Name: microfluidic co-culture models for dissecting the immune response in in vitro tumor microenvironments
Uploaded: 2021-04-30T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Co-Culture Models for Dissecting the Immune Response in in vitro Tumor Microenvironments at JoVE.com

1. Yapışkan ve yüzen hücreler için çip tasarımı 2D ortak kültürler
NOT: 2B ortak kültür düzeni (Şekil 1A-C), iki mikrokanal dizisi seti (500 x 12 x 10 μm3, L×G×H) ile birbirine bağlanmış üç odacıkla (100 μm yüksekliğinde) karakterize edilir. Ara oda, yükleme adımı 2.5 sırasında tümör bölgesine taşan yüzen bağışıklık hücrelerini bloke ede...

Açıklanan yöntemler, onko-immünoloji alanında, daha ilgili in vitro modellerin benimsenmesinden yararlanabilecek iki önemli yönü, modüle edilebilir karmaşıklık derecesiyle özetlemek için genel bir yaklaşım tasarlamaya çalışmaktadır. Birincisi, tek hücre özelliklerinin ele alınmasının, heterojenliğin daha iyi tanımlanmasına ve tedaviye direnç, metastaza propulsiyon, kök hücre ve farklılaşma derecesi dahil olmak üzere ilişkili biyolojik ve klinik öneme yol açabileceği tümör hücresi ...

