Name: microfluidic co-culture models for dissecting the immune response in in vitro tumor microenvironments
Uploaded: 2021-04-30T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Co-Culture Models for Dissecting the Immune Response in in vitro Tumor Microenvironments at JoVE.com

1. Diseño de chip para cocultivos 2D de células adherentes y flotantes
NOTA: El diseño de cocultivo 2D (Figura 1A-C) se caracteriza por tres cámaras (100 μm de altura) interconectadas por dos conjuntos de matrices de microcanales (500 x 12 x 10 μm3, L×W×H). La cámara intermedia forma dos compartimentos cerrados sin salida que bloquean las células inmunes flotantes que ...

Los métodos descritos tratan de diseñar un enfoque general para recapitular, con grado modulable de complejidad, dos aspectos significativos en el campo de la oncoinmunología, que pueden beneficiarse de la adopción de modelos in vitro más relevantes. El primero involucra el lado de la población de células tumorales, donde abordar las características de una sola célula puede conducir a una mejor descripción de la heterogeneidad y la importancia biológica y clínica correlacionada, incluida la resistencia a la t...

La evolución de las diferentes ramas de la medicina como disciplinas experimentales ha dependido de la capacidad de manipular la población celular y las funciones orgánicas en condiciones controladas1. Tal capacidad tiene sus raíces en la disponibilidad de modelos medibles capaces de recapitular los procesos que ocurren en nuestro cuerpo.
En la era de la inmunoterapia y el perfil genómico unicelular 2, la biología del cáncer necesita aprovechar los modelos emergentes in vitro y computacionales para investigar la interfaz tumor-inmune en un contexto espaciotemporal adecuado 2,3.
El microambiente tumoral4 (TME) es un tejido complejo donde las células cancerosas interactúan continuamente y coevolucionan dinámicamente con los otros componentes celulares (células inmunes, estromales y endoteliales) y no celulares (la matriz extracelular, ECM). La naturaleza dinámica de este complejo paisaje dicta si las células inmunes juegan como amigas o enemigas de las células malignas, lo que afecta fuertemente tanto la progresión de la enfermedad como la respuesta a la terapia. Hoy en día, grandes esfuerzos de oncoinmunólogos, bioinformáticos y expertos en biología de sistemas están convergiendo para abordar la importancia clínica de la heterogeneidad del cáncer 5,6, ya sea en el espacio (es decir, en distintas regiones tumorales) y el tiempo (es decir, en distintas etapas de progresión tumoral)5,6, y para caracterizar el fenotipo y la función del cáncer y las células inmunes a nivel de una sola célula. Como ejemplo de esta sinergia, las técnicas avanzadas de visión artificial se utilizan ahora de forma rutinaria para el mapeo espacial del infiltrado inmune en muestras histológicas 7,8.
En el frente de los modelos experimentales, uniendo estudios en animales y métodos tradicionales in vitro, los avances en microfluídica y técnicas de cocultivo dan acceso a diferentes clases de modelos celulares de microingeniería como organoides, sistemas microfisiológicos 9,10,11 (MPS) y órganos en chip12,13,14 (OOC). Comparten el rasgo común de ampliar la visión general de los ecosistemas celulares y expandir el potencial in vitro para controlar los factores microambientales mientras explotan la microscopía de alto contenido15 y los enfoques de procesamiento de imágenes.
Hoy en día, los sistemas MPS y OOC de última generación han comenzado a incluir aspectos inmunológicos, incorporando diferentes subtipos de células inmunes en tejidos y cocultivos existentes, para explorar y medir una variedad de procesos como enfermedades inflamatorias, cicatrización de heridas, inmunidad mucosa y respuesta a toxinas o productos alimenticios diarios16. Los modelos TME-on-a-chip 10,11,12,13,14,15,16,17, también integrados con microvasos perfusibles 18,19,20,21, se han desarrollado para investigar las interacciones dependientes del tipo celular, las perturbaciones físicas y químicas y la actividad citotóxica de linfocitos infiltrantes22, así como agentes inmunomoduladores clínicamente relevantes23.
Aquí, proporcionamos protocolos versátiles, que abarcan desde células de carga en chips hasta herramientas de procesamiento de imágenes, para explotar cocultivos microfluídicos avanzados inmunes al tumor en configuraciones 2D (sección 1) y 3D (sección 2)16, compatibles con el monitoreo dinámico y multiparamétrico24 y la visualización de funciones celulares. Esto se logra manteniendo la facilidad de uso y flexibilidad tanto en la gestión de muestras como en el análisis de datos, aprovechando el software gratuito de Fiji y sus cajas de herramientas25,26.
