Name: microfluidic co-culture models for dissecting the immune response in in vitro tumor microenvironments
Uploaded: 2021-04-30T13:00:00
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1. 接着細胞と浮遊細胞の2D共培養のためのチップ設計
注:2D共培養レイアウト(図1A-C)は、2セットのマイクロチャネルアレイ(500 x 12 x 10 μm 3、L×W×H)によって相互接続された3つのチャンバー(高さ100 μm)によって特徴付けられます。中間チャンバーは、負荷ステップ2.5の間に腫瘍部位にオー...

記載された方法は、より関連性の高いin vitroモデルの採用から利益を得ることができる腫瘍免疫学の分野における2つの重要な側面を、調節可能な程度の複雑さで再現するための一般的なアプローチを設計しようとする。1つ目は腫瘍細胞集団側に関するもので、単一細胞の特徴に取り組むことで、治療に対する耐性、転移に対するプロペンション、幹細胞、分化グレードなど、不均一性と相関...

実験分野としての医学のさまざまな分野の進化は、制御された条件下で細胞集団と臓器機能を操作する能力に依存してきました1。そのような能力は、私たちの体で起こっているプロセスを再現できる測定可能なモデルの可用性にルーツがあります。
免疫療法と単一細胞ゲノムプロファイリングの時代2において、がん生物学は、適切な時空間コンテキストで腫瘍と免疫のインターフェースを研究するために、新しいin vitroおよび計算モデルを利用する必要があります2,3。
腫瘍微小環境4(TME)は、がん細胞が継続的に相互作用し、他の細胞(免疫細胞、間質細胞、内皮細胞)および非細胞(細胞外マトリックス、ECM)成分と動的に共進化する複雑な組織です。この複雑な状況の動的な性質は、免疫細胞が悪性細胞の味方または敵として果たすかどうかを決定し、したがって、疾患の進行と治療への反応の両方に強く影響します。今日、腫瘍免疫学者、バイオインフォマティシャン、およびシステム生物学の専門家による多大な努力が集まって、空間(すなわち、異なる腫瘍領域)および時間(すなわち、異なる腫瘍進行段階)5,6のいずれかにおける癌の不均一性の臨床的意義5,6に対処し、単一細胞レベルで癌および免疫細胞の表現型および機能を特徴付けるために収束しています。この相乗効果の一例として、高度なコンピュータビジョン技術が、組織学的試料における免疫浸潤物の空間マッピングのために現在日常的に使用されている7、8。
実験モデルの最前線では、動物実験と従来のin vitro法を橋渡しし、マイクロフルイディクスと共培養技術の進歩により、オルガノイド、マイクロ生理学的システム9,10,11(MPS)、臓器オンチップ12,13,14などのさまざまなクラスのマイクロエンジニアリング細胞モデルにアクセスできます。 (OOC)。彼らは、細胞生態系の「全体像」のビューを拡大し、ハイコンテント顕微鏡15と画像処理アプローチを活用しながら、微小環境要因を制御するin vitroの可能性を拡大するという共通の特徴を共有しています。
今日、最先端のMPSおよびOOCシステムは、炎症性疾患、創傷治癒、粘膜免疫、毒素や日常の食品への反応などのさまざまなプロセスを調査および測定するために、既存の組織および共培養に免疫細胞のさまざまなサブタイプを組み込む免疫学的側面を含み始めています16。TMEオンチップモデル10、11、12、13、14、15、16、17は、灌流性マイクロ血管18、19、20、21とも統合されており、細胞型依存性相互作用、物理的および化学的摂動、および細胞毒性活性を調べるために開発されました。浸潤リンパ球22、ならびに臨床的に関連する免疫調節剤23。
ここでは、チップへの細胞のロードから画像処理ツールに至るまで、2D(セクション1)および3D(セクション2)設定16での高度な腫瘍免疫マイクロ流体共培養を活用するための汎用性の高いプロトコルを提供し、細胞機能の動的マルチパラメトリック24モニタリングおよび視覚化と互換性があります。これは、フィジーのフリーウェアソフトウェアとそのツールボックス25,26を利用して、サンプル管理とデータ分析の両方で使いやすさと柔軟性を維持しながら達成されます。
セクション1で説明したマイクロ流体デバイスは、付着性癌と浮遊免疫細胞の2D共培養を実行するように設計されています。このプラットフォームは、遺伝子変異27 および/または免疫不全28の存在下での免疫細胞の挙動のin vitro測定のために検証されました。ここでは、Trackmate(フィジーのソフトウェアに実装されているプラグイン)に基づく半自動方式を利用して、タイムラプス明視野画像で免疫細胞を追跡する手順を説明します。この手順は、免疫原性細胞死誘導因子 27 で処理されたか否かを標的とする癌細胞に対する免疫遊走29および応答(すなわち、相互作用時間)の運動学的記述子の抽出を可能にする。
重要なことに、時系列画像から抽出されたこれらのパラメータは、高度な数学機械で処理できます。このアプローチの可能性の例として、私たちのグループは最近、確率過程と統計力学からの数学的方法に基づく分析を発表し、細胞ネットワークの特性をモデル化し、免疫細胞の挙動のパラメータ化された説明を提供します(すなわち、偏ったまたは無相関のランダムウォーク、高度にまたは協調していない運動30,31)。
2番目のセクションで提供される3D設定は、共培養プロトコルに基づいており、細胞タイプと薬物の異なる組み合わせで2つのゲル領域に埋め込まれたより複雑な免疫適格TMEを競合的に再現します。ここでは、画像処理ステップは、異なる時点で、マトリゲル内で培養されたヒトA375Mメラノーマ細胞における染色免疫細胞の浸潤を測定し、抗腫瘍剤組合せ32を評価するために説明する。A375M株は、高度に転移性の表現型を特徴とするA375P由来細胞株であり、免疫細胞の存在下でのそれらの転移能を評価するために選択された32。
記載されたモデルは、異なる細胞源(マウスおよびヒト不死化または初代細胞株、オルガノイド、異種移植片など)に完全に準拠することができる。私たちの研究室の最近の研究では、ハイコンテントビデオ顕微鏡と画像分析を組み合わせることにより、競合する3Dレイアウトを適用して調査しました:i)抗腫瘍(抗体依存性細胞媒介性細胞傷害、ADCC)免疫応答と解剖HER2+ 乳がんオンチップモデル33;ii)腫瘍回避およびT細胞の動員のメカニズムにおける骨髄系細胞(すなわち、癌関連マクロファージ)の作用34;iii)コラーゲンマトリックス中の薬物処理された結腸癌細胞とともに培養されたインターフェロンα馴化樹状細胞(IFN-DC)に基づく免疫療法レジームの有効性、および効率的な運動とその後の食作用イベントを評価する35;iv)IL−33処置または未処置のメラノーマ細胞36に向かう骨髄由来好酸球の走化性遊走。
これらの高度なモデルは、がんの転移と耐性メカニズムにおける免疫コンテクスチャーの役割を理解するための観察ウィンドウとして役立つ可能性がありますが、調査結果を臨床に変換し、基礎研究とのギャップを埋めるための努力が必要です37。
新たなシナリオとして、自動化されたハイコンテント顕微鏡の力と、より生理学的に関連性のあるマイクロシステムの使用を組み合わせることで、1つの実験キャンペーンから生成できる数百、さらには数千ギガバイトのマルチパラメトリックデータの処理、処理、解釈に新たな潜在的な課題が生じています。これは、OOC実験と人工知能38,39,40,41,42(AI)ベースのアルゴリズムとの直接的なリンクを意味し、高度な自動分析と、癌と免疫の相互作用のインシリコモデルを順番にフィードできる機能の生成43、予測薬物スクリーニングアッセイの開発などのエキサイティングな新しいアプリケーション44。
拡大し続ける取り組みの流れは、疾患モデルの設計と、単一細胞マルチオミクス読み出しを備えた大規模な摂動スクリーンを実装するための戦略の最適化に焦点を当てています。これは間違いなく、免疫疾患と癌の播種メカニズムに関する新しい洞察を得るための体系的な腫瘍免疫学オンチップアプローチの開発と、できれば適切な程度の方法の標準化を伴う臨床実装に役立つでしょう。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell culture materials&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tubes</td>
			<td>Corning-Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>CLS430828</td>
			<td>centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-aza-2&#39;-deoxycytidine DAC</td>
			<td>Millipore-Sigma; St. Louis, MO</td>
			<td>A3656</td>
			<td>DNA-hypomethylating agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Corning-Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>CLS3506</td>
			<td>culture dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 cm2 cell culture treated flask</td>
			<td>Corning, New York, NY</td>
			<td>430641U</td>