Farklı tıp dallarının deneysel disiplinler olarak evrimi, kontrollü koşullar altında hücre popülasyonunu ve organ fonksiyonlarını manipüle etme yeteneğine bağlı olmuştur1. Bu yeteneğin kökleri, vücudumuzda meydana gelen süreçleri özetleyebilen ölçülebilir modellerin mevcudiyetinde yatmaktadır.
İmmünoterapi ve tek hücreli genomik profilleme 2 çağında, kanser biyolojisinin, tümör-immün arayüzünü uygun bir mekansal zamansal bağlamda araştırmak için ortaya çıkan in vitro ve hesaplamalı modellerden yararlanması gerekir 2,3.
Tümör mikroçevre4 (TME), kanser hücrelerinin diğer hücresel (immün, stromal ve endotel hücreleri) ve hücresel olmayan (hücre dışı matriks, ECM) bileşenlerle sürekli etkileşime girdiği ve dinamik olarak birlikte evrimleştiği karmaşık bir dokudur. Bu karmaşık manzaranın dinamik doğası, bağışıklık hücrelerinin kötü huylu hücrelerin arkadaşları veya düşmanları olarak oynayıp oynamadığını belirler, böylece hem hastalığın ilerlemesini hem de tedaviye yanıtı güçlü bir şekilde etkiler. Günümüzde, onko-immünologların, biyoinformatikçilerin ve sistem biyolojisi uzmanlarının büyük çabaları, kanser heterojenliğinin klinik önemini ele almak için bir araya gelmektedir 5,6, ya uzayda (yani farklı tümör bölgelerinde) ve zamanda (yani, farklı tümör progresyon aşamalarında)5,6 ve kanseri ve bağışıklık hücresi fenotipini ve işlevini tek hücre düzeyinde karakterize etmek. Bu sinerjinin bir örneği olarak, histolojik örneklerde immün infiltrasyonun mekansal haritalanması için gelişmiş bilgisayar-görme teknikleri artık rutin olarak kullanılmaktadır 7,8.
Deneysel modellerin önünde, hayvan çalışmaları ve geleneksel in vitro yöntemler arasında köprü kuran mikroakışkanlar ve birlikte kültürleme tekniklerindeki ilerlemeler, organoidler, mikro-fizyolojik sistemler 9,10,11 (MPS) ve çip üzerinde organlar 12,13,14 gibi farklı mikro mühendislik ürünü hücresel model sınıflarına erişim sağlamaktadır (OOC). Hücresel ekosistemlerin 'büyük resim' görünümünü yakınlaştırmak ve yüksek içerikli mikroskopi15 ve görüntü işleme yaklaşımlarından yararlanırken mikroçevresel faktörleri kontrol etmek için in vitro potansiyeli genişletmek için ortak özelliği paylaşıyorlar.
Günümüzde, son teknoloji ürünü MPS ve OOC sistemleri, enflamatuar hastalıklar, yara iyileşmesi, mukozal bağışıklık ve toksinlere veya günlük gıda ürünlerine yanıt gibi çeşitli süreçleri araştırmak ve ölçmek amacıyla, mevcut dokulara ve ortak kültürlere farklı bağışıklık hücreleri alt tiplerini dahil eden immünolojik yönleri içermeye başlamıştır16. 18,19,20,21 eriyebilir mikrodamarlarla da entegre olan 10,11,12,13,14,15,16,17 TME-on-a-chip modelleri, hücre tipine bağlı etkileşimleri, fiziksel ve kimyasal bozulmaları ve sitotoksik aktivitesini araştırmak için geliştirilmiştir. infiltrasyon lenfositleri22 ve klinik olarak ilgili immünomodülatör ajanlar23.
Burada, hücresel fonksiyonların dinamik, multiparametrik24 izlenmesi ve görselleştirilmesi ile uyumlu, 2D (bölüm 1) ve 3D (bölüm 2) ayar16'daki gelişmiş tümör immün mikroakışkan ko-kültürlerinden yararlanmak için çiplerdeki hücrelerin yüklenmesinden görüntü işleme araçlarına kadar uzanan çok yönlü protokoller sunuyoruz. Bu, hem numune yönetiminde hem de veri analizinde kullanım kolaylığını ve esnekliği koruyarak, Fiji ücretsiz yazılımından ve araç kutularından yararlanarak elde edilir25,26.
Bölüm 1'de açıklanan mikroakışkan cihaz, yapışkan kanser ve yüzen bağışıklık hücrelerinin 2D ortak kültürlerini gerçekleştirmek için tasarlanmıştır. Bu platform, genetik mutasyonlar27 ve / veya immün yetmezlikler28 varlığında immün hücre davranışının in vitro ölçümü için doğrulanmıştır. Burada, Trackmate'e (Fiji yazılımında uygulanan bir eklenti) dayanan yarı otomatik bir yöntemden yararlanarak, hızlandırılmış parlak alan görüntülerinde bağışıklık hücrelerini izleme adımlarını gösteriyoruz. Bu prosedür, immünojenik hücre ölümü indükleyicileri27 ile tedavi edilen veya edilmeyen kanser hücrelerini hedeflemek için immün migrasyon 29'un kinematik tanımlayıcılarının ve yanıtının (yani, etkileşim sürelerinin) ekstraksiyonunu sağlar.
Daha da önemlisi, zaman serisi görüntülerinden çıkarılan bu parametreler, gelişmiş matematiksel makinelerle işlenebilir. Bu yaklaşımın potansiyelinin bir örneği olarak, gruplarımız yakın zamanda hücresel ağ özelliklerini modellemek ve bağışıklık hücresi davranışının parametrik bir tanımını sağlamak için stokastik süreçlerden ve istatistiksel mekanikten matematiksel yöntemlere dayanan bir analiz yayınladı (yani, önyargılı veya ilişkisiz rastgele yürüyüş, yüksek veya koordineli olmayan hareket30,31).
İkinci bölümde sağlanan 3D ayarı, farklı hücre tipleri ve ilaç kombinasyonları ile iki jel bölgesine gömülü daha karmaşık immünokompetan TME'leri rekabetçi bir şekilde yeniden oluşturmak için bir ko-kültür protokolüne dayanmaktadır. Burada, antitümör ajan kombinasyonlarını değerlendirmek için Matrigel içinde yetiştirilen insan A375M melanom hücrelerinde lekeli bağışıklık hücrelerinin infiltrasyonunu farklı zaman noktalarında ölçmek için görüntü işleme adımları açıklanmaktadır32. Yüksek metastatik fenotiple karakterize bir A375P türevi hücre hattı olan A375M hattı, immün hücrelerin varlığında metastatik yeteneklerini değerlendirmek için seçildi32.
