Name: microfluidic co-culture models for dissecting the immune response in in vitro tumor microenvironments
Uploaded: 2021-04-30T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Co-Culture Models for Dissecting the Immune Response in in vitro Tumor Microenvironments at JoVE.com

1. 부착 및 부유 세포 2D 공동 배양을 위한 칩 설계
참고: 2D 공동 배양 레이아웃(그림 1A-C)은 두 세트의 마이크로채널 어레이(500 x 12 x 10μm 3, L×W×H)로 상호 연결된3개의 챔버(높이 100μm)가 특징입니다. 중간 챔버는 로딩 단계 2.5 동안 종양 부위로 넘쳐 흐르는 부유 면역 세포를 차단하는 두 개...

설명된 방법은 보다 관련성이 높은 시험관 내 모델의 채택으로 이점을 얻을 수 있는 종양 면역학 분야의 두 가지 중요한 측면을 조정 가능한 복잡성으로 요약하기 위한 일반적인 접근 방식을 설계하려고 합니다. 첫 번째는 종양 세포 집단 측면과 관련이 있으며, 단일 세포 특성을 다루면 치료에 대한 내성, 전이에 대한 성향, 줄기 세포 및 분화 등급을 포함하여 이질성과 상관관계가 있는 생물학적...

실험 분야로서의 다양한 의학 분야의 진화는 통제된 조건 하에서 세포 집단과 장기 기능을 조작하는 능력에 달려 있다1. 이러한 능력은 우리 몸에서 일어나는 과정을 요약할 수 있는 측정 가능한 모델의 가용성에 뿌리를 두고 있습니다.
면역요법 및 단세포 게놈 프로파일링 2의 시대에, 암 생물학은 적절한 시공간적 맥락에서 종양-면역 인터페이스를 조사하기 위해 새로운 시험관 내 및 전산 모델을 활용해야 합니다 2,3.
종양미세환경4(TME)는 암세포가 다른 세포(면역, 기질 및 내피 세포) 및 비세포(세포외 기질, ECM) 구성 요소와 지속적으로 상호 작용하고 동적으로 공동 진화하는 복잡한 조직입니다. 이 복잡한 환경의 역동적인 특성은 면역 세포가 악성 세포의 친구 역할을 하는지 아니면 적으로 작용하는지 여부를 결정하여 질병 진행과 치료에 대한 반응 모두에 큰 영향을 미칩니다. 오늘날, 종양 면역학자, 생물 정보학자 및 시스템 생물학 전문가들의 많은 노력이 공간(즉, 뚜렷한 종양 영역)과 시간(즉, 뚜렷한 종양 진행 단계)5,6에서 암 이질성5,6의 임상적 중요성을 다루고, 단일 세포 수준에서 암과 면역 세포 표현형과 기능을 특성화하기 위해 수렴되고 있습니다. 이러한 시너지 효과의 예로서, 진보된 컴퓨터 비전 기술은 이제 조직학적 샘플에서 면역 침윤물의 공간 매핑을 위해 일상적으로 사용된다 7,8.
실험 모델의 전면에서 동물 연구와 전통적인 체외 방법을 연결하는 미세 유체 공학 및 공동 배양 기술의 발전은 오가노이드, 미세 생리학적 시스템 9,10,11(MPS) 및 장기 칩12,13,14과 같은 다양한 종류의 미세 공학 세포 모델에 대한 액세스를 제공합니다 (OOC)입니다. 이들은 세포 생태계에 대한 '큰 그림'을 확대하고 미시 환경 요인을 제어하기 위해 체외 잠재력을 확장하는 동시에 고함량 현미경15 및 이미지 처리 접근 방식을 활용하는 공통된 특성을 공유합니다.
오늘날 최첨단 MPS 및 OOC 시스템은 염증성 질환, 상처 치유, 점막 면역, 독소 또는 일상 식품에 대한 반응과 같은 다양한 과정을 탐색하고 측정하기 위해 기존 조직 및 공동 배양에 다양한 면역 세포 하위 유형을 통합하는 면역학적 측면을 포함하기 시작했습니다16. TME-on-a-chip 모델 10,11,12,13,14,15,16,17은 또한 관류 가능한 미세 혈관 18,19,20,21과 통합되어 세포 유형 의존적 상호 작용, 물리적 및 화학적 섭동 및 세포 독성 활성을 조사하기 위해 개발되었습니다. 침윤성 림프구22 및 임상적으로 관련된 면역조절제23.
여기에서는 칩에 세포를 로딩하는 것부터 이미지 처리 도구에 이르기까지 다양한 프로토콜을 제공하여 2D(섹션 1) 및 3D(섹션 2) 설정(16)에서 고급 종양 면역 미세유체 공동 배양을 활용하며, 동적 다중 매개변수24 모니터링 및 세포 기능 시각화와 호환됩니다. 이는 샘플 관리 및 데이터 분석 모두에서 사용 용이성과 유연성을 유지하여 피지 프리웨어 소프트웨어와 해당 도구 상자25,26을 활용하여 달성됩니다.
섹션 1에 설명된 미세유체 장치는 부착성 암과 부유 면역 세포의 2D 공동 배양을 수행하도록 설계되었습니다. 이 플랫폼은 유전적 돌연변이27 및/ 또는 면역 결핍28의 존재 하에서 면역 세포 행동의 시험관 내 측정을 위해 검증되었다. 여기에서는 Trackmate(피지 소프트웨어에 구현된 플러그인)를 기반으로 하는 반자동 방법을 활용하여 타임랩스 명시야 이미지에서 면역 세포를 추적하는 단계를 설명합니다. 이 절차는 면역원성 세포 사멸 유도제( 27 )로 치료되거나 치료되지 않은 표적 암세포에 대한 면역 이동(29) 및 반응(즉, 상호작용 시간)의 운동학적 설명자의 추출을 가능하게 한다.
중요한 것은 시계열 이미지에서 추출된 이러한 매개변수가 고급 수학 기계로 처리될 수 있다는 것입니다. 이 접근법의 잠재력에 대한 예로서, 우리 그룹은 최근 확률 론적 과정과 통계 역학의 수학적 방법을 기반으로 한 분석을 발표하여 세포 네트워크 속성을 모델링하고 면역 세포 행동에 대한 매개 변수화 된 설명을 제공합니다 (즉, 편향되거나 상관 관계가 없는 랜덤 워크, 고도로 조정되거나 조정되지 않은 움직임30,31).
두 번째 섹션에서 제공되는 3D 설정은 공동 배양 프로토콜을 기반으로 하여 서로 다른 세포 유형과 약물 조합을 사용하여 두 개의 겔 영역에 내장된 보다 복잡한 면역 적격 TME를 경쟁력 있는 방식으로 재현합니다. 여기서, 이미지 처리 단계는, 상이한 시점에서, 마트리겔 내에서 배양된 인간 A375M 흑색종 세포에서 염색된 면역 세포의 침윤을 측정하여, 항종양제 조합을 평가하기 위한 것이다32. A375M 계통은, 고도의 전이성 표현형을 특징으로 하는 A375P 유래 세포주를 면역세포의 존재 하에서 이들의 전이능을 평가하기 위해 선택하였다32.
기술된 모델은 상이한 세포 공급원(쥐 및 인간 불멸화 또는 1차 세포주, 오가노이드, 이종이식 등)과 완전히 호환될 수 있다. 우리 연구실의 최근 연구에서, 고함량 비디오 현미경과 이미지 분석을 결합하여, 경쟁력 있는 3D 레이아웃을 적용하여 조사하였다: i) 항종양성(항체 의존성 세포 매개 세포독성, ADCC) 면역 반응 및 HER2+ 유방암 온칩 모델33에서 트라스투주맙 요법에 대한 내성에서 섬유아세포의 역할 해부; ii) 종양 회피 및 T 세포 모집 메커니즘에서 골수 세포(즉, 암 관련 대식세포)의 작용34; iii) 콜라겐 매트릭스에서 약물 처리된 결장암 세포로 배양된 인터페론-α 조절 수지상 세포(IFN-DC)를 기반으로 하는 면역요법 요법의 효능 및 효율적인 운동 및 후속 식균 작용 사건을 평가하기 위한35; iv) 골수 유래 호산구의 IL-33 처리 또는 처리되지 않은 흑색종 세포로의 화학주성 이동36.
이러한 고급 모델은 암 전이 및 내성 메커니즘에서 면역 조직 구성의 역할을 이해하기 위한 관찰 창 역할을 할 수 있지만, 연구 결과를 임상으로 변환하여 기초 연구와의 격차를 좁히기 위한 노력이 필요합니다37.
새로운 시나리오로서, 보다 생리학적으로 관련성이 높은 마이크로시스템의 사용과 결합된 자동화된 고함량 현미경의 기능을 활용하는 것은 단일 실험 캠페인에서 생성할 수 있는 수백, 수천 기가바이트의 다중 매개변수 데이터를 처리, 처리 및 해석하는 데 있어 새로운 잠재적 과제를 제시하고 있습니다. 이는 OOC 실험과 인공 지능 38,39,40,41,42 (AI) 기반 알고리즘 모두의 직접적인 연결을 의미하며, 고급 자동화 분석 및 암-면역 상호작용의 인실리코 모델(in silico model)을 차례로 공급할 수 있는 특징의 생성(43)과 예측 약물 스크리닝 분석(predictive drug screening assay)44의 개발과 같은 흥미진진한 새로운 응용 분야가 지평선에 있습니다.
끊임없이 확장되는 노력의 흐름은 단일 세포 다중 오믹스 판독을 통해 대규모 섭동 스크리닝을 구현하기 위한 전략의 최적화와 함께 질병 모델의 설계에 초점을 맞추고 있습니다. 이것은 의심할 여지 없이 면역 장애 및 암 전파 메커니즘에 대한 새로운 통찰력을 얻기 위한 체계적인 onco-immunology-on-a-chip 접근 방식의 적절한 수준의 방법 표준화와 함께 임상 구현에 도움이 될 것입니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell culture materials&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tubes</td>
			<td>Corning-Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>CLS430828</td>
			<td>centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-aza-2&#39;-deoxycytidine DAC</td>