El dispositivo microfluídico, descrito en la sección 1, está diseñado para realizar cocultivos 2D de cáncer adherente y células inmunes flotantes. Esta plataforma fue validada para la medición in vitro del comportamiento de las células inmunes en presencia de mutaciones genéticas27 y/o inmunodeficiencias28. Aquí, ilustramos los pasos para rastrear las células inmunes en imágenes de campo claro de lapso de tiempo, explotando un método semiautomático basado en Trackmate (un complemento implementado en el software de Fiji). Este procedimiento permite la extracción de descriptores cinemáticos de migración inmune 29 y respuesta (es decir, tiempos de interacción) a células cancerosas diana, tratadas o no con inductores de muerte celular inmunogénica27.
Es importante destacar que estos parámetros, extraídos de imágenes de series temporales, se pueden procesar con maquinaria matemática avanzada. Como ejemplo de la potencialidad de este enfoque, nuestros grupos publicaron recientemente un análisis basado en métodos matemáticos de procesos estocásticos y mecánica estadística para modelar las propiedades de la red celular y proporcionar una descripción parametrizada del comportamiento de las células inmunes (es decir, caminata aleatoria sesgada o no correlacionada, movimiento altamente o no coordinado30,31).
La configuración 3D, proporcionada en la segunda sección, se basa en un protocolo de cocultivo para recrear TME inmunocompetentes más complejos incrustados en dos regiones de gel con diferentes combinaciones de tipos de células y medicamentos de manera competitiva. Aquí, se describen los pasos de procesamiento de imágenes para medir, en diferentes puntos temporales, la infiltración de células inmunes teñidas en células de melanoma A375M humano cultivadas dentro de Matrigel, para evaluar combinaciones de agentes antitumorales32. La línea A375M, una línea celular derivada de A375P caracterizada por un fenotipo altamente metastásico, fue elegida para evaluar su capacidad metastásica en presencia de células inmunes32.
Los modelos descritos pueden ser totalmente compatibles con diferentes fuentes celulares (líneas celulares murinas y humanas inmortalizadas o primarias, organoides, xenoinjertos, entre otros). En estudios recientes de nuestro laboratorio, al combinar microscopía de video de alto contenido con análisis de imágenes, se aplicó el diseño 3D competitivo para investigar: i) una respuesta inmune antitumoral (citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) y diseccionar el papel de los fibroblastos en la resistencia a la terapia con trastuzumab en modelos en chip de cáncer de mama HER2+ 33; ii) la acción de las células mieloides (es decir, macrófagos asociados al cáncer) en los mecanismos de evasión tumoral y reclutamiento de células T34; iii) la eficacia de los regímenes inmunoterapéuticos, específicamente basados en células dendríticas condicionadas por interferón α (IFN-DC), cultivadas con células de cáncer de colon tratadas con fármacos en matrices de colágeno, y evaluar el movimiento eficiente y los eventos de fagocitosis subsiguientes35; iv) la migración quimiotáctica de eosinófilos derivados de la médula ósea hacia células de melanoma tratadas o no tratadas con IL-3336.
Estos modelos avanzados podrían servir como ventanas de observación para comprender el papel de la textura inmune en la metástasis del cáncer y los mecanismos de resistencia, pero se requieren esfuerzos para traducir los hallazgos a las clínicas, cerrando la brecha con la investigación básica37.
Como escenario emergente, aprovechar el poder de la microscopía automatizada de alto contenido junto con el uso de microsistemas más relevantes fisiológicamente está abriendo nuevos desafíos potenciales para el manejo, procesamiento e interpretación de cientos, e incluso miles, de Gigabytes de datos multiparamétricos, que se pueden generar a partir de una sola campaña experimental. Esto implica un vínculo directo de los experimentos OOC con algoritmos basados en inteligencia artificial 38,39,40,41,42 (AI) tanto para el análisis automatizado avanzado como para la generación de características que pueden alimentar a su vez modelos in silico de interacción cáncer-inmune 43, con nuevas aplicaciones emocionantes en el horizonte, como el desarrollo de ensayos predictivos de detección de medicamentos 44.
Un flujo de esfuerzos cada vez mayor se centra en el diseño de modelos de enfermedades junto con la optimización de estrategias para implementar las pantallas de perturbación a gran escala con lecturas multiómicas de una sola célula. Sin duda, esto ayudará al desarrollo y, con suerte, a la implementación clínica, acompañada de un grado apropiado de estandarización del método, de un enfoque sistemático de oncoinmunología en un chip para obtener nuevos conocimientos sobre los trastornos inmunes y los mecanismos de diseminación del cáncer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell culture materials&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tubes</td>