			<td>culture flasks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A365M</td>
			<td>American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA</td>
			<td> 
			CVCL_B222</td>
			<td>human melanoma cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxorubicin hydrochloride</td>
			<td>Millipore-Sigma; St. Louis, MO</td>
			<td>D1515</td>
			<td>anthracycline antibiotic&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium DMEM</td>
			<td>EuroClone Spa, Milan, Italy</td>
			<td>ECM0728L</td>
			<td>Culture medium for SK-MEL-28&#160; cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffer Saline w/o Calcium w/o Magnesium</td>
			<td>EuroClone Spa, Milan, Italy</td>
			<td>ECB4004L</td>
			<td>saline buffer solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>EuroClone Spa, Milan, Italy</td>
			<td>ECS0180L</td>
			<td>ancillary for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll</td>
			<td>GE-Heathcare</td>
			<td>17-1440-02</td>
			<td>separation of mononuclear cells from human blood.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hemocytometer</td>
			<td>Neubauer</td>
			<td></td>
			<td>Cell counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparinized vials</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA</td>
			<td></td>
			<td>Vials for venous blood collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>interferon alpha-2b</td>
			<td>Millipore-Sigma; St. Louis, MO</td>
			<td>SRP4595</td>
			<td>recombinant human cytokine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 100X</td>
			<td>EuroClone Spa, Milan, Italy</td>
			<td>ECB3000D</td>
			<td>ancillary for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lympholyte cell separation media</td>
			<td>Cedarlane Labs, Burlington, Canada</td>
			<td></td>
			<td>Separation of lymphocytes by density gradient centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphoprep</td>
			<td>Axis-Shield PoC AS, Oslo, Norway</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning, New York, NY</td>
			<td>354230</td>
			<td>growth factor reduced basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231&#160;</td>
			<td>American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA</td>
			<td>&#160;HTB-26</td>
			<td>human breast cancer cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/ Streptomycin 100X&#160;&#160;</td>
			<td>EuroClone Spa, Milan, Italy</td>
			<td>ECB3001D</td>
			<td>ancillary for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet aid</td>
			<td>Drummond Scientific Co., Broomall, PA</td>
			<td>4-000-201</td>
			<td>Liquid handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKH26 Red Fluorescent cell linker</td>
			<td>Millipore-Sigma; St. Louis, MO</td>
			<td>PKH26GL</td>
			<td>red fluorescent cell dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKH67 Green fluorescent cell linker</td>
			<td>Millipore-Sigma; St. Louis, MO</td>
			<td>PKH67GL</td>
			<td>green fluorescent cell dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>EuroClone Spa, Milan, Italy</td>
			<td>ECM2001L</td>
			<td>Culture medium for MDA-MB-231 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>serological pipettes (2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL)</td>
			<td>Corning- Millipore-Sigma; St. Louis, MO</td>
			<td>CLS4486; CLS4487; CLS4488; CLS4489; CLS4490</td>
			<td>Liquid handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile tips (1-10 &#956;L, 10-20 &#956;L, 20-200 &#956;L, 1000 &#956;L)</td>
			<td>EuroClone Spa, Milan, Italy</td>
			<td>ECTD00010; ECTD00020; ECTD00200; ECTD01005</td>
			<td>tips for micropipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA</td>
			<td>15250061</td>
			<td>cell stain to assess cell viability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>EuroClone Spa, Milan, Italy</td>
			<td>ECM0920D</td>
			<td>dissociation reagent for adherent cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS-FL fluorescence microscope</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA</td>
			<td></td>
			<td>Fluorescent microscope for living cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humified cell culture incubator&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA</td>
			<td>311 Forma Direct Heat COIncubator; TC 230</td>
			<td>Incubation of cell cultures at 37 &#176;C, 5% CO2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Juli Microscope</td>