			<td>Millipore-Sigma; St. Louis, MO</td>
			<td>A3656</td>
			<td>DNA-hypomethylating agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Corning-Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>CLS3506</td>
			<td>culture dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 cm2 cell culture treated flask</td>
			<td>Corning, New York, NY</td>
			<td>430641U</td>
			<td>culture flasks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A365M</td>
			<td>American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA</td>
			<td> 
			CVCL_B222</td>
			<td>human melanoma cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxorubicin hydrochloride</td>
			<td>Millipore-Sigma; St. Louis, MO</td>
			<td>D1515</td>
			<td>anthracycline antibiotic&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium DMEM</td>
			<td>EuroClone Spa, Milan, Italy</td>
			<td>ECM0728L</td>
			<td>Culture medium for SK-MEL-28&#160; cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffer Saline w/o Calcium w/o Magnesium</td>
			<td>EuroClone Spa, Milan, Italy</td>
			<td>ECB4004L</td>
			<td>saline buffer solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>EuroClone Spa, Milan, Italy</td>
			<td>ECS0180L</td>
			<td>ancillary for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll</td>
			<td>GE-Heathcare</td>
			<td>17-1440-02</td>
			<td>separation of mononuclear cells from human blood.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hemocytometer</td>
			<td>Neubauer</td>
			<td></td>
			<td>Cell counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparinized vials</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA</td>
			<td></td>
			<td>Vials for venous blood collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>interferon alpha-2b</td>
			<td>Millipore-Sigma; St. Louis, MO</td>
			<td>SRP4595</td>
			<td>recombinant human cytokine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 100X</td>
			<td>EuroClone Spa, Milan, Italy</td>
			<td>ECB3000D</td>
			<td>ancillary for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lympholyte cell separation media</td>
			<td>Cedarlane Labs, Burlington, Canada</td>
			<td></td>
			<td>Separation of lymphocytes by density gradient centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphoprep</td>
			<td>Axis-Shield PoC AS, Oslo, Norway</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning, New York, NY</td>
			<td>354230</td>
			<td>growth factor reduced basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231&#160;</td>
			<td>American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA</td>
			<td>&#160;HTB-26</td>
			<td>human breast cancer cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/ Streptomycin 100X&#160;&#160;</td>
			<td>EuroClone Spa, Milan, Italy</td>
			<td>ECB3001D</td>
			<td>ancillary for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet aid</td>
			<td>Drummond Scientific Co., Broomall, PA</td>
			<td>4-000-201</td>
			<td>Liquid handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKH26 Red Fluorescent cell linker</td>
			<td>Millipore-Sigma; St. Louis, MO</td>
			<td>PKH26GL</td>
			<td>red fluorescent cell dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKH67 Green fluorescent cell linker</td>
			<td>Millipore-Sigma; St. Louis, MO</td>
			<td>PKH67GL</td>
			<td>green fluorescent cell dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>EuroClone Spa, Milan, Italy</td>
			<td>ECM2001L</td>
			<td>Culture medium for MDA-MB-231 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>serological pipettes (2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL)</td>
			<td>Corning- Millipore-Sigma; St. Louis, MO</td>
			<td>CLS4486; CLS4487; CLS4488; CLS4489; CLS4490</td>
			<td>Liquid handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile tips (1-10 &#956;L, 10-20 &#956;L, 20-200 &#956;L, 1000 &#956;L)</td>
			<td>EuroClone Spa, Milan, Italy</td>
			<td>ECTD00010; ECTD00020; ECTD00200; ECTD01005</td>
			<td>tips for micropipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA</td>
			<td>15250061</td>
			<td>cell stain to assess cell viability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>EuroClone Spa, Milan, Italy</td>
			<td>ECM0920D</td>
			<td>dissociation reagent for adherent cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS-FL fluorescence microscope</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA</td>
			<td></td>
			<td>Fluorescent microscope for living cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humified cell culture incubator&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA</td>
