Name: optimizing the growth of endothiapepsin crystals for serial crystallography experiments
Uploaded: 2021-02-04T12:30:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimizing the Growth of Endothiapepsin Crystals for Serial Crystallography Experiments at JoVE.com

تلقى هذا المشروع تمويلا من برنامج البحث والابتكار Horizon 2020 التابع للاتحاد الأوروبي بموجب اتفاقية منحة Marie Skłodowska-Curie رقم 701647. شكرا جزيلا لمساعدة ودعم علماء خط الشعاع في خط شعاع مصدر الضوء السويسري X10SA-PXII.

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

توضح الطريقة المقدمة كيفية تحسين تبلور endothiapepsin من بلورات كبيرة (أطول بعد ≥ 100 ميكرومتر) ، نمت في شاشات متفرقة ذات مصفوفة 96 بئرا ، إلى بلورات دقيقة ، نمت في أنابيب طرد مركزي (حجم 300 ميكرولتر) عبر الدفعة. الفكرة وراء البروتوكول هي أن الخطوات المتخذة لتحسين endothiapepsin يمكن استخدامها أيضا للبروتينات الأخرى. في نهاية المطاف ، الإجابة على مشكلة إنشاء كميات كبيرة (>100 ميكرولتر) من البلورات الدقيقة (10-20 ميكرومتر) لتجارب علم البلورات التسلسلية في XFELs والسنكروترونات.
يقسم البروتوكول مهمة التبلور الدقيق كبير الحجم إلى ثلاث خطوات: (1) تحسين مورفولوجيا البلورة ، (2) الانتقال إلى الدفعة ، و (3) التحجيم. في الخطوة 1 ، يجب استكشاف مجموعة الأشكال البلورية التي يمكن أن ينتجها البروتين في ألواح انتشار البخار. يجب أن تكون الظروف التي تؤدي إلى بلورات مفردة تشبه الصندوق تنحرف إلى الدقة المطلوبة هي الهدف. في الخطوة 2 ، يمكن بعد ذلك تحويل الظروف المحددة من انتشار البخار إلى الدفعة. هنا ، معيار التحسين هو وقت نمو البلورات وإيجاد الظروف التي تؤدي إلى بلورات البروتين في غضون 24 ساعة. يمكن أيضا رسم مورفوجرام لإعطاء المجرب فكرة عن موقع خط الذوبان وحدود منطقة النواة. هذا المورفوغرام له فائدة كبيرة في الخطوة 3 ، التحجيم. سيعطي المورفوجرام مؤشرا على ما إذا كانت النواة وحدها يمكن أن تزيد Xn وتدفع Xs إلى أسفل. مع زيادة حجم التجربة ، يمكن تقييم Xn و Xs باستمرار كمعايير رئيسية لتوسيع نطاق النجاح.
في حالة Endothiapepsin ، اكتشفت الخطوة 1 ما يحتمل أن يكون مورفولوجيا بلورية غير معروفة سابقا ل endothiapepsin. كان لهذا التشكل نفس المجموعة الفضائية مثل تلك التي تم الإبلاغ عنها سابقا ، ولكن الأهم من ذلك بالنسبة لعلم البلورات التسلسلي ، شكل يشبه الصندوق. يبدو أيضا أن البلورات المفردة تنمو من نقاط نواة مفردة ، على عكس المراوح التي تم إنشاؤها من ظروف أخرى (الشكل 4). بالنسبة للحالة المحددة ، كانت الخطوة 2 راضية جزئيا بالفعل حيث حدث نمو بلوري في < 24 ساعة. أشار المورفوجرام إلى أن كلا من بروتوكول الدفعات المستقيمة أو المصنفة قد يكون ناجحا عند التوسع في الخطوة 3. أدى التحجيم الأولي في دفعة مستقيمة إلى إنشاء حالة أنتجت بلورات بنطاق Xn و Xs من 3.6 ± 1.2 × 106 بلورات · mL-1 و 42 ± 4.1 ميكرومتر ، على التوالي. هذه البلورات ، على الرغم من أنها مقبولة لبعض تجارب علم البلورات التسلسلي ، اعتبرت كبيرة جدا. لذلك تم إجراء تحسينات إضافية. أنتج البروتوكول النهائي بلورات بتركيز ونطاق حجم 3.1 × 106 بلورات · مل -1 و 15 ± 3.9 ميكرومتر ، على التوالي. كان هذا أكثر من مثالي للتجارب المخطط لها.
تركز الطريقة على تحويل بلورات البروتين "القابلة للذوبان" المزروعة في ألواح انتشار البخار إلى دفعة. والسبب في هذا التركيز هو أن الغالبية العظمى من بلورات البروتين القابلة للذوبان تزرع عن طريق انتشار البخار26. ومع ذلك ، يمكن أيضا تطبيق المفاهيم المقدمة على بلورات البروتين القابلة للذوبان المزروعة باستخدام طرق أخرى ، مثل الدفعة الدقيقة. قد تكون المفاهيم قابلة للتطبيق أيضا على بلورات البروتين الغشائية المزروعة في LCP. لأن هذه أيضا عملية بلورة دفعية.
يتمثل أحد الجوانب الرئيسية للبروتوكول في عملية تحويل ظروف البلورات المزروعة في ألواح انتشار البخار بحيث يمكن زراعتها دفعة واحدة. لهذا التحول ، تستخدم الطريقة المعيار الذي اقترحه Beale et al. (2019) 26. تتشكل البلورات المزروعة عبر عملية الدفعات ، حتى في ألواح انتشار البخار ، بسرعة (< 24 ساعة). هذا المعيار هو تقريب يعتمد على سرعة توازن انخفاض انتشار البخار ، وهو أكثر صحة بالنسبة لظروف الراسب القائمة على PEG. ومع ذلك ، ستحتوي ظروف التبلور على مجموعة متنوعة من المركبات التي ستؤثر على وقت التوازن. يمكن أن يحدث توازن ظروف التبلور القائمة على الملح ، على سبيل المثال كلوريد الأمونيوم عالي التركيز ، في 1-2 أيام. لذلك ، قد لا يكون معيار 24 ساعة صحيحا بالنسبة للظروف القائمة على الملح. يمكن أن تحتوي الظروف القائمة على الملح أيضا على مخططات طور أكثر تعقيدا 26,30 قد لا تتوافق مع النموذج الأصلي المقدم في هذا البروتوكول. قد يكون من الضروري تقليل المعيار الزمني للظروف القائمة على الملح إلى 12 أو 6 ساعات إذا ثبت أن التوسع إلى أحجام أكبر مستحيل.