			<td>Nanoentek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory refrigerator (4 &#176;C)</td>
			<td>FDM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Safety Cabinet (Class II)</td>
			<td>Steril VBH 72 MP</td>
			<td></td>
			<td>Laminar flow hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerable centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostatic bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfabrication materials&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Aminopropyl)triethoxysilane (Aptes)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A3648</td>
			<td>silanizing agent for bonding PDMS to plastic coverslip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium quartz masks / 4&#34;x4&#34;, HRC / No AZ&#160;</td>
			<td>MB W&#38;A,&#160; Germany</td>
			<td></td>
			<td>optical masks for photolithography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip, D 263 M Schott glass,&#160; (170 &#177; 5 &#181;m)</td>
			<td>Ibidi, Germany</td>
			<td>10812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide solution 30%</td>
			<td>Carlo Erba Reagents</td>
			<td>412081</td>
			<td>reagents for piranha solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl isobutyl ketone</td>
			<td>Carlo Erba Reagents</td>
			<td>461945</td>
			<td>PMMA e-beam resist developer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Glass Slides (Pack of 50 slides) 76.2 mm x 25.4 mm&#160;</td>
			<td>Sail Brand</td>
			<td>7101</td>
			<td>substrates for bonding chips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miltex Biopsy Punch with Plunger, ID 1.0mm</td>
			<td>Tedpella</td>
			<td></td>
			<td>dermal biopsy punches for chip reservoirs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMMA&#160; 950 kDa</td>
			<td>Allresist,Germany</td>
			<td>AR-P. 679.04</td>
			<td>Positive electronic resists for patterning optical masks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymer untreated coverslips</td>
			<td>Ibidi, Germany</td>
			<td>10813</td>
			<td>substrates for bonding chips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prime CZ-Si Wafer,&#160; 4&#8221;, (100), Boron Doped</td>
			<td>Gambetti Xenologia Srl, Italy</td>
			<td>30255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propan-2-ol</td>
			<td>Carlo Erba Reagents</td>
			<td>415238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propylene glycol monomethyl ether acetate (PGMEA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>484431-4L</td>
			<td>SU-8 resists developer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 3005</td>
			<td>Micro resist technology,Germany</td>
			<td>C1.02.003-0001</td>
			<td>Negative Photoresists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 3050</td>
			<td>Micro resist technology,Germany</td>
			<td>C1.02.003-0005</td>
			<td>Negative Photoresists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suite of Biopunch, ID 4.0 mm, 6.0 mm, 8.0 mm</td>
			<td>Tedpella</td>
			<td>15111-40, 15111-60, 15111-80</td>
			<td>dermal biopsy punches for chip reservoirs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid 96%</td>
			<td>Carlo Erba Reagents</td>
			<td>410381</td>
			<td>reagents for piranha solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>Dowsil, Dow Corning</td>
			<td>11-3184-01</td>
			<td>Silicone Elastomer (PDMS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimethylchlorosilane (TMCS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>92360-100ML</td>
			<td>silanizing agent for SU-8 patterned masters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfabrication equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 kV e-beam litography</td>
			<td>Raith-Vistec EBPG 5HR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hotplate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical litography system</td>
			<td>EV-420 double-face contact mask-aligner</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reactive Ion Etching system</td>
			<td>Oxford plasmalab 80 plus system</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum dessicator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microfluidic co-culture models for dissecting the immune response in in vitro tumor microenvironments