			<td>Corning-Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>CLS430828</td>
			<td>centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-aza-2&#39;-deoxycytidine DAC</td>
			<td>Millipore-Sigma; St. Louis, MO</td>
			<td>A3656</td>
			<td>DNA-hypomethylating agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Corning-Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>CLS3506</td>
			<td>culture dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 cm2 cell culture treated flask</td>
			<td>Corning, New York, NY</td>
			<td>430641U</td>
			<td>culture flasks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A365M</td>
			<td>American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA</td>
			<td> 
			CVCL_B222</td>
			<td>human melanoma cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxorubicin hydrochloride</td>
			<td>Millipore-Sigma; St. Louis, MO</td>
			<td>D1515</td>
			<td>anthracycline antibiotic&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium DMEM</td>
			<td>EuroClone Spa, Milan, Italy</td>
			<td>ECM0728L</td>
			<td>Culture medium for SK-MEL-28&#160; cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffer Saline w/o Calcium w/o Magnesium</td>
			<td>EuroClone Spa, Milan, Italy</td>
			<td>ECB4004L</td>
			<td>saline buffer solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>EuroClone Spa, Milan, Italy</td>
			<td>ECS0180L</td>
			<td>ancillary for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll</td>
			<td>GE-Heathcare</td>
			<td>17-1440-02</td>
			<td>separation of mononuclear cells from human blood.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hemocytometer</td>
			<td>Neubauer</td>
			<td></td>
			<td>Cell counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparinized vials</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA</td>
			<td></td>
			<td>Vials for venous blood collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>interferon alpha-2b</td>
			<td>Millipore-Sigma; St. Louis, MO</td>
			<td>SRP4595</td>
			<td>recombinant human cytokine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 100X</td>
			<td>EuroClone Spa, Milan, Italy</td>
			<td>ECB3000D</td>
			<td>ancillary for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lympholyte cell separation media</td>
			<td>Cedarlane Labs, Burlington, Canada</td>
			<td></td>
			<td>Separation of lymphocytes by density gradient centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphoprep</td>
			<td>Axis-Shield PoC AS, Oslo, Norway</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning, New York, NY</td>
			<td>354230</td>
			<td>growth factor reduced basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231&#160;</td>
			<td>American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA</td>
			<td>&#160;HTB-26</td>
			<td>human breast cancer cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/ Streptomycin 100X&#160;&#160;</td>
			<td>EuroClone Spa, Milan, Italy</td>
			<td>ECB3001D</td>
			<td>ancillary for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet aid</td>
			<td>Drummond Scientific Co., Broomall, PA</td>
			<td>4-000-201</td>
			<td>Liquid handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKH26 Red Fluorescent cell linker</td>
			<td>Millipore-Sigma; St. Louis, MO</td>
			<td>PKH26GL</td>
			<td>red fluorescent cell dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKH67 Green fluorescent cell linker</td>
			<td>Millipore-Sigma; St. Louis, MO</td>
			<td>PKH67GL</td>
			<td>green fluorescent cell dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>EuroClone Spa, Milan, Italy</td>
			<td>ECM2001L</td>
			<td>Culture medium for MDA-MB-231 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>serological pipettes (2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL)</td>
			<td>Corning- Millipore-Sigma; St. Louis, MO</td>
			<td>CLS4486; CLS4487; CLS4488; CLS4489; CLS4490</td>
			<td>Liquid handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile tips (1-10 &#956;L, 10-20 &#956;L, 20-200 &#956;L, 1000 &#956;L)</td>
			<td>EuroClone Spa, Milan, Italy</td>
			<td>ECTD00010; ECTD00020; ECTD00200; ECTD01005</td>
			<td>tips for micropipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA</td>
			<td>15250061</td>
			<td>cell stain to assess cell viability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>EuroClone Spa, Milan, Italy</td>
			<td>ECM0920D</td>
			<td>dissociation reagent for adherent cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS-FL fluorescence microscope</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA</td>
