Name: optimizing the growth of endothiapepsin crystals for serial crystallography experiments
Uploaded: 2021-02-04T12:30:00
Duration: 9 min 52 s
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该项目已根据玛丽·斯克洛多夫斯卡-居里赠款协议第 701647 号获得了欧盟地平线 2020 研究和创新计划的资助。非常感谢瑞士光源光束线X10SA-PXII光束线科学家的帮助和支持。

注意：所有96孔坐滴结晶实验均使用2或3滴板进行设置。使用液体处理机器人和结晶成像仪/酒店来促进所有96孔筛选的制备和监测。结晶实验的所有试剂浓度均以混合前的起始浓度给出。
1. 优化晶体形态
注意：步骤 1.1.1.和 1.1.6.描述如何发现内硫肽结晶条件，以及如何优化这些条件以找到产生单个衍射良好晶体的单一条件。
<ol><li>稀疏矩阵优化
	<ol><li>准备新鲜的内噻菌素溶液。 注意：内硫肽，当作为Superan 600采购时，必须缓冲液从其储存溶液中转移出来并浓缩。<ol><li>在4°C下制备3L的0.1M Na乙酸盐pH 4.6。</li>
			<li>切开20厘米的透析管，在缓冲液中短暂洗涤。使用夹子密封管的一端，将 50 mL 内噻性肽溶液放入管中，然后密封另一端。</li>
			<li>将溶液在4°C下在1L乙酸钠缓冲液中透析至少4小时（或过夜）。由于储存缓冲液的成分，透析袋中的溶液现在约为100 mL。</li>
			<li>将含有内硫肽的透析袋转移到新鲜升4°C，0.1M 乙酸钠pH 4.6中。再次重复此步骤，使原始缓冲液已针对醋酸钠稀释2000倍。</li>
			<li>内硫肽现在约为 10 mg/mL。使用 10 kDa 离心浓缩器和离心机浓缩至 100 mg/mL。</li>
			<li>将内噻菌肽溶液在液氮中以50μL等分试样快速冷却，并储存在-80°C。</li>
		</ol></li>
		<li>准备PACT Premier 96孔稀疏矩阵筛选。
		<ol><li>使用液体处理机器人，将 100 nL 的 70 mg/mL 内硫肽和 100 nL 的孔溶液分配到每孔的单个子孔中。加入结晶缓冲液后，将蛋白质和孔溶液混合3次。</li>
			<li>密封板并在20°C下放置28天，每天拍摄图像，第一周，然后每周拍摄图像，持续4周。</li>
		</ol></li>
		<li>稀疏矩阵分析
		<ol><li>识别产生单个内噻菌素晶体的命中。从PACT筛选中，含有MgCl2 的条件以单例而不是针簇的形式生长。</li>
		</ol></li>
		<li>稀疏矩阵优化
		<ol><li>从包含步骤1.1.3.1中确定的条件的MgCl2 中，创建一个随机组合和改变不同孔组分的96孔筛选。</li>
			<li>使用液体处理机器人，将 100 nL 的 70 mg/mL 内硫肽和 100 nL 的孔溶液分配到每孔的单个子孔中。加入结晶缓冲液后，将蛋白质和孔溶液混合3次。</li>
			<li>密封板并在20°C下放置28天，每天拍摄图像，第一周，然后每周拍摄图像，持续4周。</li>
		</ol></li>
		<li>优化分析
		<ol><li>使用合适的电子表格软件，根据晶体质量和沉淀水平对产生晶体的结晶条件进行排名，无晶体（0）到理想（5）和低（0）到高（5）。关于晶体质量，广泛的标准是具有盒状形态的单晶。</li>
			<li>对结晶条件含量与晶体数量和沉淀水平进行皮尔逊相关性分析。</li>
			<li>将这些数据绘制为热图。寻找与首选结果相关的成分和条件。</li>
		</ol></li>
		<li>衍射分析。
		<ol><li>通过执行X射线衍射实验，确认从步骤1.1.5中确定的条件生长的晶体适用于连续晶体学。</li>
			<li>将来自每个已识别条件的内硫肽晶体样品加载到支持物上，以便在100或293 K下收集数据并进行X射线衍射实验。如果在冷冻下工作，请使用 25% 乙二醇作为冷冻保护剂。</li>
			<li>通过合适的软件套件 处理 这些数据。内硫肽晶体的衍射应超过1.5 Å。检查孪晶，因为孪晶晶体会使连续晶体学数据处理显著复杂化。</li>
			<li>如果晶体是单元素并且衍射到1.5 Å，则继续执行步骤2。如果没有，请返回步骤 1.1.2 并尝试更多稀疏矩阵筛选来识别有希望的条件。在步骤1.1.5中进行分析后。和1.1.6.，结晶条件为25%（w/v）PEG 6，000，0.1 M Tris-HCl pH 7.0和0.15 M MgCl2 应该是近似理想的。</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>2. 过渡到批处理
<ol><li>形态图实验
	<ol><li>创建微晶种子原种。 注意：制作种子时，最佳做法是用专门为该任务种植的晶体制作种子。这极大地有助于提高可重复性。步骤2.1.1.1至2.1.1.11中提出的其他想法是始终使用从标准数量的孔（此处为5孔）生长的晶体，并在制备出用于否定冻融循环的库存后将其等分。<ol><li>准备一个96孔结晶板，其中含有结晶缓冲液的孔：25%（w / v）PEG 6，000，0.1 M Tris-HCl pH 7.0和0.15 M MgCl2。</li>
			<li>使用液体处理机器人，将 200 nL 解冻的 70 mg/mL 内硫肽和 200 nL 孔溶液分配到每孔的单个子孔中。加入结晶缓冲液后，将蛋白质和孔溶液混合3次。</li>