Açıklanan modeller farklı hücre kaynaklarıyla (murin ve insan ölümsüzleştirilmiş veya birincil hücre hatları, organoidler, ksenogreftler, diğerleri arasında) tamamen uyumlu olabilir. Laboratuvarımızın son çalışmalarında, yüksek içerikli video mikroskopisini görüntü analizi ile birleştirerek, aşağıdakileri araştırmak için rekabetçi 3D düzeni uygulanmıştır: i) bir anti-tümöral (antikor bağımlı hücre aracılı sitotoksisite, ADCC) immün yanıt ve fibroblastların HER2 + meme kanseri çip üstü modellerinde trastuzumab tedavisine dirençteki rolünü incelemek33; ii) Miyeloid hücrelerin (yani, kanserle ilişkili makrofajların) tümör kaçırma ve T hücrelerinin işe alım mekanizmalarındaki etkisi34; iii) Kollajen matrislerinde ilaçla tedavi edilen kolon kanseri hücreleri ile yetiştirilen, özellikle interferon α şartlandırılmış dendritik hücrelere (IFN-DC'ler) dayanan immünoterapötik rejimlerin etkinliği ve etkili hareketi ve bunu takip eden fagositoz olaylarını değerlendirmek35; iv) kemik iliği kaynaklı eozinofillerin IL-33 ile tedavi edilmiş veya tedavi edilmemiş melanom hücrelerine kemotaktik göçü36.
Bu gelişmiş modeller, immün konstaksiyonun kanser metastazı ve direnç mekanizmalarındaki rolünü anlamak için gözlem pencereleri olarak hizmet edebilir, ancak bulguları kliniklere çevirmek ve temel araştırmalarla boşluğu kapatmak için çaba sarf etmek gerekir37.
Ortaya çıkan bir senaryo olarak, otomatik yüksek içerikli mikroskopinin gücünden yararlanmak, fizyolojik olarak daha alakalı mikrosistemlerin kullanımıyla birleştiğinde, tek bir deneysel kampanyadan üretilebilecek yüzlerce, hatta binlerce Gigabayt multiparametrik verinin işlenmesi, işlenmesi ve yorumlanması için yeni potansiyel zorluklar ortaya çıkarmaktadır. Bu, OOC deneylerinin yapay zeka 38,39,40,41,42 (AI) tabanlı algoritmalarla doğrudan bir bağlantısı anlamına gelir, hem gelişmiş otomatik analiz hem de kanser-bağışıklık etkileşiminin siliko modellerinde sırayla beslenebilecek özelliklerin üretilmesi43, ufukta öngörücü ilaç tarama tahlillerinin geliştirilmesi gibi heyecan verici yeni uygulamalarla44.
Sürekli genişleyen bir çaba akışı, tek hücreli çoklu omik okumalarla büyük ölçekli pertürbasyon ekranlarını uygulamak için stratejilerin optimizasyonu ile birlikte hastalık modellerinin tasarımına odaklanmıştır. Bu şüphesiz, bağışıklık bozuklukları ve kanser yayılma mekanizmaları hakkında yeni bilgiler edinmek için sistematik bir onko-immünoloji-on-a-chip yaklaşımının uygun bir yöntem standardizasyonu derecesi ile birlikte geliştirilmesine ve umarım klinik olarak uygulanmasına yardımcı olacaktır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell culture materials&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tubes</td>
			<td>Corning-Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>CLS430828</td>
			<td>centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-aza-2&#39;-deoxycytidine DAC</td>
			<td>Millipore-Sigma; St. Louis, MO</td>
			<td>A3656</td>
			<td>DNA-hypomethylating agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Corning-Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>CLS3506</td>
			<td>culture dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 cm2 cell culture treated flask</td>
			<td>Corning, New York, NY</td>
			<td>430641U</td>
			<td>culture flasks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A365M</td>
			<td>American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA</td>
			<td> 
			CVCL_B222</td>
			<td>human melanoma cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxorubicin hydrochloride</td>
			<td>Millipore-Sigma; St. Louis, MO</td>
			<td>D1515</td>
			<td>anthracycline antibiotic&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium DMEM</td>
			<td>EuroClone Spa, Milan, Italy</td>
			<td>ECM0728L</td>
			<td>Culture medium for SK-MEL-28&#160; cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffer Saline w/o Calcium w/o Magnesium</td>
			<td>EuroClone Spa, Milan, Italy</td>
			<td>ECB4004L</td>
			<td>saline buffer solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>EuroClone Spa, Milan, Italy</td>
			<td>ECS0180L</td>
			<td>ancillary for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll</td>
			<td>GE-Heathcare</td>
			<td>17-1440-02</td>
			<td>separation of mononuclear cells from human blood.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hemocytometer</td>
			<td>Neubauer</td>
			<td></td>
			<td>Cell counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparinized vials</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA</td>
			<td></td>
			<td>Vials for venous blood collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>interferon alpha-2b</td>
			<td>Millipore-Sigma; St. Louis, MO</td>
			<td>SRP4595</td>
			<td>recombinant human cytokine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 100X</td>
			<td>EuroClone Spa, Milan, Italy</td>
			<td>ECB3000D</td>
			<td>ancillary for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lympholyte cell separation media</td>
			<td>Cedarlane Labs, Burlington, Canada</td>
			<td></td>
			<td>Separation of lymphocytes by density gradient centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphoprep</td>
			<td>Axis-Shield PoC AS, Oslo, Norway</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning, New York, NY</td>
			<td>354230</td>
			<td>growth factor reduced basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231&#160;</td>
			<td>American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA</td>
			<td>&#160;HTB-26</td>
			<td>human breast cancer cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/ Streptomycin 100X&#160;&#160;</td>
			<td>EuroClone Spa, Milan, Italy</td>
			<td>ECB3001D</td>
			<td>ancillary for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet aid</td>
			<td>Drummond Scientific Co., Broomall, PA</td>
			<td>4-000-201</td>
			<td>Liquid handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKH26 Red Fluorescent cell linker</td>
			<td>Millipore-Sigma; St. Louis, MO</td>
			<td>PKH26GL</td>
			<td>red fluorescent cell dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKH67 Green fluorescent cell linker</td>
			<td>Millipore-Sigma; St. Louis, MO</td>
			<td>PKH67GL</td>