			<td></td>
			<td>Fluorescent microscope for living cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humified cell culture incubator&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA</td>
			<td>311 Forma Direct Heat COIncubator; TC 230</td>
			<td>Incubation of cell cultures at 37 &#176;C, 5% CO2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Juli Microscope</td>
			<td>Nanoentek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory refrigerator (4 &#176;C)</td>
			<td>FDM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Safety Cabinet (Class II)</td>
			<td>Steril VBH 72 MP</td>
			<td></td>
			<td>Laminar flow hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerable centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostatic bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfabrication materials&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Aminopropyl)triethoxysilane (Aptes)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A3648</td>
			<td>silanizing agent for bonding PDMS to plastic coverslip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium quartz masks / 4&#34;x4&#34;, HRC / No AZ&#160;</td>
			<td>MB W&#38;A,&#160; Germany</td>
			<td></td>
			<td>optical masks for photolithography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip, D 263 M Schott glass,&#160; (170 &#177; 5 &#181;m)</td>
			<td>Ibidi, Germany</td>
			<td>10812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide solution 30%</td>
			<td>Carlo Erba Reagents</td>
			<td>412081</td>
			<td>reagents for piranha solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl isobutyl ketone</td>
			<td>Carlo Erba Reagents</td>
			<td>461945</td>
			<td>PMMA e-beam resist developer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Glass Slides (Pack of 50 slides) 76.2 mm x 25.4 mm&#160;</td>
			<td>Sail Brand</td>
			<td>7101</td>
			<td>substrates for bonding chips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miltex Biopsy Punch with Plunger, ID 1.0mm</td>
			<td>Tedpella</td>
			<td></td>
			<td>dermal biopsy punches for chip reservoirs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMMA&#160; 950 kDa</td>
			<td>Allresist,Germany</td>
			<td>AR-P. 679.04</td>
			<td>Positive electronic resists for patterning optical masks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymer untreated coverslips</td>
			<td>Ibidi, Germany</td>
			<td>10813</td>
			<td>substrates for bonding chips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prime CZ-Si Wafer,&#160; 4&#8221;, (100), Boron Doped</td>
			<td>Gambetti Xenologia Srl, Italy</td>
			<td>30255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propan-2-ol</td>
			<td>Carlo Erba Reagents</td>
			<td>415238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propylene glycol monomethyl ether acetate (PGMEA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>484431-4L</td>
			<td>SU-8 resists developer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 3005</td>
			<td>Micro resist technology,Germany</td>
			<td>C1.02.003-0001</td>
			<td>Negative Photoresists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 3050</td>
			<td>Micro resist technology,Germany</td>
			<td>C1.02.003-0005</td>
			<td>Negative Photoresists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suite of Biopunch, ID 4.0 mm, 6.0 mm, 8.0 mm</td>
			<td>Tedpella</td>
			<td>15111-40, 15111-60, 15111-80</td>
			<td>dermal biopsy punches for chip reservoirs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid 96%</td>
			<td>Carlo Erba Reagents</td>
			<td>410381</td>
			<td>reagents for piranha solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>Dowsil, Dow Corning</td>
			<td>11-3184-01</td>
			<td>Silicone Elastomer (PDMS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimethylchlorosilane (TMCS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>92360-100ML</td>
			<td>silanizing agent for SU-8 patterned masters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfabrication equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 kV e-beam litography</td>
			<td>Raith-Vistec EBPG 5HR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hotplate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical litography system</td>
			<td>EV-420 double-face contact mask-aligner</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reactive Ion Etching system</td>
			<td>Oxford plasmalab 80 plus system</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum dessicator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microfluidic co-culture models for dissecting the immune response in in vitro tumor microenvironments

