البئر المركزي السفلي. عندما يتم تحميل جميع الآبار ، استخدم المجهر للتأكد من أن توزيع الخلايا المناعية ظل محصورا في الغرفة المركزية.ثم ضع الجهاز بعناية على سطح مستو في حاضنة زراعة الخلايا حتى التصوير. لحساب مدى تسلل الخلايا المناعية الحية الملطخة بالفلورسنت إلى حجرات الورم ، قم بتصوير الجهاز في نقاط زمنية محددة ذات أهمية بواسطة الفحص المجهري الفلوري واضبط معلمات الكاميرا المناسبة في برنامج التصوير المجهري ، مثل Nikon NIS-Elements. قم أيضا بتعيين المعلمات للخلايا المناعية المسمى.يمكن تتبع حركة الكريات البيض من خلال جسور microchannel المبنية بشكل مناسب في منصة الموائع الدقيقة نحو الخلايا المستهدفة عن طريق الفحص المجهري بالفيديو. في تحليل التتبع هذا ، تم تحدي PBMCs الفردية مع موت خلايا سرطانية معالجة بدوكسوروبيسين أو خلايا سرطانية حية معالجة ب PBS. تم إنشاء قيم الانجذاب الكيميائي ذات الصلة ومخططات الهجرة تلقائيا ، ولوحظ ملف تعريف هجرة مختلف للخلايا المناعية عند تحميلها المشترك مع خلايا سرطان الثدي المعرضة لدوكسوروبيسين أو برنامج تلفزيوني.عندما واجهت PBMCs خلايا سرطان موت الخلايا المبرمج ، عبروا القنوات الدقيقة نحو الخلايا المحتضرة والميتة لكنهم لم يعبروا إلى الخلايا الحية غير المعالجة. أظهر جزء صغير من كريات الدم البيضاء ذات الكثافة المتزايدة على مدار 24 إلى 48 ساعة اتصالات طويلة الأمد مع الخلايا السرطانية المعالجة بدوكسو. في هذا التحليل ، تم استخدام نموذج ورم جديد 3D مناعي لتحديد تجنيد الخلايا المناعية استجابة لمجموعات مضادة للسرطان من الأدوية اللاجينية.ثم تم توزيع PBMCs ذات العلامات الحمراء بشكل متجانس في غرفة السوائل المركزية. ثم تمت مقارنة قدرة كتلتي الورم على جذب PBMCs ، مع تجنيد PBMCs بقوة في هذه التجربة في القناة الدقيقة اليمنى. بالنسبة لنموذج 3D ، امزج المحلول مع هيدروجيل وخلايا على الجليد ، وتجنب الفقاعات والبلمرة المسبقة.حقنه ببطء دون ضغط مفرط. ضبط خطوات البلمرة وفقا للمصفوفة المستخدمة. يمكن تنفيذ فحوصات الخلايا الحية / الميتة وتوصيف إفراز السيتوكين من المواد الطافية.يمكن إجراء التألق المناعي للتصوير متحد البؤر لتصنيف الأنواع الفرعية المناعية ولعلامات التعبير عن النضج والاستنفاد.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

شارك في نماذج من الثقافة الزائفة الزنجارية الأغشية الحيوية نمت على خلايا حية إيرواي الإنسان

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

Seven Steps to Stellate Cells

سبع خطوات لخلايا النجمية

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

مقدمة لالدبابير الطفيلية من<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; والاستجابة المناعية Antiparasite

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. ...

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

قياس كمية الاستجابة المناعية والنوم في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em

A complex interaction between the immune response and  host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in  particular, is known ...

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

التحقيق في آثار البروبيوتيك على المكورات الرئوية الاستعمار باستخدام<em&gt; في المختبر</em&gt; الالتزام الفحص

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

Dissecting Innate Immune Signaling in Viral Evasion of Cytokine Production

تشريح الفطري اشارة المناعة في التهرب الفيروسية من الإنتاج خلوى

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

باستخدام الحمض النووي الريبي التدخل للتحقيق في الاستجابة المناعية الفطرية في الفأر الضامة

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

في تحليل المختبر من الاستجابة المناعية الخلوية بوساطة Myd88 لفيروس غرب النيل المسخ سلالة العدوى

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Dissecting Multi-protein Signaling Complexes by Bimolecular Complementation Affinity Purification (BiCAP)

Dissecting Multi-protein Signaling Complexes by Bimolecular Complementation Affinity Purification BiCAP

تشريح مجمعات البروتين متعدد الإشارات بالتكامل Bimolecular انجذاب تطهير (بيكاب)

The assembly of protein complexes is a central mechanism underlying the regulation of many cell signaling pathways. A major focus of biomedical research ...

Two-photon Intravital Imaging of Leukocytes During the Immune Response in Lipopolysaccharide-treated Mouse Liver

اثنين-فوتون تصوير إينترافيتال من الكريات البيضاء خلال الاستجابة المناعية في الكبد تعامل Lipopolysaccharide الماوس

Sepsis is a type of severe infection that can cause organ failure and tissue damage. Although the mortality and morbidity rates associated with sepsis are ...