			<td>green fluorescent cell dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>EuroClone Spa, Milan, Italy</td>
			<td>ECM2001L</td>
			<td>Culture medium for MDA-MB-231 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>serological pipettes (2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL)</td>
			<td>Corning- Millipore-Sigma; St. Louis, MO</td>
			<td>CLS4486; CLS4487; CLS4488; CLS4489; CLS4490</td>
			<td>Liquid handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile tips (1-10 &#956;L, 10-20 &#956;L, 20-200 &#956;L, 1000 &#956;L)</td>
			<td>EuroClone Spa, Milan, Italy</td>
			<td>ECTD00010; ECTD00020; ECTD00200; ECTD01005</td>
			<td>tips for micropipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA</td>
			<td>15250061</td>
			<td>cell stain to assess cell viability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>EuroClone Spa, Milan, Italy</td>
			<td>ECM0920D</td>
			<td>dissociation reagent for adherent cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS-FL fluorescence microscope</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA</td>
			<td></td>
			<td>Fluorescent microscope for living cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humified cell culture incubator&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA</td>
			<td>311 Forma Direct Heat COIncubator; TC 230</td>
			<td>Incubation of cell cultures at 37 &#176;C, 5% CO2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Juli Microscope</td>
			<td>Nanoentek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory refrigerator (4 &#176;C)</td>
			<td>FDM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Safety Cabinet (Class II)</td>
			<td>Steril VBH 72 MP</td>
			<td></td>
			<td>Laminar flow hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerable centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostatic bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfabrication materials&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Aminopropyl)triethoxysilane (Aptes)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A3648</td>
			<td>silanizing agent for bonding PDMS to plastic coverslip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium quartz masks / 4&#34;x4&#34;, HRC / No AZ&#160;</td>
			<td>MB W&#38;A,&#160; Germany</td>
			<td></td>
			<td>optical masks for photolithography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip, D 263 M Schott glass,&#160; (170 &#177; 5 &#181;m)</td>
			<td>Ibidi, Germany</td>
			<td>10812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide solution 30%</td>
			<td>Carlo Erba Reagents</td>
			<td>412081</td>
			<td>reagents for piranha solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl isobutyl ketone</td>
			<td>Carlo Erba Reagents</td>
			<td>461945</td>
			<td>PMMA e-beam resist developer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Glass Slides (Pack of 50 slides) 76.2 mm x 25.4 mm&#160;</td>
			<td>Sail Brand</td>
			<td>7101</td>
			<td>substrates for bonding chips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miltex Biopsy Punch with Plunger, ID 1.0mm</td>
			<td>Tedpella</td>
			<td></td>
			<td>dermal biopsy punches for chip reservoirs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMMA&#160; 950 kDa</td>
			<td>Allresist,Germany</td>
			<td>AR-P. 679.04</td>
			<td>Positive electronic resists for patterning optical masks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymer untreated coverslips</td>
			<td>Ibidi, Germany</td>
			<td>10813</td>
			<td>substrates for bonding chips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prime CZ-Si Wafer,&#160; 4&#8221;, (100), Boron Doped</td>
			<td>Gambetti Xenologia Srl, Italy</td>
			<td>30255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propan-2-ol</td>
			<td>Carlo Erba Reagents</td>
			<td>415238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propylene glycol monomethyl ether acetate (PGMEA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>484431-4L</td>
			<td>SU-8 resists developer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 3005</td>
			<td>Micro resist technology,Germany</td>
			<td>C1.02.003-0001</td>
			<td>Negative Photoresists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 3050</td>
			<td>Micro resist technology,Germany</td>
			<td>C1.02.003-0005</td>
			<td>Negative Photoresists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suite of Biopunch, ID 4.0 mm, 6.0 mm, 8.0 mm</td>
			<td>Tedpella</td>
			<td>15111-40, 15111-60, 15111-80</td>
			<td>dermal biopsy punches for chip reservoirs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid 96%</td>
			<td>Carlo Erba Reagents</td>
			<td>410381</td>
			<td>reagents for piranha solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>Dowsil, Dow Corning</td>
			<td>11-3184-01</td>
			<td>Silicone Elastomer (PDMS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimethylchlorosilane (TMCS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>92360-100ML</td>
			<td>silanizing agent for SU-8 patterned masters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfabrication equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 kV e-beam litography</td>
			<td>Raith-Vistec EBPG 5HR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hotplate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical litography system</td>
			<td>EV-420 double-face contact mask-aligner</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reactive Ion Etching system</td>
			<td>Oxford plasmalab 80 plus system</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum dessicator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microfluidic co-culture models for dissecting the immune response in in vitro tumor microenvironments