Los modelos de enfermedades complejas exigen herramientas de vanguardia capaces de ofrecer información fisiológica y patológicamente relevante y procesable, y revelar procesos que de otro modo serían invisibles. Los ensayos celulares avanzados que imitan de cerca el escenario in vivo se están estableciendo como formas novedosas de visualizar y medir la interacción bidireccional tumor-huésped que influye en la progresión del cáncer. Aquí describimos dos protocolos versátiles para recrear cocultivos 2D y 3D altamente controlables en microdispositivos, imitando la complejidad del microambiente tumoral (TME), bajo inmunovigilancia natural e inducida por terapia. En la sección 1, se proporciona un entorno experimental para monitorear la diafonía entre las células tumorales adherentes y las poblaciones inmunes flotantes, mediante microscopía de lapso de tiempo de campo brillante. Como escenario aplicativo, analizamos los efectos de los tratamientos contra el cáncer, como los llamados inductores inmunogénicos de muerte de células cancerosas sobre el reclutamiento y la activación de las células inmunes. En la sección 2, los microambientes inmunes al tumor 3D se ensamblan en un diseño competitivo. La infiltración inmune diferencial se monitoriza mediante instantáneas de fluorescencia hasta 72 h, para evaluar estrategias terapéuticas combinadas. En ambos entornos, se ilustran los pasos de procesamiento de imágenes para extraer una gran cantidad de parámetros de células inmunes (por ejemplo, migración e interacción de células inmunes, respuesta a agentes terapéuticos). Estos métodos simples y poderosos se pueden adaptar aún más para simular la complejidad del TME que abarca la heterogeneidad y plasticidad de los subtipos de células cancerosas, estromales e inmunes, así como sus interacciones recíprocas como impulsores de la evolución del cáncer. El cumplimiento de estas tecnologías en rápida evolución con imágenes de alto contenido de células vivas puede conducir a la generación de grandes conjuntos de datos informativos, lo que plantea nuevos desafíos. De hecho, el triángulo "co-cultivos/microscopía/análisis avanzado de datos" establece el camino hacia una parametrización precisa del problema que puede ayudar a protocolos terapéuticos a medida. Esperamos que la futura integración de inmune al cáncer en un chip con inteligencia artificial para el procesamiento de alto rendimiento sinergice un gran paso adelante en el aprovechamiento de las capacidades como herramientas predictivas y preclínicas para la oncología de precisión y personalizada.