			<td>311 Forma Direct Heat COIncubator; TC 230</td>
			<td>Incubation of cell cultures at 37 &#176;C, 5% CO2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Juli Microscope</td>
			<td>Nanoentek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory refrigerator (4 &#176;C)</td>
			<td>FDM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Safety Cabinet (Class II)</td>
			<td>Steril VBH 72 MP</td>
			<td></td>
			<td>Laminar flow hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerable centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostatic bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfabrication materials&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Aminopropyl)triethoxysilane (Aptes)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A3648</td>
			<td>silanizing agent for bonding PDMS to plastic coverslip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium quartz masks / 4&#34;x4&#34;, HRC / No AZ&#160;</td>
			<td>MB W&#38;A,&#160; Germany</td>
			<td></td>
			<td>optical masks for photolithography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip, D 263 M Schott glass,&#160; (170 &#177; 5 &#181;m)</td>
			<td>Ibidi, Germany</td>
			<td>10812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide solution 30%</td>
			<td>Carlo Erba Reagents</td>
			<td>412081</td>
			<td>reagents for piranha solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl isobutyl ketone</td>
			<td>Carlo Erba Reagents</td>
			<td>461945</td>
			<td>PMMA e-beam resist developer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Glass Slides (Pack of 50 slides) 76.2 mm x 25.4 mm&#160;</td>
			<td>Sail Brand</td>
			<td>7101</td>
			<td>substrates for bonding chips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miltex Biopsy Punch with Plunger, ID 1.0mm</td>
			<td>Tedpella</td>
			<td></td>
			<td>dermal biopsy punches for chip reservoirs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMMA&#160; 950 kDa</td>
			<td>Allresist,Germany</td>
			<td>AR-P. 679.04</td>
			<td>Positive electronic resists for patterning optical masks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymer untreated coverslips</td>
			<td>Ibidi, Germany</td>
			<td>10813</td>
			<td>substrates for bonding chips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prime CZ-Si Wafer,&#160; 4&#8221;, (100), Boron Doped</td>
			<td>Gambetti Xenologia Srl, Italy</td>
			<td>30255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propan-2-ol</td>
			<td>Carlo Erba Reagents</td>
			<td>415238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propylene glycol monomethyl ether acetate (PGMEA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>484431-4L</td>
			<td>SU-8 resists developer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 3005</td>
			<td>Micro resist technology,Germany</td>
			<td>C1.02.003-0001</td>
			<td>Negative Photoresists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 3050</td>
			<td>Micro resist technology,Germany</td>
			<td>C1.02.003-0005</td>
			<td>Negative Photoresists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suite of Biopunch, ID 4.0 mm, 6.0 mm, 8.0 mm</td>
			<td>Tedpella</td>
			<td>15111-40, 15111-60, 15111-80</td>
			<td>dermal biopsy punches for chip reservoirs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid 96%</td>
			<td>Carlo Erba Reagents</td>
			<td>410381</td>
			<td>reagents for piranha solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>Dowsil, Dow Corning</td>
			<td>11-3184-01</td>
			<td>Silicone Elastomer (PDMS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimethylchlorosilane (TMCS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>92360-100ML</td>
			<td>silanizing agent for SU-8 patterned masters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfabrication equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 kV e-beam litography</td>
			<td>Raith-Vistec EBPG 5HR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hotplate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical litography system</td>
			<td>EV-420 double-face contact mask-aligner</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reactive Ion Etching system</td>
			<td>Oxford plasmalab 80 plus system</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum dessicator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microfluidic co-culture models for dissecting the immune response in in vitro tumor microenvironments