قيد آخر لهذه الطريقة هو تعقيدها الواضح. البروتوكول الذي تم اتباعه لتحسين التبلور الدقيق للإندوثيابسين غير الحالة الأصلية من شاشة المصفوفة المتناثرة قليلا نسبيا. كانت الضربة الأولى التي لوحظت في شاشة PACT هي 0.1 HEPES pH 7.0 و 0.2 M MgCl2 و 20٪ (وزن / حجم) PEG 6000. كان المخزن المؤقت النهائي للتبلور المتدرج 0.1 Tris-HCl pH 7.0 و 0.15 M MgCl2 و 40٪ (w / v) PEG 6000. من الممكن أيضا أن يكون التغيير في المخزن المؤقت من HEPES إلى Tris-HCl ، وتركيز MgCl2 ، قد ساهم قليلا في نجاح العملية. ترك الزيادة في تركيز PEG 6,000 هو التحسين الوحيد ، والذي كان من الممكن تحقيقه بكل بساطة.
غير أن هذا التقييم مفرط في التبسيط. إنه لا يقلل فقط من المشاكل التي تواجهها أثناء التحجيم (أي استخدام البذور والتبريد) ، ولكن أيضا حقيقة أنه لمجرد أن هذا البروتين أثبت أنه واضح ومباشر ، فليس هناك ما يضمن أن البروتين التالي سيثبت أيضا. تم وضع الخطوات الموصى بها في البروتوكول لأن تحسين حجم أحجام بلورة البروتين يمكن أن يكون مكلفا للغاية بالنسبة للبروتين. خلال تجارب تحجيم الإندوثيابسين السبع الموضحة ، تم استهلاك 100 ملغ من البروتين. ومن المسلم به أن بعض هذه الخطوات قد نفذت لإظهار عواقبها في ضوء هذا البروتوكول. ومع ذلك ، فإن 100 ملغ من البروتين ، بالإضافة إلى 50 ملغ أخرى للبروتين المستهلك أثناء التجربة (الجدول 1) ، يمكن أن يكون استثمارا كبيرا في الوقت أو المال.
لحسن الحظ ، ليس من الواضح أن هذه الكتلة من العينة المطلوبة موجودة في كل مكان عبر جميع البروتينات. كان Endothiapepsin قابلا للذوبان بدرجة عالية ، وبالتالي يتطلب تركيزا كبيرا من البروتين للوصول إلى التشبع الفائق. في حالات أخرى (قيد التحسين حاليا) ، يمكن الوصول إلى التشبع الفائق عند 10 أو حتى 5 مجم / مل. هذه المتغيرات خاصة بالبروتين وتحتاج إلى تبنيها عند ظهورها.
تشمل القيود الأخرى للطريقة اعتمادها على المعدات المعقدة مثل روبوتات معالجة السوائل لإنشاء الشاشة واللوحة ، وأجهزة التصوير لتصوير اللوحات تلقائيا عند الحاجة. تم تقديم إجراءات بديلة للحد من الحاجة إلى بعض هذه القطع من المعدات ، لكن البروتوكول سيستغرق وقتا أطول للمتابعة بدونها. يقترح البروتوكول أيضا اختبار حيود البلورات المحسنة. بالنسبة لعلماء البلورات الذين ليس لديهم وصول منتظم إلى السنكروترون ، قد تكون هذه الاختبارات صعبة. قد لا تكون عناصر التحكم في كل خطوة ضرورية ، ولكن يوصى بشدة بهذه الاختبارات بمجرد تحديد النتيجة ، وقبل القياس وبعده. البلورات غير الحيود في XFEL ، للأسف ، ليست أمرا غير شائع. بالنظر إلى هذا ، من الأفضل أن نخطئ في جانب الحذر فيما يتعلق بالافتراضات حول حيود البلورة.
في النهاية ، سيقدم هذا البروتوكول والنتائج المعروضة هنا دليلا وأفكارا ومثالا لأولئك الذين يكافحون من أجل إنتاج عينات لتجارب علم البلورات التسلسلية. ومن المأمول، مع زيادة تطوير علم البلورات التسلسلي، أن تقل متطلبات العينات لهذه التقنية بحيث تقل الحاجة إلى بروتوكولات كهذه. ومع ذلك ، حتى في هذا الحدث ، ستظل الاستراتيجيات المقدمة هنا مفيدة لأولئك الذين يرغبون في استكشاف مساحة تبلور البروتين الخاصة بهم.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Swissci 96-well 2-Drop plates</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD11-002</td>
			<td>96-well 2-drop crystallisation plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swissci 96-well 3-Drop plates</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD11-003</td>
			<td>96-well 3-drop crystallisation plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mosquito LCP liquid handling robot</td>
			<td>sptlabtech</td>
			<td>mosquito LCP</td>
			<td>Crystallisation robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClearVue Sheets</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD6-015</td>
			<td>96-well crystallization plate seals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Tube 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td>1.5 mL centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scaple</td>
			<td>Swan and Morton</td>
			<td>No. 3 scalple and No. 3 handle</td>
			<td>Scalple for cutting open plate seals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS 3 Vortex</td>
			<td>IKA</td>
			<td>3319000</td>
			<td>Vortex for mixing solution and making seed stocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well XRL Plate</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD3-11</td>
			<td>24-well hanging-drop plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube revolver/rotator</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>88881001</td>
			<td>Tube revolver for mixing solution during scaling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Research plus pipettes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>Range of manual pipettes, 0.5-10, 1-20, 10-100, 100-1000 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf pipette tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>Range of tip sizes for manual pipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suparen 600</td>