複雑な疾患モデルには、生理学的および病理学的に関連する実用的な洞察を提供し、他の方法では目に見えないプロセスを明らかにすることができる最先端のツールが必要です。in vivoの風景を厳密に模倣した高度な細胞アッセイは、がんの進行に影響を与える双方向の腫瘍と宿主の相互作用を視覚化および測定するための新しい方法としての地位を確立しています。ここでは、自然および治療誘発性の免疫監視下で、腫瘍微小環境(TME)の複雑さを模倣して、マイクロデバイスで高度に制御可能な2Dおよび3D共培養を再現するための2つの汎用性の高いプロトコルについて説明します。セクション1では、明視野タイムラプス顕微鏡によって、接着性腫瘍細胞と浮遊免疫集団との間のクロストークを監視するための実験設定が提供されます。応用シナリオとして、免疫原性がん細胞死誘導剤などの抗がん治療が免疫細胞の動員と活性化に及ぼす影響を解析します。セクション2では、3D腫瘍免疫微小環境が競争力のあるレイアウトで組み立てられています。免疫浸潤の違いは、組み合わせ治療戦略を評価するために、最大72時間の蛍光スナップショットによって監視されます。両方の設定において、多数の免疫細胞パラメータ(例えば、免疫細胞の移動および相互作用、治療薬への応答)を抽出するための画像処理ステップが図示される。これらのシンプルで強力な方法は、がん、間質細胞、免疫細胞のサブタイプの不均一性と可塑性、およびがん進化のドライバーとしてのそれらの相互相互作用を含むTMEの複雑さをシミュレートするようにさらに調整できます。これらの急速に進化する技術を生細胞ハイコンテントイメージングに準拠させることは、大規模な有益なデータセットの生成につながり、新たな課題をもたらす可能性があります。実際、「共培養/顕微鏡/高度なデータ分析」という三角形は、オーダーメイドの治療プロトコルを支援する可能性のある正確な問題パラメータ化への道筋を設定します。将来的には、がん免疫オンチップと人工知能を統合してハイスループット処理を行うことで、精密でパーソナライズされた腫瘍学のための予測および前臨床ツールとしての能力を活用する上で大きな一歩が相乗効果を発揮できると期待しています。