복잡한 질병 모델에는 생리학적, 병리학적으로 관련성이 있고 실행 가능한 통찰력을 제공하고 다른 방법으로는 보이지 않는 프로세스를 공개할 수 있는 최첨단 도구가 필요합니다. 생체 내 풍경을 밀접하게 모방한 고급 세포 분석은 암의 진행에 영향을 미치는 양방향 종양-숙주 상호작용을 시각화하고 측정하는 새로운 방법으로 자리 잡고 있습니다. 여기에서는 자연 및 치료 유발 면역 감시 하에서 종양 미세 환경(TME)의 복잡성을 모방하여 마이크로 장치에서 고도로 제어 가능한 2D 및 3D 공동 배양을 재현하는 두 가지 다목적 프로토콜에 대해 설명합니다. 섹션 1에서는 명시야 타임랩스 현미경으로 부착 종양 세포와 부유 면역 집단 간의 누화를 모니터링하기 위한 실험 설정이 제공됩니다. 적용 시나리오로서, 우리는 면역 세포의 모집 및 활성화에 대한 소위 면역 원성 암세포 사멸 유도제와 같은 항암 치료의 효과를 분석합니다. 섹션 2에서는 3D 종양 면역 미세 환경이 경쟁력 있는 레이아웃으로 조립됩니다. 차등 면역 침윤은 최대 72시간의 형광 스냅샷으로 모니터링되어 병용 치료 전략을 평가합니다. 두 설정 모두에서, 과다한 면역 세포 파라미터(예를 들어, 면역 세포 이동 및 상호작용, 치료제에 대한 반응)를 추출하기 위한 이미지 처리 단계가 예시된다. 이러한 간단하고 강력한 방법은 암, 기질 및 면역 세포 아형의 이질성과 가소성뿐만 아니라 암 진화의 동인으로서의 상호 상호 작용을 포함하는 TME의 복잡성을 시뮬레이션하기 위해 추가로 맞춤화될 수 있습니다. 빠르게 진화하는 기술을 라이브 셀 고함량 이미징과 함께 사용하면 대규모 정보 데이터 세트가 생성되어 새로운 문제가 발생할 수 있습니다. 실제로 삼각형 ''공동 배양/현미경/고급 데이터 분석'은 맞춤형 치료 프로토콜을 지원할 수 있는 정확한 문제 매개변수화를 향한 경로를 설정합니다. 우리는 고처리량 처리를 위한 인공 지능과 암 면역 온어칩의 향후 통합이 정밀 및 개인화된 종양학을 위한 예측 및 전임상 도구로서의 기능을 활용하는 데 있어 큰 진전을 이룰 것으로 기대합니다.