			<td>Prochem AG</td>
			<td>Suparen 600</td>
			<td>Endothiapepsin solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>241245-1KG</td>
			<td>Sodium Acetate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8382T014</td>
			<td>Tris</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670-1kg</td>
			<td>Magnesium Chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG 6,000</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>81255-1kg</td>
			<td>PEG 6,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethelyene glycol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>324558-1L</td>
			<td>Ethelyene glycol for cyro-protecting the crystals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PACT Premier HT screen</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD1-36</td>
			<td>PACT Premier 96-well crystal screen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOW CORNING high vacuum grease</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD6-02</td>
			<td>Grease for sealing 24-well plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hirschmann 22 x 22 mm glaser cover slides</td>
			<td>Hirschmann</td>
			<td>8000104</td>
			<td>Cover slides for sealing 24-well sitting drop plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal pins</td>
			<td>PSI</td>
			<td>Manufactured inhouse</td>
			<td>Thin-film supports for micro-crystals.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-1.3 mm SiLibeads Type S</td>
			<td>Faust</td>
			<td>6239547</td>
			<td>Glass beads for making mico-seed stocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macbook Pro</td>
			<td>Apple</td>
			<td>Macbook Pro</td>
			<td>Computer for performing data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCP4 software suite</td>
			<td>CCP4</td>
			<td></td>
			<td>Diffraction pattern data processing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>Microsoft Office</td>
			<td>Plotting tool for phase diagram</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hausser Scientific Bright-Line counting chamber</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>02-671-51B</td>
			<td>Tool to calculate crystal concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PACT Premier</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD1-29-ECO</td>
			<td>Sparse-matrix crystallization screen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rock Imager</td>
			<td>Formulatrix</td>
			<td>Rock Imager</td>
			<td>Temperature controlled crystal plate storage and imager</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rock MakerWeb</td>
			<td>Formulatrix</td>
			<td>Rock MakerWeb</td>
			<td>Crystal plate creation and image storage stoftware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formulator</td>
			<td>Formulatrix</td>
			<td>Formulator</td>
			<td>96-well crystal screen creation liquid handling robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica MZ16 Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica MZ16</td>
			<td>Light microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS V4.6</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LAS V4.6</td>
			<td>Software for Leica microscopes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectra/Por 3.5 kDa dialysis tubing</td>
			<td>Spectrumlabs</td>
			<td>Spectra/Por 3 Dialysis Membrane</td>
			<td>3.5 kDa dialysis membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing closures</td>
			<td>Spectrumlabs</td>
			<td>Spectra/Por 3 Duniversal Closures</td>
			<td>Clips to seal the dialysis tubing ends</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon 10 kDa centrifugal concentrator</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>Amicon Ultra-15 10 kDa centrifugal concentrator</td>
			<td>10 kDa centrifugal filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5810 R swing bucket centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810 R Centrifuge</td>
			<td>Swing bucket centrifuge</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimizing the growth of endothiapepsin crystals for serial crystallography experiments