La infiltración inmune tumoral es un parámetro de la respuesta antitumoral del huésped. Los tumores son heterogéneos en la composición, densidad, ubicación y estado funcional de los leucocitos infiltrantes, cuyas interacciones con las células cancerosas pueden ser la base de información clínicamente relevante para predecir el curso de la enfermedad y la respuesta a la terapia. En este sentido, las tecnologías microfluídicas podrían utilizarse como herramientas in vitro complementarias y privilegiadas para exp...

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Microfluidic Co-Culture Models for Dissecting the Immune Response in in vitro Tumor Microenvironments

En la era de la inmunoterapia y el perfil genómico unicelular, la biología del cáncer requiere nuevas herramientas in vitro y computacionales para investigar la interfaz tumor-inmune en un contexto espaciotemporal adecuado. Describimos protocolos para explotar cocultivos microfluídicos inmunes al tumor en entornos 2D y 3D, compatibles con el monitoreo dinámico y multiparamétrico de las funciones celulares.

Modelos de cocultivo microfluídico para diseccionar la respuesta inmune en microambientes tumorales in vitro

Complex disease models demand cutting-edge tools able to deliver physiologically and pathologically relevant, actionable insights, and unveil otherwise ...

Este protocolo proporciona configuraciones experimentales para realizar cocultivos 2D y 3D controlables en microdispositivos para visualizar y monitorear diafonías entre células tumorales e inmunes y analizar los efectos de los tratamientos contra el cáncer. Esta tecnología proporciona una visualización fácil y en tiempo real del reclutamiento y las interacciones de las células inmunes y se puede emplear para muestras humanas y derivadas de pacientes. Es compatible con la mayoría de las microscopías de última generación.Demostrando el procedimiento estarán Francesco Noto, estudiante de doctorado en el Departamento de Oncología y Medicina Molecular, Istituto Superiore di Sanita, y Nicoleta Manduca y Esther Maccafeo, estudiantes de doctorado en la Universita Cattolica del Sacro Cuore, Departamento de Medicina Traslacional y Cirugía. Las virutas se activan previamente por plasma en un limpiador de plasma o en una máquina de grabado de hierro reactivo en sala limpia. Las células murinas del bazo y una línea celular tumoral se utilizan aquí para imitar los protocolos descritos en el texto.Antes de cargar las suspensiones celulares, retire los medios de los seis depósitos. Luego, cargue lentamente 1 x 10 a las 5ª células tumorales resuspendidas en 10 a 50 microlitros de medio de crecimiento en el reservorio superior izquierdo y en el pozo inferior. En el lado derecho, pipetear suavemente 1 x 10 a las 6ª células inmunes flotantes resuspendidas en 50 microlitros de medio de crecimiento en dos pocillos.Cuando se hayan agregado todas las células, llene los seis depósitos de cada chip con hasta 100 a 150 microlitros de medio de crecimiento y verifique que las células se hayan distribuido correctamente dentro de cada compartimiento de cultivo. Incubar el chip durante una hora para permitir que el sistema se estabilice antes de la grabación de lapso de tiempo. Para obtener imágenes de células vivas, monte el tumor inmune en la placa de chip en la etapa del microscopio.Personalice la configuración del flujo de trabajo de adquisición en la interfaz del software del microscopio, como el software Incucyte Live-Cell Analysis. Seleccione las ventanas de observación, la velocidad de fotogramas óptima y la duración del tiempo, dependiendo de los parámetros apropiados para el experimento y los tipos de células en estudio. Imagen de las celdas para el período de tiempo experimental apropiado.Preparar dos alícuotas de matrigel diluido con medio que contenga un fármaco o una combinación de fármacos para las dos condiciones experimentales utilizando puntas frías. Pipetear suavemente células tumorales teñidas con colorante fluorescente compatibles con vivos suspendidas en solución de matriz sobre hielo para obtener una distribución homogénea de las células. Con la placa de chip en un bloque de enfriamiento o en una canasta con hielo, inyecte lentamente la solución de matriz de células tumorales tratada con medicamentos en los puertos de gel izquierdo y derecho con puntas frías de micropipeta de 10 microlitros.Aplique una presión suave para empujar la solución de matriz de un lado del canal al otro. Cuando se hayan cargado todas las células tumorales, coloque el dispositivo en la incubadora en posición vertical durante 30 minutos. Al final de la incubación, una vez que se complete la gelificación de la matriz, llene los canales del medio de los seis reservorios con 50 microlitros de medio de cultivo.Verifique la integridad del gel polimerizado y la distribución de las células tumorales bajo un microscopio. Luego coloque los chips en una incubadora hasta que se complete la preparación de las células inmunes. Después de la incubación, aspire el medio de cada pozo.Coloque la punta cerca de la entrada del canal medio medio y use una presión moderada para inyectar suavemente 10 microlitros de 10 a las 6ª células inmunes marcadas con un tinte fluorescente contrastante. Inyecte de 50 a 100 microlitros del medio en cada uno de los cuatro pocillos de los canales laterales, de 40 a 90 microlitros del medio en el pozo central superior y de 50 a 100 microlitros del medio en el pozo central inferior. Cuando todos los pocillos hayan sido cargados, use un microscopio para confirmar que la distribución de células inmunes ha permanecido confinada a la cámara central.Luego, coloque cuidadosamente el dispositivo en una superficie nivelada en la incubadora de cultivo celular hasta que se le dé una imagen. Para calcular la extensión de las células inmunitarias vivas teñidas con fluorescencia que se infiltran en los compartimentos tumorales, obtenga imágenes del dispositivo en puntos de tiempo específicos de interés mediante microscopía de fluorescencia y configure los parámetros de cámara apropiados en el software de imágenes del microscopio, como Nikon NIS-Elements. También establezca los parámetros para las células inmunes marcadas.El movimiento de los leucocitos a través de puentes de microcanales construidos adecuadamente en la plataforma microfluídica hacia sus células diana puede rastrearse mediante microscopía de video. En este análisis de seguimiento, las PBMC individuales fueron desafiadas con células cancerosas muertas tratadas con doxorrubicina o vivas tratadas con PBS. Los valores relevantes de quimiotaxis y las gráficas de migración se generaron automáticamente, y se observó un perfil migratorio diferente para las células inmunes cuando se cocargaron con células de cáncer de mama expuestas a doxorrubicina o PBS.Cuando las PBMC se enfrentaron a células cancerosas apoptóticas, cruzaron microcanales hacia las células moribundas y muertas, pero no cruzaron a células vivas no tratadas. Una fracción de leucocitos con densidad creciente durante 24 a 48 horas exhibieron contactos a largo plazo con células cancerosas tratadas con doxo. En este análisis, se utilizó un nuevo modelo tumoral inmunocompetente 3D para cuantificar el reclutamiento de células inmunes en respuesta a combinaciones de fármacos epigenéticos contra el cáncer.Las PBMC marcadas con colorante rojo se distribuyeron homogéneamente en la cámara fluídica central. Luego se comparó la capacidad de las dos masas tumorales para atraer a las PBMC, y las PBMC se reclutaron robustamente en este experimento en el microcanal del lado derecho. Para el modelo 3D, mezcle la solución con hidrogel y células sobre hielo, evitando burbujas y prepolimerización.Inyéctelo lentamente sin presión excesiva. Ajuste los pasos de polimerización de acuerdo con la matriz utilizada. Se pueden implementar ensayos de células vivas / muertas y perfiles de secreción de citoquinas de sobrenadantes.La inmunofluorescencia para imágenes confocales se puede realizar para clasificar subtipos inmunes y para marcadores de expresión de activación y maduración de agotamiento.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Los modelos de co-cultivo de Pseudomonas aeruginosa Biofilms Cultivado en las células vivas las vías respiratorias humanas