			<li>密封板并放置24小时。</li>
			<li>用 250 μL 结晶缓冲液和 10-15 个 1 mm 玻璃珠填充 1.5 mL 离心管。将离心管放在冰上冷却5-10分钟。</li>
			<li>选择5个有晶体的孔，用手术刀打开孔，然后使用移液器尖端压碎孔中的晶体。</li>
			<li>从冰冻离心管中吸出 1 μL 缓冲液，用于均质粉碎的晶体浆液。均匀后，吸出整个浆液并收集在冷却的离心管中。</li>
			<li>对5个子孔中的每一个重复步骤2.1.2.6。</li>
			<li>以1000rpm的速度涡旋含有缓冲液，混合浆液和珠子的离心管30秒。</li>
			<li>将离心管放回冰上30秒。</li>
			<li>再重复步骤 2.1.2.8 和 2.1.2.9 两次。</li>
			<li>种子原液现已准备就绪，可以等分成 10 μL 批次并储存在 -20 °C。</li>
		</ol></li>
		<li>进行形态图实验。
		<ol><li>准备一个 2 滴 96 孔网格筛选。沿板柱将PEG 6，000的浓度从5%变化至40%（w / v），将缓冲液和盐分别保持在0.1 M Tris-HCl pH 7.0和0.15 M MgCl2。</li>
			<li>在 0.1 M 乙酸钠 pH 4.6 中从 100 至 12.5 mg/mL 分 8 个步骤连续稀释内硫肽。每排板将使用不同浓度的内噻菌素。</li>
			<li>使用液体处理机器人，将 150 nL 的内硫肽分配到子孔 1 和 2 中。在子孔 1 中，分配 150 nL 的孔溶液。在子孔 2 中，多次吸出 50 nL 解冻种子原液和 100 nL 孔溶液，然后将两者分配到蛋白质溶液中。加入结晶缓冲液后混合溶液3次。</li>
			<li>密封板并在20°C下每0，3，6，12，18，24小时拍摄一次图像，然后第一周每天拍摄一次，接下来的四周每周一次。如果无法进行自动成像，则不必担心第 1 天的每小时成像。</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>形态图分析
	<ol><li>查看24小时后拍摄的图像，估计每个孔中存在的晶体数量，并将这些估计记录在提供的“形态图生成器”工作表中。这些估计不必精确;单独计数数千个微晶（如果存在）是不切实际或必要的。主要是尽量确保整个板块的估计值一致。 注意：24小时规则基于Beale 等人 （2019）26中的观察结果。蒸汽扩散结晶条件可能需要数天或数周才能平衡。快速出现的晶体更有可能 是通过批处理过程而不是 液滴成分的逐渐平衡而生长的。因此，24小时标准有些武断，批次和蒸汽扩散实验之间的确切截止时间将取决于条件的特定混合物[见Beale 等人。 (2019)26 了解完整详情]。</li>
		<li>在指示的框中输入内硫肽和PEG 6，000的起始浓度。</li>
		<li>工作表将自动以传统的相图格式绘制结果，分别在 x 轴和 y 轴上显示沉淀剂和蛋白质浓度。仅在晶种液滴中产生晶体的井条件表示图表的介稳区域（透明蓝色），而在晶种和非晶种液滴中都有晶体的条件表示成核区（纯绿色）。 注意：理想情况下，大部分成核区应存在于图表上（即，图表底部有一些透明孔，并且在高蛋白质和沉淀剂浓度下应该可以看到一些沉淀物）。如果不是这种情况，也许重复实验，但增加蛋白质和/或沉淀剂浓度（如果可能）。</li>
		<li>如果晶体在不到24小时内出现，请继续执行步骤2.3.1。如果没有，请继续执行步骤 2.4 并继续针对批处理进行优化。</li>
	</ol></li>
	<li>晶体分析
	<ol><li>如步骤1结束时所述，在进入下一步之前，请确保这些晶体具有所需的形态和衍射质量。关于形态，晶体是否可观察到未孪晶并形成单例而不是针球状或扇形结构？关于衍射，如果可能的话，从晶体中收集衍射数据。如果这些晶体不衍射，则生长体积较大的晶体不太可能衍射。</li>
		<li>将形态图实验中的内硫肽晶体样品加载到支持物上，以便在100或293 K下收集数据并进行X射线衍射实验。如果在冷冻下工作，请使用 25% 乙二醇作为冷冻保护剂。</li>
		<li>通过合适的软件套件 处理 这些数据。内硫肽晶体的衍射应超过1.5 Å。在晶体样本中，观察细胞大小、观察总数和镶嵌度;这些措施将指示衍射晶体的均匀性。</li>
		<li>如果晶体形态和衍射质量足够，请继续执行步骤3。</li>
	</ol></li>
	<li>优化晶体生长时间。 注意：形态图分析（步骤2.2）将指示结晶起点（即 ，沉淀剂和蛋白质溶液混合时液滴所在的相图区域）。下降是在介稳区还是低于溶解线？批量结晶在成核区开始（图1C）。此步骤的目标是将该起点从溶解度线或介稳区域下方移动到成核区（图1D）。如果种子从步骤 2.2 中掉落。迅速产生晶体，这表明液滴混合物已经在介稳区，如果没有，那么液滴很可能没有过饱和。<ol><li>优化晶体生长时间。
		<ol><li>使用与步骤2.1.3相同的筛网，在3滴板中制备96孔气相扩散结晶实验。</li>
			<li>在 y 轴上增加内硫肽的起始蛋白浓度（即，进一步浓缩蛋白质，内噻吩肽可能为120mg / mL）。</li>
			<li>如步骤2.1.3.2所示，进行连续稀释，使得板的每一行含有顺序较低的蛋白质浓度。</li>
			<li>在平板上的三个液滴中的每一个都使用不同的滴率：1：1、1：2 和 2：1，蛋白质：沉淀剂。</li>
