Name: microfluidic co-culture models for dissecting the immune response in in vitro tumor microenvironments
Uploaded: 2021-04-30T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Co-Culture Models for Dissecting the Immune Response in in vitro Tumor Microenvironments at JoVE.com

1. Conception de puces pour les co-cultures 2D de cellules adhérentes et flottantes
REMARQUE : La disposition de co-culture 2D (Figure 1A-C) est caractérisée par trois chambres (100 μm de haut) reliées entre elles par deux ensembles de réseaux de microcanaux (500 x 12 x 10 μm3, L×W×H). La chambre intermédiaire forme deux compartiments fermés en cul-de-sac qui bloquent...

Les méthodes décrites tentent de concevoir une approche générale pour récapituler, avec un degré de complexité modulable, deux aspects significatifs dans le domaine de l’onco-immunologie, qui peuvent bénéficier de l’adoption de modèles in vitro plus pertinents. Le premier concerne le côté de la population de cellules tumorales, où s’attaquer aux caractéristiques des cellules uniques peut conduire à une meilleure description de l’hétérogénéité et de la signification biologique et clinique corr?...

L’évolution des différentes branches de la médecine en tant que disciplines expérimentales a dépendu de la capacité à manipuler la population cellulaire et les fonctions des organes dans des conditions contrôlées1. Une telle capacité a ses racines dans la disponibilité de modèles mesurables capables de récapituler les processus qui se produisent dans notre corps.
À l’ère de l’immunothérapie et du profilage génomique unicellulaire 2, la biologie du cancer doit tirer parti des modèles in vitro et informatiques émergents pour étudier l’interface tumorale-immunitaire dans un contexte spatio-temporel approprié 2,3.
Le microenvironnement tumoral4 (TME) est un tissu complexe où les cellules cancéreuses interagissent continuellement et co-évoluent dynamiquement avec les autres composants cellulaires (cellules immunitaires, stromales et endothéliales) et non cellulaires (matrice extracellulaire, ECM). La nature dynamique de ce paysage complexe dicte si les cellules immunitaires jouent le rôle d’amies ou d’ennemies des cellules malignes, affectant ainsi fortement la progression de la maladie et la réponse au traitement. De nos jours, de grands efforts de la part des onco-immunologistes, des bioinformaticiens et des experts en biologie des systèmes convergent pour aborder la signification clinique de l’hétérogénéité du cancer 5,6, soit dans l’espace (c’est-à-dire dans des régions tumorales distinctes) et dans le temps (c’est-à-dire à des stades de progression tumorale distincts)5,6, et pour caractériser le phénotype et la fonction du cancer et des cellules immunitaires au niveau d’une seule cellule. À titre d’exemple de cette synergie, des techniques avancées de vision par ordinateur sont maintenant couramment utilisées pour la cartographie spatiale de l’infiltrat immunitaire dans les échantillons histologiques 7,8.
Sur le front des modèles expérimentaux, des études animales et des méthodes in vitro traditionnelles, les progrès de la microfluidique et des techniques de co-culture donnent accès à différentes classes de modèles cellulaires micro-modifiés tels que les organoïdes, les systèmes microphysiologiques 9,10,11 (MPS) et les organes sur puce12,13,14 (OOC). Ils partagent le trait commun de zoomer sur la vue d’ensemble des écosystèmes cellulaires et d’élargir le potentiel in vitro de contrôle des facteurs microenvironnementaux tout en exploitant la microscopie à haut contenu15 et les approches de traitement d’images.
De nos jours, les systèmes MPS et OOC de pointe ont commencé à inclure des aspects immunologiques, incorporant différents sous-types de cellules immunitaires dans les tissus existants et les co-cultures, afin d’explorer et de mesurer une variété de processus tels que les maladies inflammatoires, la cicatrisation des plaies, l’immunité muqueuse et la réponse aux toxines ou aux produits alimentaires quotidiens16. Les modèles TME-on-a-chip 10,11,12,13,14,15,16,17, également intégrés à des microvaisseaux perfusables 18,19,20,21, ont été développés pour étudier les interactions dépendantes du type cellulaire, les perturbations physiques et chimiques et l’activité cytotoxique des lymphocytes infiltrants22, ainsi que des agents immunomodulateurs cliniquement pertinents23.