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

Investigación

Inmunología e Infección

Seven Steps to Stellate Cells

Siete pasos para células estrelladas

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Una introducción a las avispas parasitarias de<em&gt; Drosophila</em&gt; Y la respuesta inmune antiparasitario

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. ...

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

Medición cuantitativa de la respuesta inmune y del sueño en<em&gt; Drosophila</em

A complex interaction between the immune response and  host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in  particular, is known ...

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

La investigación de los efectos de los probióticos en antineumocócica Colonización El uso de un<em&gt; In Vitro</em&gt; Ensayo de adherencia

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

Dissecting Innate Immune Signaling in Viral Evasion of Cytokine Production

La disección de señalización inmune innata en Evasion Viral de la producción de citoquinas

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

El uso de ARN de interferencia para Investigar la respuesta inmune innata en macrófagos de ratón

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

El análisis in vitro de la respuesta inmune celular Myd88 mediada por el Virus del Nilo Occidental cepa mutante Infección

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Dissecting Multi-protein Signaling Complexes by Bimolecular Complementation Affinity Purification (BiCAP)

Dissecting Multi-protein Signaling Complexes by Bimolecular Complementation Affinity Purification BiCAP

Disección señalización complejos por purificación de la afinidad de complementación Bimolecular (BiCAP)

The assembly of protein complexes is a central mechanism underlying the regulation of many cell signaling pathways. A major focus of biomedical research ...

Two-photon Intravital Imaging of Leukocytes During the Immune Response in Lipopolysaccharide-treated Mouse Liver

Dos fotones Intravital proyección de imagen de leucocitos durante la respuesta inmunitaria en hígado de ratón tratados con lipopolisacárido

Sepsis is a type of severe infection that can cause organ failure and tissue damage. Although the mortality and morbidity rates associated with sepsis are ...