Karmaşık hastalık modelleri, fizyolojik ve patolojik olarak alakalı, eyleme geçirilebilir içgörüler sunabilen ve aksi takdirde görünmez süreçleri ortaya çıkarabilen son teknoloji araçlar gerektirir. İn vivo manzarayı yakından taklit eden gelişmiş hücre tahlilleri, kanserin ilerlemesini etkileyen çift yönlü tümör-konakçı etkileşimini görselleştirmek ve ölçmek için yeni yollar olarak kendilerini ortaya koymaktadır. Burada, doğal ve terapiye bağlı immünosürveyans altında, tümör mikroçevresinin (TME) karmaşıklığını taklit ederek, mikrocihazlarda yüksek oranda kontrol edilebilir 2D ve 3D ko-kültürleri yeniden oluşturmak için iki çok yönlü protokolü açıklıyoruz. Bölüm 1'de, yapışkan tümör hücreleri ile yüzen bağışıklık popülasyonları arasındaki çapraz etkileşimi, parlak alan hızlandırılmış mikroskopi ile izlemek için deneysel bir ortam sağlanmıştır. Uygulamalı bir senaryo olarak, immünojenik kanser hücresi ölüm indükleyicileri olarak adlandırılan anti-kanser tedavilerinin bağışıklık hücrelerinin işe alınması ve aktivasyonu üzerindeki etkilerini analiz ediyoruz. Bölüm 2'de, 3D tümör immün mikro ortamlar rekabetçi bir düzende monte edilmiştir. Diferansiyel immün infiltrasyon, kombinasyon terapötik stratejilerini değerlendirmek için 72 saate kadar floresan anlık görüntüleri ile izlenir. Her iki ortamda da, görüntü işleme adımları, çok sayıda bağışıklık hücresi parametresini (örneğin, bağışıklık hücresi göçü ve etkileşimi, terapötik ajanlara yanıt) çıkarmak için gösterilmiştir. Bu basit ve güçlü yöntemler, kanser, stromal ve immün hücre alt tiplerinin heterojenliğini ve plastisitesini kapsayan TME'nin karmaşıklığını ve ayrıca kanser evriminin itici güçleri olarak karşılıklı etkileşimlerini simüle etmek için daha da uyarlanabilir. Hızla gelişen bu teknolojilerin canlı hücreli yüksek içerikli görüntüleme ile uyumluluğu, büyük bilgilendirici veri kümelerinin oluşturulmasına yol açarak yeni zorluklar ortaya çıkarabilir. Gerçekten de, "ortak kültürler / mikroskopi / gelişmiş veri analizi" üçgeni, özel olarak hazırlanmış terapötik protokollere yardımcı olabilecek kesin bir problem parametrizasyonuna giden yolu belirler. Yüksek verimli işleme için kansere karşı bağışıklık kazanmış çip üzerindeki yapay zeka ile gelecekteki entegrasyonunun, hassas ve kişiselleştirilmiş onkoloji için öngörücü ve klinik öncesi araçlar olarak yeteneklerden yararlanmada ileriye doğru büyük bir adım atmasını bekliyoruz.