腫瘍免疫浸潤は、宿主抗腫瘍応答のパラメータである。腫瘍は、浸潤白血球の組成、密度、位置、および機能状態において不均一であり、癌細胞との相互作用は、疾患の経過および治療への反応を予測するための臨床的関連情報の根底にある可能性があります。この意味で、マイクロ流体技術は、腫瘍の免疫コンテクスチャーを探索し、抗がん療法に対する反応を監視するための補完的で特?...

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Microfluidic Co-Culture Models for Dissecting the Immune Response in in vitro Tumor Microenvironments

免疫療法と単一細胞ゲノムプロファイリングの時代において、がん生物学は、適切な時空間コンテキストで腫瘍と免疫のインターフェースを研究するための新しいin vitroおよび計算ツールを必要としています。2Dおよび3D設定での腫瘍免疫マイクロ流体共培養を活用するためのプロトコルについて説明し、細胞機能の動的マルチパラメトリックモニタリングと互換性があります。

in vitro腫瘍微小環境における免疫応答を解剖するためのマイクロ流体共培養モデル

Complex disease models demand cutting-edge tools able to deliver physiologically and pathologically relevant, actionable insights, and unveil otherwise ...

このプロトコルは、マイクロデバイスで制御可能な2Dおよび3D共培養を実行して、腫瘍免疫細胞のクロストークを視覚化および監視し、抗がん治療の効果を分析するための実験設定を提供します。この技術は、免疫細胞の動員と相互作用をリアルタイムで簡単に視覚化し、ヒトおよび患者由来のサンプルに使用できます。ほとんどの最先端の顕微鏡と互換性があります。手順を実演するのは、サニータ・スペリオーレ・ディ・サニータ腫瘍学分子医学科の博士課程の学生であるフランチェスコ・ノートーと、トランスレーショナルメディシンおよび外科のカトリック大学サクロクオーレ大学の博士課程の学生であるニコレタ・マンドゥカとエスター・マカフェオです。チップは、クリーンルーム内のプラズマクリーナーまたは反応性鉄エッチング装置でプラズマ活性化されます。マウス脾臓細胞および腫瘍細胞株は、本文に記載されているプロトコルを模倣するためにここで使用されます。細胞懸濁液をロードする前に、6つのリザーバーすべてから培地を取り出してください。次に、10〜50マイクロリットルの増殖培地に再懸濁した5番目の腫瘍細胞に1 x 10を左上のリザーバーと下部ウェルにゆっくりとロードします。右側で、50マイクロリットルの増殖培地に再懸濁した6番目の浮遊免疫細胞に1 x 10を2つのウェルに静かにピペットで入れます。すべての細胞を添加したら、各チップの6つのリザーバーすべてを最大100〜150マイクロリットルの増殖培地で満たし、細胞が各培養コンパートメント内に正しく分布していることを確認します。チップを1時間インキュベートして、タイムラプス記録の前にシステムを安定させます。生細胞イメージングの場合は、顕微鏡ステージのチッププレートに腫瘍免疫を取り付けます。Incucyte生細胞解析ソフトウェアなどの顕微鏡ソフトウェアインターフェイスで取得ワークフロー設定をカスタマイズします。観察ウィンドウ、最適なフレームレート、および期間を、実験および研究中の細胞タイプの適切なパラメータに応じて選択します。適切な実験期間の細胞を画像化する。コールドチップを使用して、2つの実験条件のために薬物または薬物の組み合わせを含む培地で希釈したマトリゲルの2つのアリコートを調製します。氷上のマトリックス溶液に懸濁したライブ適合性の蛍光色素染色腫瘍細胞を穏やかにピペットでピペットし、細胞の均一な分布を得ました。チッププレートを冷却ブロックまたは氷の入ったバスケットに置いた状態で、冷たい10マイクロリットルのマイクロピペットチップを使用して、薬物処理された腫瘍細胞マトリックス溶液を左右のゲルポートにゆっくりと注入します。穏やかな圧力を加えて、マトリックス溶液をチャネルの一方の側からもう一方の側に押します。すべての腫瘍細胞がロードされたら、装置を直立位置のインキュベーターに30分間置きます。インキュベーションの最後に、マトリックスのゲル化が完了したら、6つのリザーバーすべての培地チャネルを50マイクロリットルの培地で満たします。重合ゲルの完全性と腫瘍細胞の分布を顕微鏡で確認します。次に、免疫細胞の準備が完了するまでチップをインキュベーターに入れます。インキュベーション後、各ウェルから培地を吸引する。先端を中央培地チャネルの入口の近くに置き、適度な圧力を使用して、対照的な蛍光色素で標識された6番目の免疫細胞に10個の10マイクロリットルを静かに注入します。50〜100マイクロリットルの培地を横方向チャネルの4つのウェルのそれぞれに注入し、40〜90マイクロリットルの培地を上部中央ウェルに、および50〜100マイクロリットルの培地を下部中央ウェルに注入する。すべてのウェルがロードされたら、顕微鏡を使用して、免疫細胞の分布が中央チャンバーに限定されたままであることを確認します。