			<li>在第一天的0，3，6，12，18，24小时查看或成像板，然后在第一周每天查看或成像，在接下来的四周每周查看或成像。如果无法进行自动成像，则不必担心第 1 天的每小时成像。</li>
			<li>确定产生最快出现晶体的液滴，并将其作为重复优化的起点，直到在 24 小时内发生晶体生长。</li>
			<li>当确定快速出现的晶体状况后，返回步骤2.1以重新绘制形态图作为开始缩放的前奏。</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>3. 缩放
<ol><li>对扩展路由进行排名。在此阶段，没有必要决定单一的扩展路线，只需确定和排名选项，以便可以依次探索它们。随着批量混合物的体积在缩放过程中增加，成核速率和晶体尺寸范围将发生变化。然而，随着放大体积的增加，可以通过仔细调整组分浓度来克服这些问题。 注意：步骤3.1.1和3.1.2描述了如何从形态图中辨别批次或种子批次方案是否更合适。<ol><li>直接批处理方案
		<ol><li>成核区中的Xn是否与蛋白质和/或沉淀剂浓度成正比？即Xn是否随着沉淀剂和/或蛋白质浓度的增加而增加？-是的？转到步骤 3.1.1.2。不？转到步骤 3.1.2。 </li>
			<li>找到产生所需尺寸晶体的条件，然后转到步骤 3.2。</li>
		</ol></li>
		<li>种子批处理协议
		<ol><li>Xn 在成核区上是平坦的吗？ 即，Xn 不会随着沉淀物和/或蛋白质浓度的增加而增加。</li>
			<li>找到产生所需尺寸晶体的晶种条件，然后转到步骤 3.2。如果所有晶体都太大 - 请转到步骤 3.1.2.3。</li>
			<li>重复形态图实验（步骤2.1），但这次增加种子孔中使用的种子原液的浓度。种子储备可以通过在其创造中使用更多的晶体来增加。例如，使用 10 个孔，而不是步骤 2.1.1.5 中的 5 个孔。</li>
			<li>在前0，3，6，12，18，24小时内查看或成像板。</li>
			<li>种子液滴中的Xn 应该增加，Xs 减少。如果需要较小的晶体，请重复此循环，然后遵循种子批次方案。</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>逐步扩展
	<ol><li>在 96 孔板中缩放。从内硫肽素形态图中，最初选择使用结晶条件 0.1 M Tris-HCl pH 7.0、0.15 M MgCl2 和 30% （w/v） PEG 6，000 进行缩放的直接分批方法。100 mg/mL 内硫肽与结晶缓冲液以 1：1 的比例混合。<ol><li>在 2 孔 96 孔坐落板中制备 2-3 孔，其中 100 μL 0.1 M Tris-HCl pH 7.0、0.15 M MgCl2 和 30% （w/v） PEG 6，000。</li>
			<li>使用新鲜解冻的 100 mg/mL 内硫肽溶液，每孔分配 0.5 μL 蛋白质和 0.5 μL 沉淀剂，密封并储存在 20°C。</li>
			<li>在前0，3，6，12，18，24小时内查看或成像板。请注意 Xs 和 Xn 范围的任何变化。</li>
			<li>如果发生了变化，重复步骤3.2.1.1至3.2.1.2，但增加或减少蛋白质，沉淀物和/或种子浓度，以恢复对Xs 和Xn范围的任何变化。</li>
			<li>当 Xs 和 Xn 的范围可接受时，请继续执行步骤 3.2.2。</li>
		</ol></li>
		<li>在 24 孔悬挂式滴板中结垢
		<ol><li>通过用真空润滑脂润滑孔的边缘来准备 24 孔悬挂式滴板的单孔。</li>
			<li>准备 0.5 mL 的 0.1 M Tris-HCl pH 7.0、0.15 M MgCl2 和 30% （w/v） PEG 6，000，并填充润滑的良好状态。</li>
			<li>使用新鲜解冻的内硫肽溶液，将 1 μL 蛋白质移液到玻璃盖玻片表面。将 1 μL 结晶缓冲液移液到蛋白质液滴上，并使用移液器混合。</li>
			<li>在前0，3，6，12，24小时内查看或成像板。请注意 Xs 和 Xn 范围的任何变化。</li>
			<li>如果发生了变化，重复步骤3.2.2.1至3.2.2.4，但增加或减少蛋白质，沉淀物和/或种子浓度，以恢复对Xs 和Xn范围的任何变化。</li>
			<li>当/如果 Xs 和 Xn 的范围可接受时，请继续执行步骤 3.2.2.7。</li>
			<li>重复步骤3.2.2.1至3.2.2.5，逐渐增加实验的总体积至10μL。</li>
			<li>一旦体积达到 10 μL 或更大，继续在步骤 3.2.3 中离心管。</li>
		</ol></li>
		<li>离心管中的结垢 注意：内噻菌肽批次条件的改善主要发生在200μL体积点（参见结果，缩放）。该过程从0.1 M Tris-HCl pH 7.0，0.15 M MgCl2和30%（w / v）PEG 6，000的结晶条件开始。然而，PEG浓度最终变为40%（w / v）。还需要种子来控制Xn，并且为了防止晶体长得太大，必须淬灭晶体生长。步骤3.2.3.1至3.2.3.7详细说明了条件优化的过程。步骤 3.2.4.描述最终批处理协议。<ol><li>制备 1 mL 结晶缓冲液：0.1 M Tris-HCl pH 7.0、0.15 M MgCl2 和 30% （w/v） PEG 6，000。</li>
			<li>使用新鲜解冻的 100 mg/mL 内硫肽将 25 μL 蛋白质加入 1.5 mL 离心管中。</li>
			<li>用移液器吸头以1：1的比例将结晶缓冲液与蛋白质溶液彻底混合。将管子放入左轮手枪/旋转器中，在20°C下进行高搅拌。</li>