Tümör immün infiltrasyonu, konakçı anti-tümör yanıtının bir parametresidir. Tümörler, infiltrasyon yapan lökositlerin bileşimi, yoğunluğu, lokalizasyonu ve fonksiyonel durumu bakımından heterojendir ve kanser hücreleri ile etkileşimler, hastalığın seyrini ve tedaviye yanıtı tahmin etmek için klinik olarak ilgili bilgilerin altında yatabilir. Bu anlamda, mikroakışkan teknolojiler, tümörlerin bağışıklık konstrüksiyonunu keşfetmek ve antikanser tedavilerine yanıtı izlemek için tamaml...

Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Co-Culture Models for Dissecting the Immune Response in in vitro Tumor Microenvironments at JoVE.com

Microfluidic Co-Culture Models for Dissecting the Immune Response in in vitro Tumor Microenvironments

İmmünoterapi ve tek hücreli genomik profilleme çağında, kanser biyolojisi, tümör-bağışıklık arayüzünü uygun bir mekansal zamansal bağlamda araştırmak için yeni in vitro ve hesaplama araçları gerektirir. Hücresel fonksiyonların dinamik, multiparametrik izlenmesi ile uyumlu, 2D ve 3D ortamlarda tümör-immün mikroakışkan ko-kültürlerden yararlanmak için protokolleri açıklıyoruz.

İn vitro tümör mikroortamlarında immün yanıtı diseksiyon için mikroakışkan ko-kültür modelleri

Complex disease models demand cutting-edge tools able to deliver physiologically and pathologically relevant, actionable insights, and unveil otherwise ...