Ici, nous fournissons des protocoles polyvalents, allant du chargement de cellules dans des puces à des outils de traitement d’image, pour exploiter des co-cultures microfluidiques avancées contre les tumeurs dans des paramètres 2D (section 1) et 3D (section 2)16, compatibles avec la surveillance et la visualisation dynamiques et multiparamétriques24 des fonctions cellulaires. Ceci est réalisé en maintenant la facilité d’utilisation et la flexibilité à la fois dans la gestion des échantillons et l’analyse des données, en tirant parti du logiciel gratuit Fidji et de ses boîtes à outils25,26.
Le dispositif microfluidique, décrit à la section 1, est conçu pour effectuer des co-cultures 2D de cancer adhérent et de cellules immunitaires flottantes. Cette plateforme a été validée pour la mesure in vitro du comportement des cellules immunitaires en présence de mutations génétiques27 et/ou d’immunodéficiences28. Ici, nous illustrons les étapes de suivi des cellules immunitaires dans des images en champ clair en accéléré, en exploitant une méthode semi-automatique basée sur Trackmate (un plugin implémenté dans le logiciel Fidji). Cette procédure permet d’extraire des descripteurs cinématiques de la migration immunitaire 29 et de la réponse (c’est-à-dire des temps d’interaction) pour cibler les cellules cancéreuses, traitées ou non avec des inducteurs immunogènes de mort cellulaire27.
Il est important de noter que ces paramètres, extraits d’images de séries chronologiques, peuvent être traités avec des machines mathématiques avancées. À titre d’exemple de la potentialité de cette approche, nos groupes ont récemment publié une analyse basée sur des méthodes mathématiques issues des processus stochastiques et de la mécanique statistique pour modéliser les propriétés du réseau cellulaire et fournir une description paramétrée du comportement des cellules immunitaires (c.-à-d. marche aléatoire biaisée ou non corrélée, mouvement hautement coordonnéou non 30,31).
Le réglage 3D, fourni dans la deuxième section, est basé sur un protocole de co-culture pour recréer des TME immunocompétents plus complexes intégrés dans deux régions de gel avec différentes combinaisons de types de cellules et de médicaments de manière compétitive. Ici, les étapes de traitement d’images sont décrites pour mesurer, à différents moments, l’infiltration de cellules immunitaires colorées dans des cellules de mélanome A375M humaines cultivées au sein de Matrigel, pour évaluer des combinaisons d’agents antitumoraux32. La lignée A375M, une lignée cellulaire dérivée de l’A375P caractérisée par un phénotype hautement métastatique a été choisie pour évaluer leur capacité métastatique en présence de cellules immunitaires32.
Les modèles décrits peuvent être entièrement conformes à différentes sources cellulaires (lignées cellulaires immortalisées ou primaires murines et humaines, organoïdes, xénogreffes, entre autres). Dans des études récentes de notre laboratoire, en combinant la microscopie vidéo à haut contenu avec l’analyse d’images, la disposition 3D compétitive a été appliquée pour étudier: i) une réponse immunitaire antitumorale (cytotoxicité à médiation cellulaire dépendante des anticorps, ADCC) et disséquer le rôle des fibroblastes dans la résistance au traitement par trastuzumab dans les modèles sur puce de cancer du sein HER2+ 33; ii) l’action des cellules myéloïdes (c’est-à-dire des macrophages associés au cancer) dans les mécanismes d’évasion tumorale et de recrutement des lymphocytes T34; iii) l’efficacité des régimes immunothérapeutiques, spécifiquement basés sur des cellules dendritiques conditionnées par l α’interféron (IFN-DC), cultivées avec des cellules cancéreuses du côlon traitées par des médicaments dans des matrices de collagène, et pour évaluer l’efficacité du mouvement et les événements de phagocytose qui en découlent35; iv) la migration chimiotactique des éosinophiles dérivés de la moelle osseuse vers les cellules de mélanome traitées ou non traitées par IL-3336.