종양 면역 침윤은 숙주 항종양 반응의 파라미터이다. 종양은 침윤 백혈구의 구성, 밀도, 위치 및 기능적 상태에서 이질적이며, 암세포와의 상호 작용은 질병 경과 및 치료에 대한 반응을 예측하기 위해 임상적으로 관련된 정보의 기초가 될 수 있습니다. 이러한 의미에서 미세유체 기술은 종양의 면역 조직을 탐색하고 항암 요법에 대한 반응을 모니터링하기 위한 보완적이고 특권적인 체외 도구로 ...

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Microfluidic Co-Culture Models for Dissecting the Immune Response in in vitro Tumor Microenvironments

면역 요법 및 단일 세포 게놈 프로파일링 시대에 암 생물학은 적절한 시공간 맥락에서 종양-면역 인터페이스를 조사하기 위한 새로운 시험관 내 및 전산 도구를 필요로 합니다. 우리는 2D 및 3D 설정에서 종양 면역 미세유체 공동 배양을 활용하기 위한 프로토콜을 설명하며, 세포 기능의 동적 다중 매개변수 모니터링과 호환됩니다.

in vitro 종양 미세환경에서 면역 반응을 해부하기 위한 미세유체 공동 배양 모델

Complex disease models demand cutting-edge tools able to deliver physiologically and pathologically relevant, actionable insights, and unveil otherwise ...