			<li>定期（5，10，30，60分钟，2，5，10，24小时）2.5μL等分试样，并在血细胞计数器中查看。记录 Xn 和 Xs 范围。</li>
			<li>如果发生了更改，请重复步骤 3.2.3.1。到 3.2.3.4.但增加或减少蛋白质、沉淀物和/或种子浓度，以恢复 Xs 和 Xn 范围的任何变化</li>
			<li>当 Xs 和 Xn 的范围可以接受时，请继续执行步骤 3.2.3.7。</li>
			<li>重复步骤3.2.2.1至3.2.2.5，根据需要逐渐增加实验的总体积至200μL或更大。</li>
		</ol></li>
		<li>最终种子批次实验方案
		<ol><li>准备种子。
			<ol><li>准备 2 mL 结晶缓冲液：0.1 M Tris-HCl pH 7.0、0.15 M MgCl2 和 40% （w/v） PEG 6，000。</li>
				<li>使用新鲜解冻的 100 mg/mL 内硫肽将 100 μL 蛋白质加入 1.5 mL 离心管中。</li>
				<li>用移液器吸头以1：1的比例将结晶缓冲液与蛋白质溶液彻底混合。将管子放在左轮手枪/旋转器中，在20°C下高搅拌24小时，以使50μm晶体生长。</li>
				<li>将10-15个1mm玻璃珠添加到50μm晶体浆料中。</li>
				<li>以1000rpm的速度涡旋含有浆液和珠子的离心管30秒。</li>
				<li>将离心管放回冰上30秒。</li>
				<li>再重复步骤3.2.4.1.5和3.2.4.1.610次。</li>
				<li>现在是 200 μL 的 1x 种子储备液。通过加入 1.8 mL 结晶缓冲液将种子储备液稀释 10 倍。将 10 x 种子原液分装在 50 μL 批次中，并储存在 -20 °C。</li>
			</ol></li>
			<li>种子批处理协议。
			<ol><li>制备结晶缓冲液：0.1 M Tris-HCl pH 7.0、0.15 M MgCl2 和 40% （w/v） PEG 6，000。</li>
				<li>在离心管中，将 100 μL 结晶缓冲液与 50 μL 新鲜解冻的 10x 种子原液混合。</li>
				<li>使用新鲜解冻的 100 mg/mL 内硫肽将 150 μL 蛋白质加入 1.5 mL 离心管中。</li>
				<li>用移液管尖端将结晶缓冲液/种子混合物与内噻菌肽溶液彻底混合，并将管置于左轮手枪/旋转器中，在20°C下进行高搅拌。</li>
				<li>通过定期取 2.5 μL 等分试样监测结晶，并在血细胞计数器中查看晶体。记录 Xn 和 Xs 范围。</li>
				<li>大约80分钟后，当晶体达到15μm的Xs 时，通过加入150μL0.05M Na乙酸钠pH 4.6，0.05M Tris-HCl pH 7.0，0.075M MgCl2和20%（w / v）PEG 6，000（由内噻菌肽缓冲液和结晶缓冲液组成的溶液，1：1混合）来淬灭反应。</li>
				<li>将晶体储存在20°C。</li>
			</ol></li>
			<li>该方案是否为预期的实验产生了可接受的晶体尺寸范围和数量？是 - 完成 - 否 - 返回步骤 3.1。并尝试其他缩放选项。例如，如果以前没有这样做，则可以使用不同的蛋白质：沉淀剂比例或添加种子。当这些都用尽时，可能需要在步骤 1 中找到新的条件。</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>

作者没有利益冲突需要披露。

所介绍的方法显示了如何优化内噻肽的结晶，从在稀疏基质96孔筛网中生长的大晶体（≥100μm最长尺寸）到在离心管（300μL 体积）中 通过批量生长的微晶体。该协议背后的想法是，优化内硫肽的步骤也可用于其他蛋白质。最终，回答了在XFEL和同步加速器上进行连续晶体学实验的产生大量（>100μL）微晶体（10-20μm）的问题。
该协议将大体积微结晶的任务分为三个步骤：（1）优化晶体形态，（2）过渡到批量，以及（3）缩放。在步骤1中，应在蒸汽扩散板中探索蛋白质可以产生的晶体形式范围。产生衍射到所需分辨率的单个盒状晶体的条件应该是目标。在步骤2中，可以将选定的条件从蒸汽扩散转换为批量。在这里，优化标准是晶体生长时间，并找到在24小时内产生蛋白质晶体的条件。还可以绘制形态图，使实验者了解溶解度线和成核区边界的位置。此形态图在步骤 3“缩放”中非常有用。形态图将指示单独成核是否可以增加Xn 并降低Xs。随着实验量的增加，Xn 和Xs 可以作为扩展成功的关键标准进行持续评估。
在Endothiapepsin的情况下，步骤1发现了内硫肽的潜在以前未知的晶体形态。这种形态具有与先前报道的相同的空间群，但对于连续晶体学来说，重要的是，它更像盒子的形状。单晶似乎也从单核点生长，不像其他条件产生的风扇（图4）。对于所选条件，步骤2已经部分满足，因为晶体生长发生在<24小时内。形态图表明，在步骤3中缩放时，直接或种子批处理方案都可能成功。初始按比例分批，产生了Xn 和Xs 范围分别为3.6±1.2 x 106 晶体·mL-1 和42 ± 4.1 μm的晶体的条件。这些晶体虽然对于一些系列晶体学实验来说是可以接受的，但被认为太大了。因此进行了额外的优化。最终方案制备的晶体浓度和尺寸范围分别为3.1 x 106 晶体·mL-1 和15 ± 3.9 μm。这对于计划的实验来说非常理想。