Ces modèles avancés pourraient servir de fenêtres d’observation pour comprendre le rôle de la contexture immunitaire dans les métastases cancéreuses et les mécanismes de résistance, mais des efforts sont nécessaires pour traduire les résultats dans les cliniques, comblant ainsi l’écart avec la recherche fondamentale37.
En tant que scénario émergent, l’exploitation de la puissance de la microscopie automatisée à haut contenu couplée à l’utilisation de microsystèmes plus pertinents sur le plan physiologique ouvre de nouveaux défis potentiels pour la manipulation, le traitement et l’interprétation de centaines, voire de milliers, de gigaoctets de données multiparamétriques, qui peuvent être générées à partir d’une seule campagne expérimentale. Cela implique un lien direct entre les expériences OOC et les algorithmes basés sur l’intelligence artificielle 38,39,40,41,42 (IA) à la fois pour l’analyse automatisée avancée et la génération de fonctionnalités qui peuvent alimenter à leur tour des modèles in silico d’interaction cancer-immunité 43, avec de nouvelles applications passionnantes à l’horizon, telles que le développement de tests prédictifs de dépistage de médicaments 44.
Un flux d’efforts sans cesse croissant est axé sur la conception de modèles de maladies conjointement avec l’optimisation des stratégies pour mettre en œuvre les criblages de perturbation à grande échelle avec des lectures multi-omiques unicellulaires. Cela contribuera sans aucun doute au développement et, espérons-le, à la mise en œuvre clinique, accompagnée d’un degré approprié de normalisation des méthodes, d’une approche systématique onco-immunologie sur puce pour acquérir de nouvelles connaissances sur les troubles immunitaires et les mécanismes de dissémination du cancer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell culture materials&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tubes</td>
			<td>Corning-Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>CLS430828</td>
			<td>centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-aza-2&#39;-deoxycytidine DAC</td>
			<td>Millipore-Sigma; St. Louis, MO</td>
			<td>A3656</td>
			<td>DNA-hypomethylating agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Corning-Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>CLS3506</td>
			<td>culture dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 cm2 cell culture treated flask</td>
			<td>Corning, New York, NY</td>
			<td>430641U</td>
			<td>culture flasks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A365M</td>
			<td>American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA</td>
			<td> 
			CVCL_B222</td>
			<td>human melanoma cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxorubicin hydrochloride</td>
			<td>Millipore-Sigma; St. Louis, MO</td>
			<td>D1515</td>
			<td>anthracycline antibiotic&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium DMEM</td>
			<td>EuroClone Spa, Milan, Italy</td>
			<td>ECM0728L</td>
			<td>Culture medium for SK-MEL-28&#160; cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffer Saline w/o Calcium w/o Magnesium</td>
			<td>EuroClone Spa, Milan, Italy</td>
			<td>ECB4004L</td>
			<td>saline buffer solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>EuroClone Spa, Milan, Italy</td>
			<td>ECS0180L</td>
			<td>ancillary for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll</td>
			<td>GE-Heathcare</td>
			<td>17-1440-02</td>
			<td>separation of mononuclear cells from human blood.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hemocytometer</td>
			<td>Neubauer</td>
			<td></td>
			<td>Cell counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparinized vials</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA</td>
			<td></td>
			<td>Vials for venous blood collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>interferon alpha-2b</td>
			<td>Millipore-Sigma; St. Louis, MO</td>
			<td>SRP4595</td>
			<td>recombinant human cytokine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 100X</td>
			<td>EuroClone Spa, Milan, Italy</td>
			<td>ECB3000D</td>
			<td>ancillary for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lympholyte cell separation media</td>
			<td>Cedarlane Labs, Burlington, Canada</td>
			<td></td>
			<td>Separation of lymphocytes by density gradient centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphoprep</td>
			<td>Axis-Shield PoC AS, Oslo, Norway</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning, New York, NY</td>
			<td>354230</td>
			<td>growth factor reduced basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231&#160;</td>