Bu protokol, tümör-bağışıklık hücresi kesişmelerini görselleştirmek ve izlemek ve anti-kanser tedavilerinin etkilerini analiz etmek için mikro cihazlarda kontrol edilebilir 2D ve 3D ortak kültürler gerçekleştirmek için deneysel ortamlar sağlar. Bu teknoloji, bağışıklık hücresi alımının ve etkileşimlerinin gerçek zamanlı ve kolay bir şekilde görselleştirilmesini sağlar ve insan ve hasta kaynaklı numuneler için kullanılabilir. Son teknoloji mikroskopilerin çoğuyla uyumludur.Prosedürü gösteren, Onkoloji ve Moleküler Tıp Bölümü, Istituto Superiore di Sanita'da doktora öğrencisi Francesco Noto ve Universita Cattolica del Sacro Cuore, Translasyonel Tıp ve Cerrahi Bölümü'nde doktora öğrencisi Nicoleta Manduca ve Esther Maccafeo olacak. Talaşlar daha önce temiz odada bir plazma temizleyici veya reaktif demir aşındırma makinesinde plazma ile aktive edilir. Murin-dalak hücreleri ve bir tümör hücre hattı, metinde açıklanan protokolleri taklit etmek için burada kullanılır.Hücre süspansiyonlarını yüklemeden önce, ortamı altı rezervuarın hepsinden çekin. Daha sonra, sol üst rezervuarda ve alt kuyuda 10 ila 50 mikrolitre büyüme ortamında yeniden askıya alınan 5. tümör hücrelerine yavaşça 1 x 10 yükleyin. Sağ tarafta, 50 mikrolitre büyüme ortamında iki kuyucuğa yeniden askıya alınan 1 x 10 ila 6. yüzen bağışıklık hücrelerine yavaşça pipet yapın.Tüm hücreler eklendiğinde, her çipin altı rezervuarını 100 ila 150 mikrolitreye kadar büyüme ortamı ile doldurun ve hücrelerin her kültür bölmesinde doğru şekilde dağıtıldığını kontrol edin. Hızlandırılmış kayıttan önce sistemin stabilize olmasını sağlamak için çipi bir saat boyunca inkübe edin. Canlı hücre görüntülemesi için, tümör bağışıklığını mikroskop aşamasındaki çip plakasına monte edin.Incucyte Canlı Hücre Analiz Yazılımı gibi mikroskop yazılım arayüzündeki edinme iş akışı ayarını özelleştirin. Deney için uygun parametrelere ve incelenen hücre tiplerine bağlı olarak gözlem pencerelerini, optimum kare hızını ve zaman süresini seçin. Uygun deneysel zaman dilimi için hücreleri görüntüleyin.Soğuk uçları kullanarak iki deneysel koşul için bir ilaç veya bir ilaç kombinasyonu içeren ortamla seyreltilmiş iki matrigel alikotu hazırlayın. Canlı uyumlu, floresan boya boyalı tümör hücrelerini, hücrelerin homojen bir dağılımını elde etmek için buz üzerinde matris çözeltisinde asılı duran nazikçe pipetleyin. Çip plakası bir soğutma bloğu veya buzlu bir sepet üzerindeyken, ilaçla tedavi edilen tümör hücresi matris çözeltisini, soğuk 10 mikrolitrelik mikropipet uçları kullanarak sol ve sağ jel portlarına yavaşça enjekte edin.Matris çözeltisini kanalın bir tarafından diğerine itmek için hafif basınç uygulayın. Tüm tümör hücreleri yüklendiğinde, cihazı inkübatöre 30 dakika boyunca dik konumda yerleştirin. İnkübasyonun sonunda, matris jelasyonu tamamlandıktan sonra, altı rezervuarın tümünün orta kanallarını 50 mikrolitre kültür ortamı ile doldurun.Polimerize jel bütünlüğünü ve tümör hücresi dağılımını mikroskop altında kontrol edin. Daha sonra cipsleri bağışıklık hücresi hazırlığı tamamlanana kadar bir inkübatöre yerleştirin. Kuluçkadan sonra, ortamı her bir kuyucuktan aspire edin.Ucu orta orta kanalın girişine yakın bir yere yerleştirin ve zıt bir floresan boya ile etiketlenmiş 6. bağışıklık hücrelerine 10 mikrolitre 10 mikrolitreyi nazikçe enjekte etmek için orta basınç kullanın. Yanal kanalların dört kuyusunun her birine ortamın 50 ila 100 mikrolitresini, ortamın 40 ila 90 mikrolitresini üst merkez kuyucuğuna ve ortamın 50 ila 100 mikrolitresini alt merkez kuyucuğuna enjekte edin. Tüm kuyucuklar yüklendiğinde, bağışıklık hücresi dağılımının merkezi odayla sınırlı kaldığını doğrulamak için bir mikroskop kullanın.Daha sonra cihazı, görüntülemeye kadar hücre kültürü inkübatöründe düz bir yüzeye dikkatlice yerleştirin. Tümör bölmelerine sızan floresan boyalı canlı bağışıklık hücrelerinin derecesini hesaplamak için, floresan mikroskobu ile cihazı belirli ilgi noktalarında görüntüleyin ve Nikon NIS-Elements gibi mikroskop görüntüleme yazılımında uygun kamera parametrelerini ayarlayın. Ayrıca etiketli bağışıklık hücreleri için parametreleri ayarlayın.Lökositlerin mikroakışkan platformdaki uygun şekilde inşa edilmiş mikrokanal köprülerinden hedef hücrelerine doğru hareketi, video mikroskobu ile izlenebilir. Bu izleme analizinde, bireysel PBMC'lere ölmekte olan doksorubisin ile tedavi edilen veya canlı PBS ile tedavi edilen kanser hücreleri ile meydan okundu. İlgili kemotaksis değerleri ve migrasyon grafikleri otomatik olarak oluşturuldu ve doksorubisin veya PBS'ye maruz kalan meme kanseri hücreleri ile birlikte yüklendiğinde bağışıklık hücreleri için farklı bir göç profili gözlendi.PBMC'ler apoptotik kanser hücreleri ile karşı karşıya kaldıklarında, mikrokanalları ölmekte olan ve ölü hücrelere doğru geçtiler, ancak canlı, tedavi edilmemiş hücrelere geçmediler. 24 ila 48 saat içinde artan yoğunluğa sahip lökositlerin bir kısmı, doxo ile tedavi edilen kanser hücreleri ile uzun süreli temaslar sergiledi. Bu analizde, epigenetik ilaçların anti-kanser kombinasyonlarına yanıt olarak bağışıklık hücrelerinin işe alımını ölçmek için yeni bir 3D immünokompetan tümör modeli kullanılmıştır.Kırmızı boya etiketli PBMC'ler daha sonra homojen olarak merkezi akışkan odasına dağıtıldı. İki tümör kitlesinin PBMC'leri çekme kabiliyeti daha sonra karşılaştırıldı ve PBMC'ler bu deneyde sağ taraftaki mikrokanala sağlam bir şekilde dahil edildi. 3D model için, çözeltiyi hidrojel ve buz üzerindeki hücrelerle karıştırın, kabarcıklardan ve ön polimerizasyondan kaçının.Aşırı basınç olmadan yavaşça enjekte edin. Polimerizasyon adımlarını kullanılan matrise göre ayarlayın. Süpernatantlardan canlı/ölü hücre tahlilleri ve sitokin sekresyon profillemesi uygulanabilir.Konfokal görüntüleme için immünofloresan, immün alt tipleri sınıflandırmak ve aktivasyon ve tükenme olgunlaşmasının ekspresyon belirteçleri için yapılabilir.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Co-kültür Modelleri Pseudomonas aeruginosa</emCanlı İnsan Havayolu Hücreler Yetiştirilen> Biyofilmler