该方法侧重于将气相扩散板中生长的“可溶性”蛋白质晶体转化为批次。这种关注的原因是绝大多数可溶性蛋白质晶体是通过蒸汽扩散生长的26。然而，所提出的概念也可以应用于使用其他方法（例如微批次）生长的可溶性蛋白质晶体。这些概念也可能适用于在LCP中生长的膜蛋白晶体;因为这也是一个批量结晶过程。
该方案的一个关键方面是改变在蒸汽扩散板中生长的晶体条件的过程，以便它们可以批量生长。对于这种转换，该方法使用Beale等人（2019）提出的标准26。通过批量过程生长的晶体，即使在蒸汽扩散板中，也会迅速形成（<24小时）。该准则是基于蒸汽扩散液滴平衡速度的近似值，对于基于PEG的沉淀剂条件最为正确。然而，结晶条件将包含多种化合物，这些化合物会影响平衡时间。盐基结晶条件（例如高浓度氯化铵）的平衡可以在 1-2 天内完成。因此，24小时标准可能不适用于盐基条件。基于盐的条件也可以具有更复杂的相图26，30，这些相图可能不符合本协议中提出的原型。如果证明不可能扩展到更大的体积，则可能需要将盐基条件的时间标准减少到 12 或 6 小时。
这种方法的另一个限制是其明显的复杂性。优化内噻菌素微结晶的方案实际上从稀疏基质筛选中改变了原始条件。在PACT筛选中观察到的第一个命中是0.1 HEPES pH 7.0，0.2 M MgCl2和20%（w / v）PEG 6，000。最终的缩放结晶缓冲液为0.1 Tris-HCl pH 7.0，0.15 M MgCl2和40% （w / v）PEG 6，000。缓冲液从HEPES到Tris-HCl的变化以及MgCl 2 浓度也很有可能对该过程的成功贡献不大。将PEG 6，000浓度的增加作为唯一的优化，并且可以非常简单地实现。
然而，这种评估也过于简单化。它不仅忽略了结垢过程中遇到的问题（即 使用种子和淬灭），而且还忽略了这样一个事实，即仅仅因为这种蛋白质被证明是直截了当的，不能保证下一个也会被证明是。方案中建议的步骤之所以设计，是因为优化蛋白质结晶体积的缩放可能非常昂贵的蛋白质。在显示的七项内硫肽缩放试验中，消耗了100毫克蛋白质。诚然，其中一些步骤是为了根据该协议显示其后果而执行的。即便如此，100毫克的蛋白质，加上实验期间可能消耗的另外50毫克蛋白质（表1），可能是对时间或金钱的重大投资。
幸运的是，目前尚不清楚这种所需样品的质量是否在所有蛋白质中无处不在。内硫肽是高度可溶的，因此需要大浓度的蛋白质才能达到过饱和度。在其他情况下（目前正在优化中），过饱和度可以达到10甚至5 mg/mL。这些变量是蛋白质特异性的，当它们出现时需要接受。
该方法的其他局限性包括它依赖于复杂的设备，例如用于屏幕和孔板创建的液体处理机器人，以及在需要时自动对印版进行成像的成像仪。已经提供了替代例程来限制其中一些设备的需求，但是如果没有它们，协议将更加耗时。该协议还建议测试优化晶体的衍射。对于无法定期使用同步加速器的晶体学家来说，这些测试可能具有挑战性。可能不需要在每个步骤中进行控制，但强烈建议在确定匹配后进行这些测试，并在缩放前后进行。不幸的是，XFEL上的非衍射晶体并不少见。鉴于此，最好谨慎对待晶体衍射的假设。
最终，此处介绍的该协议和结果将为那些努力为连续晶体学实验生产样品的人提供指南，想法和示例。希望随着连续晶体学的进一步发展，该技术的样品需求将减少，从而减少对此类协议的需求。然而，即使在这种情况下，这里提出的策略对于那些希望探索其蛋白质结晶空间的人来说仍然有用。

室温（RT）大分子晶体学在结构生物学界再次流行。X射线自由电子激光（XFEL）光源的发展刺激了RT样品输送方法1，2，3，4的发展，这些方法现已应用于同步加速器5，6，7，8。RT方法不仅开辟了泵浦探针实验策略9，10，11，12的可能性，而且越来越多的证据表明它们促进了蛋白质13，14，15，16，17中的替代构象状态。
然而，低温方法在 1990 年代后期获得 RT 方法的牵引力的主要原因是零下晶体温度减缓了辐射损伤18。冷冻方法19开始允许从单个蛋白质晶体收集完整的数据集。XFEL和同步加速器的现代RT方法通过开发快速（> 100 Hz）晶体输送策略解决了单晶辐射损伤的问题1，2，3，4。这些方法允许从数千个单独暴露的晶体中收集完整的数据集。因此，这些RT给药方法需要生产大量含有均匀微晶体（>100 μL<50 μm晶体）的溶液。然而，由于冷冻方法往往只需要单晶，因此制造这种微晶浆料的方法目前在蛋白质晶体学实验室中并不普遍。
文献中有一些关于如何对连续晶体学样品进行部分微结晶优化程序的示例。在这里，应该区分膜蛋白和可溶性蛋白。优化在单油酸（或一些其他脂质）中生长的微膜蛋白晶体生长的用于脂质立方相（LCP）的方案已经很好地描述了20，21，22。然而，通常缺乏可溶性蛋白质（包括在非LCP条件下生长的膜蛋白）微结晶的方法。以前的研究集中在该过程的特定部分，例如微晶筛选23，24，增强成核24以及使用自由界面扩散25进行缩放，但不是完整的方法。
然而，最近描述了一种方法26 ，它试图提供完整的协议。像蛋白质晶体学的许多方面一样，它并不新鲜。Rayment （2002）27已经描述了提出的许多想法。该方法旨在向晶体学家展示如何从使用蒸汽扩散生长的单个晶体转换为生长数千个微晶体的批量方法。该方法侧重于蒸汽扩散作为共同起点，因为95%的蛋白质数据库（PDB）沉积来自在气相扩散板26中生长的晶体。然而，气相扩散不是微结晶的理想方法26，因此描述了一种将气相扩散转换为批量结晶的方法。一旦晶体可以批量生长，将途径扩展到更大的体积变得更加可行。鉴于蛋白质结晶的变幻莫测，作者会强调这种方法不是万无一失的。然而，该方案至少应该提供对蛋白质“结晶空间”的洞察。