이 프로토콜은 종양-면역 세포 누화를 시각화 및 모니터링하고 항암 치료의 효과를 분석하기 위해 마이크로 장치에서 제어 가능한 2D 및 3D 공동 배양을 수행하는 실험 설정을 제공합니다. 이 기술은 면역 세포 모집 및 상호 작용에 대한 실시간의 쉬운 시각화를 제공하며 인간 및 환자 유래 샘플에 사용할 수 있습니다. 대부분의 최첨단 현미경과 호환됩니다.이 절차를 시연하는 것은 종양학 및 분자 의학과의 박사 과정 학생인 Francesco Noto, Istituto Superiore di Sanita, Universita Cattolica del Sacro Cuore의 박사 과정 학생인 Nicoleta Manduca 및 Esther Maccafeo, 중개 의학 및 외과 부서입니다. 칩은 이전에 클린룸의 플라즈마 클리너 또는 반응성 철 에칭 기계에서 플라즈마 활성화되었습니다. 쥐-비장 세포 및 종양 세포주는 텍스트에 설명된 프로토콜을 모방하기 위해 여기에서 사용됩니다.셀 현탁액을 적재하기 전에 6개의 저장소 모두에서 배지를 빼냅니다. 그런 다음 1 x 10을 왼쪽 상단 저장소 및 하부 우물에서 10 내지 50 마이크로리터의 성장 배지에 재현탁된 5번째 종양 세포에 천천히 로딩합니다. 오른쪽에, 50 마이크로리터의 성장 배지에 재현탁된 6번째 부유 면역 세포를 1 x 10 2개의 웰로 부드럽게 피펫팅한다.모든 세포가 추가되면 각 칩의 6개 저장소를 모두 최대 100-150마이크로리터의 성장 배지로 채우고 세포가 각 배양 구획 내에 올바르게 분포되었는지 확인합니다. 타임랩스 기록 전에 시스템이 안정화될 수 있도록 칩을 1시간 동안 배양합니다. 생세포 이미징의 경우 현미경 스테이지의 칩 플레이트에 종양 면역을 장착합니다.Incucyte Live-Cell Analysis Software와 같은 현미경 소프트웨어 인터페이스에서 획득 워크플로우 설정을 사용자 정의할 수 있습니다. 관찰 기간, 최적의 프레임 속도 및 지속 시간을 실험에 적합한 매개변수 및 연구 중인 세포 유형에 따라 선택합니다. 적절한 실험 기간 동안 세포를 이미지화합니다.콜드 팁을 사용하여 두 가지 실험 조건에 대해 약물 또는 약물 조합을 포함하는 배지로 희석된 마트리겔 2개의 분취량을 준비합니다. 부드럽게 피펫 라이브 호환 형광 염료 염색 종양 세포를 얼음 위의 매트릭스 용액에 현탁하여 세포의 균질한 분포를 얻습니다. 칩 플레이트를 냉각 블록 또는 얼음이 담긴 바구니에 놓고 차가운 10마이크로리터 마이크로피펫 팁을 사용하여 약물 처리된 종양 세포 매트릭스 용액을 왼쪽 및 오른쪽 겔 포트에 천천히 주입합니다.부드러운 압력을 가하여 매트릭스 용액을 채널의 한쪽에서 다른 쪽으로 밀어 넣습니다. 모든 종양 세포가 로드되면 장치를 30분 동안 똑바로 세운 상태로 인큐베이터에 넣습니다. 배양이 끝나면 매트릭스 겔화가 완료되면 6개 저장소 모두의 배지 채널을 50마이크로리터의 배양 배지로 채웁니다.중합된 겔 무결성 및 종양 세포 분포를 현미경으로 확인합니다. 그런 다음 면역 세포 준비가 완료 될 때까지 칩을 인큐베이터에 넣습니다. 배양 후, 각 웰로부터 배지를 흡인한다.중간 중간 중간 채널의 입구 근처에 팁을 놓고 적당한 압력을 사용하여 대조 형광 염료로 표지된 6번째 면역 세포에 10마이크로리터의 10을 부드럽게 주입합니다. 50 내지 100 마이크로리터의 배지를 4개의 측면 채널 웰 각각에 주입하고, 40 내지 90 마이크로리터의 배지를 상부 중앙 웰에, 50 내지 100 마이크로리터의 배지를 하부 중앙 웰에 주입한다. 모든 웰이 로드되면 현미경을 사용하여 면역 세포 분포가 중앙 챔버에 국한된 상태로 유지되었는지 확인합니다.그런 다음 이미징될 때까지 세포 배양 인큐베이터의 평평한 표면에 장치를 조심스럽게 놓습니다. 종양 구획에 침투하는 형광 염색 살아있는 면역 세포의 정도를 계산하려면 형광 현미경으로 특정 관심 지점에서 장치를 이미지화하고 Nikon NIS-Elements와 같은 현미경 이미징 소프트웨어에서 적절한 카메라 매개변수를 설정합니다. 또한 표지 된 면역 세포에 대한 매개 변수를 설정하십시오.미세유체 플랫폼에 적절하게 구축된 마이크로채널 브리지를 통한 백혈구의 표적 세포 이동은 비디오 현미경으로 추적할 수 있습니다. 이 추적 분석에서 개별 PBMC는 죽어가는 독소루비신 치료 또는 살아있는 PBS 처리 암세포로 인해 챌린지되었습니다. 관련 화학주성 값 및 이동 플롯이 자동으로 생성되었으며, 독소루비신 또는 PBS에 노출된 유방암 세포와 함께 로드될 때 면역 세포에 대한 다른 이동 프로파일이 관찰되었습니다.PBMC가 세포 사멸 암세포와 마주했을 때, 그들은 죽어가는 세포와 죽은 세포를 향해 마이크로 채널을 건넜지만 처리되지 않은 살아있는 세포로 교차하지는 않았습니다. 24 내지 48 시간에 걸쳐 밀도가 증가한 백혈구의 분획은 독소 처리 된 암세포와 장기간 접촉을 나타냈다. 이 분석에서는 후성유전학적 약물의 항암 조합에 대한 반응으로 면역 세포의 모집을 정량화하기 위해 새로운 3D 면역적격 종양 모델을 사용했습니다.이어서, 적색 염료 표지된 PBMC를 중앙 유체 챔버 내로 균질하게 분배하였다. 그런 다음 PBMC를 유인하는 두 종양 덩어리의 능력을 비교했으며, 이 실험에서 PBMC를 오른쪽 마이크로채널로 강력하게 모집했습니다. 3D 모델의 경우 용액을 하이드로겔 및 얼음 위의 세포와 혼합하여 기포와 사전 중합을 방지합니다.과도한 압력없이 천천히 주입하십시오. 사용된 매트릭스에 따라 중합 단계를 조정합니다. 상층액에서 생/사멸 세포 분석 및 사이토카인 분비 프로파일링을 구현할 수 있습니다.컨포칼 이미징을 위한 면역형광은 면역 아형을 분류하고 활성화 및 고갈 성숙의 발현 마커에 대해 수행할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