هنا ، يتم تقديم بروتوكول لتسهيل إنشاء كميات كبيرة (> 100 ميكرولتر) من الملاط البلوري الدقيق المناسب لتجارب علم البلورات التسلسلي في كل من السنكروترونات و XFELs. تعتمد الطريقة على فهم مخطط الطور البلوري للبروتين ، وكيف يمكن استخدام هذه المعرفة. تنقسم الطريقة إلى ثلاث مراحل: (1) تحسين التشكل البلوري ، (2) الانتقال إلى الدفعة ، و (3) التحجيم. تتضمن المرحلة 1 العثور على بلورات مفردة حيود بشكل جيد ، نأمل ولكن ليس بالضرورة ، في شكل يشبه المكعب. في المرحلة 2 ، يتم تحسين حالة المرحلة 1 من خلال وقت نمو البلورة. يمكن لهذه الاستراتيجية تحويل البلورات المزروعة عن طريق انتشار البخار إلى دفعة. بمجرد أن يحدث نمو بلوري في غضون 24 ساعة تقريبا ، يمكن رسم مورفوجرام للبروتين وخليط الراسب واستخدامه كأساس لاستراتيجية التحجيم (المرحلة 3). عندما يمكن زراعة البلورات دفعة واحدة ، يمكن محاولة التحجيم ، وتحسين حجم البلورة وتركيزها مع زيادة الحجم. تم استخدام Endothiapepsin كبروتين توضيحي لهذا البروتوكول. بعض القرارات المقدمة خاصة بالإندوثيابسين. ومع ذلك ، من المأمول أن تلهم الطريقة التي تم تطبيقها بها طريقة للتفكير في هذا الإجراء يمكن للآخرين تكييفها مع مشاريعهم الخاصة.