该方法依赖于蛋白质结晶相图，以及对该图的理解如何在微结晶优化过程中起到指导作用。蛋白质相图通常描述为x/y图，沉淀剂和蛋白质浓度分别位于x轴和y轴上（图1A）。从纯水点（左下角 - 图1A），蛋白质和沉淀剂的浓度增加，直到达到溶解度线。溶解度线标记过饱和点（紫色线 - 图1A）。当蛋白质过饱和时，溶液在热力学上变得不稳定，并开始分离成两相：“富含蛋白质”和稳定的饱和溶液。这种分离可能发生在溶解度线以外的任何地方，其动力学取决于蛋白质的性质和溶液的成分。
当蛋白质和沉淀剂浓度太大时，蛋白质会不稳定地分解出溶液并导致无定形沉淀（粉红色区域 - 图1A）。然而，有序相分离可能发生在成核区域[详见Garcia-Ruiz（2003）28 ]，并且晶体核具有形成倾向（绿色区域 - 图1A）。成核和生长从溶液中去除蛋白质并将液滴移动到亚稳区域，在那里生长可以继续，直到达到溶解度线[参见McPherson和Kuznetsov （2014）29 的详细讨论]。对于绝大多数结晶条件，该图是严重过度简化30。然而，无论如何，该图对于微晶体学家来说仍然非常有用，因为该图的映射允许确定溶解度线和成核动力学。
在制造微晶方面，结晶过程中需要优化的两个因素是晶体数量（Xn）及其平均最长尺寸（Xs）。X n 将与成核事件的数量 （n ） 成正比（公式 1）。
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61896/61896fig01v2.jpg">     公式 1
X s 与溶解度线 （Ps） 上方的游离蛋白浓度除以 Xn（方程 2）成正比。
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61896/61896eq02.jpg">     等式 2
在理想情况下，每次成核事件都会产生一个可能的晶体，并且这些晶体中的每一个都可以平等地获得溶液中的可用蛋白质。 图 2 是 Xn 和 Xs 之间关系的理想场景的图形表示。实际上，晶体学家对Xn 和Xs 的主要控制是通过影响成核量或添加种子晶体。微晶体学家必须判断如何增加Xn ，以便可以产生合适的晶体浓度和晶体尺寸。
大多数结晶技术都需要一个“过渡期”（图1B）。例如，在蒸汽扩散实验中，在混合蛋白质和沉淀剂溶液时，每种溶液的浓度会随着液滴与孔溶液的平衡而变化。人们希望这些变化将逐渐将液滴过渡到结晶倾向增加的成核区。随着晶体开始成核和生长，溶液中的蛋白质量将开始下降，从而降低进一步成核的可能性。最终的成核量将取决于蛋白质和条件特异性，并且还取决于进入成核区的深度。鉴于需要过渡步骤的方法的成核区渗透有限，成核水平最终将限制在亚稳-成核区边界处的成核速率。
由于能够提高微晶体学家的成核水平非常重要，因此转向批量结晶方法非常重要。批量可以更好地利用整个成核区域（图1C）。在批量方法中，这个想法是将蛋白质和沉淀剂混合在一起，这样就可以产生过饱和溶液，而无需改变成分浓度。混合后应可立即成核。因此，批量方法允许理论上达到整个成核区。然后可以利用超过亚稳-成核边界的任何成核动力学增加。
如果晶体成核的基础水平不足以产生大的Xn，则可以使用微晶种方法。在微晶种中，预先生长的晶体被分解以产生结晶碎片浆液，该浆液可以作为新鲜晶体生长的支架31，32。微晶种已广泛用于连续晶体学样品制备，作为一种无需增加晶体成核即可增加 Xn 的方法（图 1C）。
从气相扩散到间歇的转变可以在相图上可视化为将实验起点从非过饱和或亚稳区域移动到成核区。这可以通过增加蛋白质和/或沉淀剂浓度和/或液滴内两者的比例来完成（图1D），并观察哪些条件产生快速出现的晶体（<24小时）26。完全的蒸气扩散滴平衡可能需要数天或数周33。因此，通过寻找显示快速出现的晶体的条件，可以找到批次条件，而不必转向替代结晶筛选形式，例如微批次34，35，36，37。
一旦找到成核区，就发现了批次条件，并且可以创建一个形态图 - 这里是一个粗略的相图 - 可以创建。在考虑是使用种子批次还是直接批次协议时，形态图非常有用。通过将Xn绘制为蛋白质和沉淀剂浓度的函数，可以对成核动力学进行评估26。如果 X n 在整个成核区域中保持较低水平，则可能需要晶种批次以使 Xn 足够大以限制晶体生长。该评估是扩展到更大体积（> 100 μL）过程的第一步。
该方法的设计使得它可以通过使用标准的气相扩散结晶设备在大多数结晶实验室中进行。还进行了许多研究，这些研究描述了在设备可用的情况下促进该过程许多部分的技术。这些包括但不限于动态光散射 （DLS）25，27、非线性成像 20、24、25、粉末衍射 20、24、27 和电子显微镜 26 [参见 Cheng 等人 （2020）40 以获得很好的评论]。
这项工作的目的是提供从小体积（< 500 nL）气相扩散结晶过渡到大体积（> 100 μL）批量结晶的方法的直观演示。来自 Cryphonectria parasitica 的Endothiapepsin已被用作证明这种翻译的示例系统。需要微晶体的实验类型和样品输送方法将影响理想的Xs 输出26。对于需要毫秒时间分辨率41 或气体动力虚拟喷嘴42的混合实验，最终Xs <5μm可能是可取的。在这种情况下，目标是产生衍射到约1.5 Å的蛋白质晶体，用于光子激活的泵浦探针实验，并使用固定目标传递方法。
为了说明使用内硫肽进行这种系列晶体学实验的样品要求， 表1 显示了假设实验的实验参数。示例信息基于下面描述的协议。鉴于对命中率和数据收集要求的一些保守估计，50毫克是整个实验的总样本消耗估计值。