次に、イメージングするまで、細胞培養インキュベーター内の平らな面にデバイスを慎重に置きます。腫瘍区画に浸潤する蛍光染色された生免疫細胞の程度を計算するには、蛍光顕微鏡によって特定の時間関心のあるポイントでデバイスをイメージングし、Nikon NIS-Elementsなどの顕微鏡イメージングソフトウェアで適切なカメラパラメーターを設定します。標識された免疫細胞のパラメータも設定します。マイクロ流体プラットフォーム内に適切に構築されたマイクロチャネルブリッジを通って標的細胞に向かう白血球の動きは、ビデオ顕微鏡によって追跡することができる。この追跡分析では、個々のPBMCは、死にかけているドキソルビシン処理または生きたPBS処理された癌細胞に挑戦しました。関連する走化性値と遊走プロットが自動的に生成され、ドキソルビシンまたはPBSに曝露された乳がん細胞と同時負荷した場合、免疫細胞の異なる遊走プロファイルが観察されました。PBMCがアポトーシス癌細胞に直面したとき、それらは死にかけている細胞と死んだ細胞に向かってマイクロチャネルを通過しましたが、生きている未処理の細胞には交差しませんでした。24〜48時間にわたって密度が増加した白血球の一部は、ドキソ処理された癌細胞との長期接触を示した。この分析では、新しい3D免疫適格腫瘍モデルを使用して、エピジェネティック薬の抗がん剤の組み合わせに応答する免疫細胞の動員を定量化しました。次に、赤色染料標識PBMCを中央の流体チャンバーに均一に分配しました。次に、2つの腫瘍塊がPBMCを引き付ける能力を比較し、この実験でPBMCを右側のマイクロチャネルに堅牢に採用しました。3Dモデルの場合、溶液をヒドロゲルとセルを氷上で混合し、気泡や予備重合を避けます。過度の圧力をかけずにゆっくりと注入します。使用するマトリックスに応じて重合ステップを調整します。生細胞/死細胞アッセイおよび上清からのサイトカイン分泌プロファイリングを実施できます。共焦点イメージングのための免疫蛍光は、免疫サブタイプを分類し、活性化および枯渇成熟の発現マーカーのために行うことができる。

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A complex interaction between the immune response and  host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in  particular, is known ...

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

使用肺炎球菌植民に対するプロバイオティクスの影響を調査<em&gt;体外</em&gt;接着アッセイ

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

Dissecting Innate Immune Signaling in Viral Evasion of Cytokine Production

サイトカイン産生のウイルス回避における先天性免疫シグナルを解剖

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

マウスマクロファージにおける先天性免疫応答を調査するために、RNA干渉を使用

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

西ナイルウイルス変異株の感染に対するMyD88非介在細胞性免疫応答のインビトロ分析

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Dissecting Multi-protein Signaling Complexes by Bimolecular Complementation Affinity Purification (BiCAP)

Dissecting Multi-protein Signaling Complexes by Bimolecular Complementation Affinity Purification BiCAP

解離性個体の親和性の浄化 (BiCAP) によって多蛋白質シグナリング複合体

The assembly of protein complexes is a central mechanism underlying the regulation of many cell signaling pathways. A major focus of biomedical research ...

Two-photon Intravital Imaging of Leukocytes During the Immune Response in Lipopolysaccharide-treated Mouse Liver

リポ多糖投与マウス肝臓における免疫応答時に白血球の二光子励起生体イメージング

Sepsis is a type of severe infection that can cause organ failure and tissue damage. Although the mortality and morbidity rates associated with sepsis are ...