			<td>American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA</td>
			<td>&#160;HTB-26</td>
			<td>human breast cancer cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/ Streptomycin 100X&#160;&#160;</td>
			<td>EuroClone Spa, Milan, Italy</td>
			<td>ECB3001D</td>
			<td>ancillary for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet aid</td>
			<td>Drummond Scientific Co., Broomall, PA</td>
			<td>4-000-201</td>
			<td>Liquid handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKH26 Red Fluorescent cell linker</td>
			<td>Millipore-Sigma; St. Louis, MO</td>
			<td>PKH26GL</td>
			<td>red fluorescent cell dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKH67 Green fluorescent cell linker</td>
			<td>Millipore-Sigma; St. Louis, MO</td>
			<td>PKH67GL</td>
			<td>green fluorescent cell dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>EuroClone Spa, Milan, Italy</td>
			<td>ECM2001L</td>
			<td>Culture medium for MDA-MB-231 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>serological pipettes (2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL)</td>
			<td>Corning- Millipore-Sigma; St. Louis, MO</td>
			<td>CLS4486; CLS4487; CLS4488; CLS4489; CLS4490</td>
			<td>Liquid handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile tips (1-10 &#956;L, 10-20 &#956;L, 20-200 &#956;L, 1000 &#956;L)</td>
			<td>EuroClone Spa, Milan, Italy</td>
			<td>ECTD00010; ECTD00020; ECTD00200; ECTD01005</td>
			<td>tips for micropipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA</td>
			<td>15250061</td>
			<td>cell stain to assess cell viability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>EuroClone Spa, Milan, Italy</td>
			<td>ECM0920D</td>
			<td>dissociation reagent for adherent cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS-FL fluorescence microscope</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA</td>
			<td></td>
			<td>Fluorescent microscope for living cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humified cell culture incubator&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA</td>
			<td>311 Forma Direct Heat COIncubator; TC 230</td>
			<td>Incubation of cell cultures at 37 &#176;C, 5% CO2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Juli Microscope</td>
			<td>Nanoentek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory refrigerator (4 &#176;C)</td>
			<td>FDM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Safety Cabinet (Class II)</td>
			<td>Steril VBH 72 MP</td>
			<td></td>
			<td>Laminar flow hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerable centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostatic bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfabrication materials&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Aminopropyl)triethoxysilane (Aptes)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A3648</td>
			<td>silanizing agent for bonding PDMS to plastic coverslip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium quartz masks / 4&#34;x4&#34;, HRC / No AZ&#160;</td>
			<td>MB W&#38;A,&#160; Germany</td>
			<td></td>
			<td>optical masks for photolithography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip, D 263 M Schott glass,&#160; (170 &#177; 5 &#181;m)</td>
			<td>Ibidi, Germany</td>
			<td>10812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide solution 30%</td>
			<td>Carlo Erba Reagents</td>
			<td>412081</td>
			<td>reagents for piranha solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl isobutyl ketone</td>
			<td>Carlo Erba Reagents</td>
			<td>461945</td>
			<td>PMMA e-beam resist developer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Glass Slides (Pack of 50 slides) 76.2 mm x 25.4 mm&#160;</td>
			<td>Sail Brand</td>
			<td>7101</td>
			<td>substrates for bonding chips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miltex Biopsy Punch with Plunger, ID 1.0mm</td>
			<td>Tedpella</td>
			<td></td>
			<td>dermal biopsy punches for chip reservoirs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMMA&#160; 950 kDa</td>
			<td>Allresist,Germany</td>
			<td>AR-P. 679.04</td>
			<td>Positive electronic resists for patterning optical masks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymer untreated coverslips</td>
			<td>Ibidi, Germany</td>
			<td>10813</td>
			<td>substrates for bonding chips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prime CZ-Si Wafer,&#160; 4&#8221;, (100), Boron Doped</td>
			<td>Gambetti Xenologia Srl, Italy</td>
			<td>30255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propan-2-ol</td>
			<td>Carlo Erba Reagents</td>