图3显示了从最初的小体积蒸汽扩散结晶到大规模批次的完整优化过程的流程图。对于大多数系列晶体学项目，该协议将从步骤2开始：“过渡到批次”，因为目标蛋白质已经结晶。但是，为了完整起见，已包括步骤1，并提醒读者其重要性。找到产生衍射良好、单个大晶体的条件是微晶体优化的最佳起点。在步骤2中，可以将该条件从气相扩散优化为批量，并且可以绘制成核和亚稳区域的形态图。完成此操作后，可以在步骤 3 中将批处理条件缩放到更大的卷。在流程图结束时，晶体学家将创建一个可重复的大体积（> 100 μL）、微结晶、内硫肽的批量方案。然后可以将该方法应用于它们感兴趣的特定蛋白质。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Swissci 96-well 2-Drop plates</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD11-002</td>
			<td>96-well 2-drop crystallisation plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swissci 96-well 3-Drop plates</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD11-003</td>
			<td>96-well 3-drop crystallisation plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mosquito LCP liquid handling robot</td>
			<td>sptlabtech</td>
			<td>mosquito LCP</td>
			<td>Crystallisation robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClearVue Sheets</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD6-015</td>
			<td>96-well crystallization plate seals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Tube 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td>1.5 mL centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scaple</td>
			<td>Swan and Morton</td>
			<td>No. 3 scalple and No. 3 handle</td>
			<td>Scalple for cutting open plate seals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS 3 Vortex</td>
			<td>IKA</td>
			<td>3319000</td>
			<td>Vortex for mixing solution and making seed stocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well XRL Plate</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD3-11</td>
			<td>24-well hanging-drop plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube revolver/rotator</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>88881001</td>
			<td>Tube revolver for mixing solution during scaling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Research plus pipettes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>Range of manual pipettes, 0.5-10, 1-20, 10-100, 100-1000 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf pipette tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>Range of tip sizes for manual pipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suparen 600</td>
			<td>Prochem AG</td>
			<td>Suparen 600</td>
			<td>Endothiapepsin solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>241245-1KG</td>
			<td>Sodium Acetate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8382T014</td>
			<td>Tris</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670-1kg</td>