Watch this Scientific Journal Video about Optimizing the Growth of Endothiapepsin Crystals for Serial Crystallography Experiments at JoVE.com

Optimizing the Growth of Endothiapepsin Crystals for Serial Crystallography Experiments

الهدف من هذه المقالة هو إعطاء المشاهد فهما قويا لكيفية تحويل بروتوكول انتشار البخار صغير الحجم ، لزراعة بلورات بروتينية كبيرة مفردة ، إلى طريقة تبلور دقيق دفعة كبيرة الحجم لعلم البلورات التسلسلي.

تحسين نمو بلورات الإندوثيابسين لتجارب علم البلورات التسلسلي

Here, a protocol is presented to facilitate the creation of large volumes (&#62; 100 &#181;L) of micro-crystalline slurries suitable for serial ...

يمكن أن تكون تجارب علم البلورات التسلسلي صعبة. العقبة الرئيسية في ممارستهم هي إنشاء عينات الجريزوفولفين. يوضح هذا البروتوكول كيف يمكن إنشاء هذه العينات بشكل موثوق.تستخدم هذه الطريقة endothiapepsin لإعطاء إطار لتحسين البلورات الكبيرة المزروعة في ألواح انتشار البخار صغيرة الحجم إلى ملاط الجريزوفولفين كبير الحجم. لا يمكننا الادعاء بأن هذا البروتوكول سيكون ناجحا عالميا. ومع ذلك ، نأمل أن الأفكار والأساليب المقترحة هنا تعطي الآخرين إطارا تجريبيا لتوظيفه على البروتينات الأخرى.للبدء ، قم بإعداد صفيحة بئر 96 قطرتين باستخدام مخزن التبلور باستخدام روبوت Formulatrix. باستخدام مزيج روبوت مناولة السوائل ، امزج 150 نانولترا من إندوثيابسين المذاب حديثا مع 150 نانولترا من مخزن التبلور في كل بئر. أغلق اللوحة واترك البلورات تنمو لمدة 24 ساعة داخل فندق Formulatrix.بعد 24 ساعة ، قم بتفتيت وإزالة البلورات من خمسة آبار من لوحة التبلور المكونة من 96 بئرا. ضعها في 250 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتبلور في أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 ملليلتر يوضع في دلو ثلج. أضف 10 إلى 15 حبة زجاجية بحجم ملليمتر واحد في أنبوب الطرد المركزي.دوامة البلورات والخرز عند 1000 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية ، واستبدالها على الجليد لمدة 30 ثانية. يمكن بعد ذلك استخدام البذور على الفور أو تخزينها عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر. لإجراء تجربة مورفوجرام ، أضف خمسة إلى 40٪ تركيزات من PEG 6000 مع ضرس واحد Tris-HCl عند الرقم الهيدروجيني سبعة و 0.15 مولار كلوريد المغنيسيوم على طول أعمدة اللوحة لشاشة شبكية ذات قطرتين 96 بئرا إصلاح التخفيف المتسلسل للإندوثيابسين في 0.1 أسيتات الصوديوم المولية من 100 إلى 12.5 ملليغرام لكل ملليلتر على ثماني خطوات.ثم ماصة ثمانية ميكرولتر من كل تخفيف متبوعا باثنين ميكرولتر من مخزون البذور في لوحة روبوت مناولة السوائل. باستخدام روبوت مناولة السوائل ، قم بتوزيع 150 نانولترا من كل تخفيف للإندوثيابسين في الآبار الفرعية الأولى والثانية من الشاشة. متعدد الشفط 50 نانولترا من مخزون البذور المذابة و 100 نانولتر من محلول البئر من البئر الفرعي الثاني ووزع كلاهما في محلول البروتين.امزج المحاليل ثلاث مرات عند إضافة محلول التبلور أو محلول التبلور ومزيج البذور. الآن أغلق اللوحة والصورة عند صفر وثلاث وست و 12 و 18 و 24 ساعة من اليوم الأول كل يوم للأسبوع الأول وكل أسبوع للأسابيع الأربعة التالية عند 20 درجة سلزية. بعد 24 ساعة ، انظر إلى اللوحة تحت المجهر ، وقم بتقدير عدد البلورات داخل كل بئر وقياس عينة من البلورات.سجل هذه التقديرات في ورقة عمل مولد مورفوجرام المقدمة. أدخل تركيزات البداية من endothiapepsin و PEG 6000 في الصناديق المناسبة. ستقوم ورقة العمل تلقائيا برسم النتائج بتنسيق مخطط الطور التقليدي مع تركيزات المرسب والبروتين على المحور X و Y على التوالي.تشير ظروف البئر التي تؤدي فقط إلى ظهور بلورات في قطراتها المصنفة إلى منطقة MetaStable في الرسم البياني ، في حين أن الظروف مع البلورات في كل من القطرات المصنفة وغير المصنفة تشير إلى منطقة النواة. من تحليل المورفوغرام ، حدد الشرط الواعد للتوسع إلى 24 لوحة بئر. ثم ابدأ ب 100 ملليغرام لكل ملليلتر من إندوثيابسين و 35٪ PEG 6000.