			<td>415238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propylene glycol monomethyl ether acetate (PGMEA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>484431-4L</td>
			<td>SU-8 resists developer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 3005</td>
			<td>Micro resist technology,Germany</td>
			<td>C1.02.003-0001</td>
			<td>Negative Photoresists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 3050</td>
			<td>Micro resist technology,Germany</td>
			<td>C1.02.003-0005</td>
			<td>Negative Photoresists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suite of Biopunch, ID 4.0 mm, 6.0 mm, 8.0 mm</td>
			<td>Tedpella</td>
			<td>15111-40, 15111-60, 15111-80</td>
			<td>dermal biopsy punches for chip reservoirs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid 96%</td>
			<td>Carlo Erba Reagents</td>
			<td>410381</td>
			<td>reagents for piranha solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>Dowsil, Dow Corning</td>
			<td>11-3184-01</td>
			<td>Silicone Elastomer (PDMS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimethylchlorosilane (TMCS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>92360-100ML</td>
			<td>silanizing agent for SU-8 patterned masters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfabrication equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 kV e-beam litography</td>
			<td>Raith-Vistec EBPG 5HR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hotplate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical litography system</td>
			<td>EV-420 double-face contact mask-aligner</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reactive Ion Etching system</td>
			<td>Oxford plasmalab 80 plus system</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum dessicator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microfluidic co-culture models for dissecting the immune response in in vitro tumor microenvironments

Les modèles de maladies complexes exigent des outils de pointe capables de fournir des informations physiologiquement et pathologiquement pertinentes et exploitables, et de dévoiler des processus autrement invisibles. Des tests cellulaires avancés imitant étroitement le paysage in vivo s’imposent comme de nouvelles façons de visualiser et de mesurer l’interaction bidirectionnelle tumeur-hôte influençant la progression du cancer. Nous décrivons ici deux protocoles polyvalents pour recréer des co-cultures 2D et 3D hautement contrôlables dans des microdispositifs, imitant la complexité du microenvironnement tumoral (TME), sous immunosurveillance naturelle et induite par la thérapie. Dans la section 1, un cadre expérimental est fourni pour surveiller la diaphonie entre les cellules tumorales adhérentes et les populations immunitaires flottantes, par microscopie accélérée à champ clair. En tant que scénario applicatif, nous analysons les effets des traitements anticancéreux, tels que les inducteurs immunogènes de la mort des cellules cancéreuses sur le recrutement et l’activation des cellules immunitaires. Dans la section 2, les microenvironnements 3D immunitaires contre les tumeurs sont assemblés dans une configuration compétitive. L’infiltration immunitaire différentielle est surveillée par des instantanés de fluorescence jusqu’à 72 h, afin d’évaluer les stratégies thérapeutiques combinées. Dans les deux contextes, les étapes de traitement de l’image sont illustrées pour extraire une pléthore de paramètres des cellules immunitaires (par exemple, la migration et l’interaction des cellules immunitaires, la réponse aux agents thérapeutiques). Ces méthodes simples et puissantes peuvent être adaptées pour simuler la complexité du TME englobant l’hétérogénéité et la plasticité des sous-types de cellules cancéreuses, stromales et immunitaires, ainsi que leurs interactions réciproques en tant que moteurs de l’évolution du cancer. La conformité de ces technologies en évolution rapide avec l’imagerie à haut contenu de cellules vivantes peut conduire à la génération de grands ensembles de données informatives, ce qui pose de nouveaux défis. En effet, le triangle ''co-cultures/microscopie/analyse avancée de données'' ouvre la voie à un paramétrage précis du problème qui peut aider à des protocoles thérapeutiques sur mesure. Nous nous attendons à ce que l’intégration future de l’immunité contre le cancer sur puce avec l’intelligence artificielle pour le traitement à haut débit mette en synergie un grand pas en avant dans l’exploitation des capacités en tant qu’outils prédictifs et précliniques pour l’oncologie de précision et personnalisée.