공동 문화 모델 녹농균 Biofilms는 라이브 인간 에어웨이 세포에 들어라

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

연구

면역학 및 감염병학

Seven Steps to Stellate Cells

셀을 별 모양으로 일곱 단계

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

의 기생충 말벌에 대한 소개<em&gt; Drosophila</em&gt; 그리고 Antiparasite 면역 반응

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. ...

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

면역 반응과 수면에서의 양적 측정<em&gt; Drosophila</em

A complex interaction between the immune response and  host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in  particular, is known ...

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

를 사용하여 폐렴 구균 식민지에서 생균제의 효과를 조사<em&gt; 체외</em&gt; 준수의 분석

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

Dissecting Innate Immune Signaling in Viral Evasion of Cytokine Production

사이토 카인 생산의 바이러스 성 회피에 타고난 면역 신호를 해부

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

마우스 대 식세포의 타고난 면역 반응을 조사하기 위해 RNA 간섭을 사용하여

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

웨스트 나일 바이러스 돌연변이 균주의 감염에에서 MyD88 매개 세포 면역 반응의 생체 외 분석

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Dissecting Multi-protein Signaling Complexes by Bimolecular Complementation Affinity Purification (BiCAP)

Dissecting Multi-protein Signaling Complexes by Bimolecular Complementation Affinity Purification BiCAP

해 다중 단백질 신호 복합물 분자 보완성 친 화력 정화 (BiCAP)에 의해

The assembly of protein complexes is a central mechanism underlying the regulation of many cell signaling pathways. A major focus of biomedical research ...

Two-photon Intravital Imaging of Leukocytes During the Immune Response in Lipopolysaccharide-treated Mouse Liver

Lipopolysaccharide 취급 마우스 간에 면역 반응 동안 백혈구의 2 광자 Intravital 이미징

Sepsis is a type of severe infection that can cause organ failure and tissue damage. Although the mortality and morbidity rates associated with sepsis are ...