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Seven Steps to Stellate Cells

Hücreler stellat Yedi Adımda

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Paraziter Eşek Arıları Bir Giriş<em&gt; Drosophila</em&gt; Ve antiparaziter İmmün Yanıt

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. ...

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

İmmün Yanıt ve Uyku içinde kantitatif ölçümü<em&gt; Drosophila</em

A complex interaction between the immune response and  host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in  particular, is known ...

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Bir kullanma Pnömokok Kolonizasyon üzerinde Probiyotiklerin Etkileri incelenmesi<em&gt; In Vitro</em&gt; Yapışma Deneyi

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

Dissecting Innate Immune Signaling in Viral Evasion of Cytokine Production

Sitokin Üretimi Viral Evasion Doğuştan Bağışıklık Sinyalizasyonu Diseksiyon

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

Fare Makrofagların yılında Doğuştan Bağışıklık Tepkisi Soruşturma RNA girişimi kullanma

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

Batı Nil Virüsü Mutant Soy Enfeksiyon MyD88-aracılı Hücresel Bağışıklık Tepki Vitro Analizi

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Dissecting Multi-protein Signaling Complexes by Bimolecular Complementation Affinity Purification (BiCAP)

Dissecting Multi-protein Signaling Complexes by Bimolecular Complementation Affinity Purification BiCAP

Bimolecular tamamlayıcı benzeşme arıtma (BiCAP) tarafından parçalanmış çok protein sinyal kompleksleri

The assembly of protein complexes is a central mechanism underlying the regulation of many cell signaling pathways. A major focus of biomedical research ...

Two-photon Intravital Imaging of Leukocytes During the Immune Response in Lipopolysaccharide-treated Mouse Liver

İki fotonlu Lipopolysaccharide tedavi fare karaciğer bağışıklık yanıtında sırasında lökositlerin Intravital görüntüleme

Sepsis is a type of severe infection that can cause organ failure and tissue damage. Although the mortality and morbidity rates associated with sepsis are ...