L’infiltration immunitaire tumorale est un paramètre de la réponse antitumorale de l’hôte. Les tumeurs sont hétérogènes dans la composition, la densité, l’emplacement et l’état fonctionnel des leucocytes infiltrants dont les interactions avec les cellules cancéreuses peuvent sous-tendre des informations cliniquement pertinentes pour prédire l’évolution de la maladie et la réponse au traitement. En ce sens, les technologies microfluidiques pourraient être utilisées comme des outils in vitro complé...

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Microfluidic Co-Culture Models for Dissecting the Immune Response in in vitro Tumor Microenvironments

À l’ère de l’immunothérapie et du profilage génomique unicellulaire, la biologie du cancer nécessite de nouveaux outils in vitro et informatiques pour étudier l’interface tumorale-immunitaire dans un contexte spatio-temporel approprié. Nous décrivons des protocoles pour exploiter les co-cultures microfluidiques immunitaires contre les tumeurs dans des contextes 2D et 3D, compatibles avec la surveillance dynamique et multiparamétrique des fonctions cellulaires.

Modèles de co-culture microfluidique pour disséquer la réponse immunitaire dans des microenvironnements tumoraux in vitro

Complex disease models demand cutting-edge tools able to deliver physiologically and pathologically relevant, actionable insights, and unveil otherwise ...

Ce protocole fournit des paramètres expérimentaux pour effectuer des co-cultures 2D et 3D contrôlables dans des micro-dispositifs afin de visualiser et de surveiller les diaphonies tumorales-cellules immunitaires et d’analyser les effets des traitements anticancéreux. Cette technologie fournit une visualisation facile et en temps réel du recrutement et des interactions des cellules immunitaires et peut être utilisée pour les échantillons humains et dérivés du patient. Il est compatible avec la plupart des microscopies de pointe.Francesco Noto, doctorant au Département d’oncologie et de médecine moléculaire, Istituto Superiore di Sanita, et Nicoleta Manduca et Esther Maccafeo, doctorantes à l’Universita Cattolica del Sacro Cuore, Département de médecine translationnelle et de chirurgie, feront la démonstration de la procédure. Les puces sont préalablement activées par plasma dans un nettoyeur plasma ou une machine de gravure de fer réactive en salle blanche. Des cellules de rate murine et une lignée cellulaire tumorale sont utilisées ici pour imiter les protocoles décrits dans le texte.Avant de charger les suspensions cellulaires, retirer le média des six réservoirs. Puis chargez lentement 1 x 10 à la 5ème cellule tumorale remise en suspension dans 10 à 50 microlitres de milieu de croissance dans le réservoir supérieur gauche et le puits inférieur. Sur le côté droit, pipeter doucement 1 x 10 à la 6ème cellules immunitaires flottantes remises en suspension dans 50 microlitres de milieu de croissance dans deux puits.Lorsque toutes les cellules ont été ajoutées, remplissez les six réservoirs de chaque puce avec jusqu’à 100 à 150 microlitres de milieu de croissance et vérifiez que les cellules ont été correctement réparties dans chaque compartiment de culture. Incuber la puce pendant une heure pour permettre au système de se stabiliser avant l’enregistrement accéléré. Pour l’imagerie de cellules vivantes, montez la tumeur immunitaire sur la plaque de puce sur la scène du microscope.Personnalisez le paramètre de flux de travail d’acquisition dans l’interface du logiciel de microscope, tel que le logiciel d’analyse de cellules vivantes d’incucytes. Sélectionnez les fenêtres d’observation, la fréquence d’images optimale et la durée de temps, en fonction des paramètres appropriés pour l’expérience et les types de cellules à l’étude. Imagez les cellules pour la période expérimentale appropriée.Préparer deux aliquotes de matrigel dilué avec un milieu contenant un médicament ou une combinaison de médicaments pour les deux conditions expérimentales en utilisant des pointes froides. Pipeter doucement des cellules tumorales colorées par colorant fluorescent compatibles avec la vie en suspension dans une solution matricielle sur de la glace pour obtenir une distribution homogène des