تحضير خمسة ملليلتر من المخزن المؤقت للتبلور مع 35٪ PEG 6000 ، 0.1 مولار Tris-HCl مع الرقم الهيدروجيني سبعة ، و 0.15 كلوريد المغنيسيوم المولي. الآن ضع 0.5 ملليلتر من المخزن المؤقت للتبلور في ثلاثة آبار من لوحة إسقاط معلقة مدهونة ب 24 بئرا. امزج 15 ميكرولترا من الإندوثيابسين مع 15 ميكرولترا من محلول التبلور على زلة غطاء زجاجي.ضع المحلول فوق الآبار واترك الطبق لمدة 24 ساعة. بعد 24 ساعة ، انظر إلى اللوحة تحت المجهر ، وقم بتقدير عدد البلورات في القطرة ، وقياس حجمها. إذا كانت البلورات غير صحيحة ، كرر هذه الخطوة ، ولكن قم بتغيير تركيز البروتين أو أضف البذور إذا لم تكن نواة البلورة عالية بما يكفي.كرر تجربة تحجيم 24 بئرا عن طريق إضافة البذور بتركيز أعلى من PEG 6000. ضع 0.5 ملليلتر من مخزن التبلور الجديد في ثلاثة آبار من صفيحة معلقة مدهونة ب 24 بئرا. ضع 15 ميكرولترا من إندوثيابسين على غطاء زجاجي واخلط خمسة ميكرولترات من مخزون البذور و 10 ميكرولترات من محلول التبلور مع محلول إندوثيابيبسين.اقلب زلات الغطاء ، وضعها فوق الآبار ، واتركها لمدة 24 ساعة. أعد فحص القطرات لمعرفة ما إذا كانت البلورات أصغر حجما ولها تركيز أعلى. قم بتقدير عدد البلورات في القطرة وقياس حجمها مرة أخرى لمعرفة ما إذا كانت الآن بالحجم الصحيح.لتنفيذ بروتوكول دفعة البذور ، قم بإعداد المخزن المؤقت للتبلور بنسبة 40٪ PEG 6000 ، و 0.1 مولار Tris-HCl مع درجة حموضة سبعة ، و 0.15 مولار كلوريد المغنيسيوم. امزج مسبقا 50 ميكرولترا من مخزون البذور و 100 ميكرولتر من محلول التبلور ، واخلطه بمحلول البروتين في أنبوب الطرد المركزي 1.5 ملليلتر. دوامة الأنبوب لمدة 10 ثوان ووضعه على الروك أو شاكر عند 20 درجة مئوية.خذ حصصة 2.5 ميكرولتر من محلول الدفعات كل 20 دقيقة. مراقبة حجم وعدد البلورات باستخدام مقياس الدم. احسب عدد البلورات وقياس حجمها تحت المجهر.عندما تصل البلورات إلى حوالي 15 ميكرون ، قم بإخماد التفاعل ب 150 ميكرولتر من 0.5 مولار أسيتات الصوديوم المكملة ب 0.5 مولار Tris-HCl و 0.075 مولار كلوريد المغنيسيوم و 20٪ PEG 6000. أعد فحص حجم البلورة وتركيزها باستخدام مقياس الدم. قم بتخزين البلورات على حرارة 20 درجة مئوية.اقترح تحليل مورفوغرام الإندوثيابسين أن النواة تأثرت بكل من تركيزات البروتين والراسب. يمكن تمييز مناطق MetaStable و nucleation و Precipitation في الرسم البياني بشكل جيد. أدت إضافة البذور إلى زيادة كبيرة في عدد البلورات مقارنة بالقطرات بدون بذور.كشف تحليل التبلور الدقيق للإندوثيابسين في أحجام 200 إلى 300 ميكرولتر عن التغيرات في نواة البلورة وأطول بعد بمرور الوقت. زيادة تركيز PEG إلى 35٪ تحسن بشكل ملحوظ في التبلور ، مع تركيز بلوري نهائي يبلغ حوالي 3.6 مرات 10 إلى ستة لكل مليلتر ، وأطول بعد بلوري يبلغ 42 ميكرومتر. لتقليل حجم البلورات النهائية ، تم تطبيق نهج تقليل تركيز البروتين ، مما أدى للأسف إلى تقليل تركيز البلورات بشكل كبير ، وفي النهاية أنتج بلورات أكبر.ومع ذلك ، فإن نهج زيادة تركيز PEG إلى 40٪ أسفر عن بلورات حوالي 3.1 مرات 10 إلى ستة لكل مليلتر وحجم حوالي 39 ميكرومتر. علاوة على ذلك ، أدت إضافة البذور إلى زيادة كبيرة في تركيز البلورات ، حوالي 1.1 مرة 10 إلى ثمانية لكل ملليلتر وأبعاد أصغر تبلغ حوالي 4.2 ميكرومتر. أعطى تأثير التبريد الذي تمت محاولته في تفاعل التبلور تركيزا بلوريا نهائيا يبلغ حوالي 2.6 في 10 إلى ستة لكل مليلتر وحجم حوالي 15 ميكرومتر.أظهر نصف CC المرسومة مقابل الدقة من بيانات الأشعة السينية انخفاضا طفيفا في الدقة البلورية من أحجام 10 ميكرولتر إلى 200 إلى 300 ميكرولتر. ومع ذلك ، لا تزال البلورة تنحرف إلى 1.5 قلق ، وهو ما اعتبر كافيا. Endothiapepsin هو بروتين متسامح للعمل معه.نأمل أن تؤدي تجربة بروتوكول endothiapepsin هذا إلى توليد أفكار وطرق مفيدة للبروتينات الأخرى. خاصة مع علم البلورات ، من المفيد أن نرى كيف تبدو الأشياء وتشعر بها بدلا من محاولة اتباع بروتوكول مكتوب فقط. نأمل أن يمنحك هذا الفيديو بعضا من هذا الشعور.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography

إعداد وتسليم Microcrystals البروتين في المرحلة مكعب شحمي عن المسلسل الفيمتو ثانية البلورات

Membrane proteins (MPs) are essential components of cellular membranes and primary drug targets. Rational drug design relies on precise structural ...

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

الآلي الصوتية الاستغناء عن التخفيف المسلسل من الببتيد ناهضات في الفعالية تحديد فحوصات

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

الجريزوفولفوغرافيا من بلورات البروتين و<em&gt; في سيليولو</em&gt; الانعراج

The advent of high-quality microfocus beamlines at many synchrotron facilities has permitted the routine analysis of crystals smaller than 10 &#181;m in ...

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

تنامي البلورات البروتينية مع أبعاد متميزة باستخدام الآلي تبلور مقرونا في الموقع الحيوي تشتت الضوء

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

وصف جليكوبروتينس مع حظيرة الغلوبولين المناعي علم البلورات بالأشعة السينية والتقنيات الفيزيائية الحيوية

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

حامل عينة الكل في واحد لبلورات الأشعة السينية الجزيئية مع الحد الأدنى من تشتت الخلفية

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

التصوير البلوري بالأشعة السينية لدراسة انتقال الدولة أوليغومريك من Thermotoga maritima M42 أمينوببتيداسي TmPep1050

The M42 aminopeptidases form functionally active complexes made of 12 subunits. Their assembly process appears to be regulated by their metal ion ...

Derivatization of Protein Crystals with I3C using Random Microseed Matrix Screening

اشتقاق بلورات البروتين مع I3C باستخدام عشوائي Microseed مصفوفة الفرز

Protein structure elucidation using X-ray crystallography requires both high quality diffracting crystals and computational solution of the diffraction ...

Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip

التبلور والتصميم الهيكلي للانزيم: مجمع الركيزة بواسطة البلورات التسلسلية في رقاقة Microfluidic متعددة الاستخدامات

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We ...

Workflow and Tools for Crystallographic Fragment Screening at the Helmholtz-Zentrum Berlin

سير العمل وأدوات لفحص الأجزاء البلورية في هيلمهولتز-زينتروم برلين

Fragment screening is a technique that helps to identify promising starting points for ligand design. Given that crystals of the target protein are ...