cellules. Avec la plaque de puce sur un bloc de refroidissement ou sur un panier avec de la glace, injectez lentement la solution de matrice cellulaire tumorale traitée par le médicament dans les ports de gel gauche et droit à l’aide d’embouts de micropipette froide de 10 microlitres.Appliquez une légère pression pour pousser la solution matricielle d’un côté du canal à l’autre. Lorsque toutes les cellules tumorales ont été chargées, placez le dispositif dans l’incubateur en position verticale pendant 30 minutes. À la fin de l’incubation, une fois la gélification matricielle terminée, remplissez les canaux intermédiaires des six réservoirs avec 50 microlitres de milieu de culture.Vérifiez l’intégrité du gel polymérisé et la distribution des cellules tumorales au microscope. Ensuite, placez les puces dans un incubateur jusqu’à ce que la préparation des cellules immunitaires soit terminée. Après l’incubation, aspirez le milieu de chaque puits.Placez l’embout près de l’entrée du canal moyen moyen et utilisez une pression modérée pour injecter doucement 10 microlitres de 10 à la 6ème cellule immunitaire marquée avec un colorant fluorescent contrastant. Injecter 50 à 100 microlitres du milieu dans chacun des quatre puits de canaux latéraux, 40 à 90 microlitres du milieu dans le puits central supérieur et 50 à 100 microlitres du milieu dans le puits central inférieur. Lorsque tous les puits ont été chargés, utilisez un microscope pour confirmer que la distribution des cellules immunitaires est restée confinée à la chambre centrale.Ensuite, placez soigneusement le dispositif sur une surface plane dans l’incubateur de culture cellulaire jusqu’à l’imagerie. Pour calculer l’étendue des cellules immunitaires vivantes colorées par fluorescence infiltrant les compartiments tumoraux, imagez l’appareil à des moments spécifiques d’intérêt par microscopie à fluorescence et définissez les paramètres appropriés de la caméra dans le logiciel d’imagerie au microscope, tel que Nikon NIS-Elements. Définissez également les paramètres pour les cellules immunitaires marquées.Le mouvement des leucocytes à travers des ponts microcanaux convenablement construits dans la plate-forme microfluidique vers leurs cellules cibles peut être suivi par microscopie vidéo. Dans cette analyse de suivi, les PBMC individuels ont été confrontés à la mort de cellules cancéreuses traitées à la doxorubicine ou vivantes traitées par PBS. Les valeurs de chimiotaxie pertinentes et les diagrammes de migration ont été générés automatiquement, et un profil migratoire différent pour les cellules immunitaires a été observé lorsqu’elles étaient cochargées avec des cellules cancéreuses du sein exposées à la doxorubicine ou au PBS.Lorsque les PBMC ont été confrontés à des cellules cancéreuses apoptotiques, ils ont traversé des microcanaux vers les cellules mourantes et mortes, mais n’ont pas traversé pour des cellules vivantes non traitées. Une fraction de leucocytes avec une densité croissante sur 24 à 48 heures a présenté des contacts à long terme avec des cellules cancéreuses doxo-traitées. Dans cette analyse, un nouveau modèle tumoral immunocompétent 3D a été utilisé pour quantifier le recrutement de cellules immunitaires en réponse à des combinaisons anticancéreuses de médicaments épigénétiques.Les PBMC marqués au colorant rouge ont ensuite été distribués de manière homogène dans la chambre fluidique centrale. La capacité des deux masses tumorales à attirer les PBMC a ensuite été comparée, les PBMC étant recrutés de manière robuste dans cette expérience dans le microcanal droit. Pour le modèle 3D, mélanger la solution avec de l’hydrogel et des cellules sur de la glace, en évitant les bulles et la prépolymérisation.Injectez-le lentement sans pression excessive. Ajuster les étapes de polymérisation en fonction de la matrice utilisée. Des tests de cellules vivantes / mortes et un profilage de la sécrétion de cytokines à partir de surnageants peuvent être mis en œuvre.L’immunofluorescence pour l’imagerie confocale peut être réalisée pour classer les sous-types immunitaires et pour les marqueurs d’expression de la maturation d’activation et d’épuisement.

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