			<td>Magnesium Chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG 6,000</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>81255-1kg</td>
			<td>PEG 6,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethelyene glycol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>324558-1L</td>
			<td>Ethelyene glycol for cyro-protecting the crystals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PACT Premier HT screen</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD1-36</td>
			<td>PACT Premier 96-well crystal screen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOW CORNING high vacuum grease</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD6-02</td>
			<td>Grease for sealing 24-well plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hirschmann 22 x 22 mm glaser cover slides</td>
			<td>Hirschmann</td>
			<td>8000104</td>
			<td>Cover slides for sealing 24-well sitting drop plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal pins</td>
			<td>PSI</td>
			<td>Manufactured inhouse</td>
			<td>Thin-film supports for micro-crystals.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-1.3 mm SiLibeads Type S</td>
			<td>Faust</td>
			<td>6239547</td>
			<td>Glass beads for making mico-seed stocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macbook Pro</td>
			<td>Apple</td>
			<td>Macbook Pro</td>
			<td>Computer for performing data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCP4 software suite</td>
			<td>CCP4</td>
			<td></td>
			<td>Diffraction pattern data processing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>Microsoft Office</td>
			<td>Plotting tool for phase diagram</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hausser Scientific Bright-Line counting chamber</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>02-671-51B</td>
			<td>Tool to calculate crystal concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PACT Premier</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD1-29-ECO</td>
			<td>Sparse-matrix crystallization screen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rock Imager</td>
			<td>Formulatrix</td>
			<td>Rock Imager</td>
			<td>Temperature controlled crystal plate storage and imager</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rock MakerWeb</td>
			<td>Formulatrix</td>
			<td>Rock MakerWeb</td>
			<td>Crystal plate creation and image storage stoftware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formulator</td>
			<td>Formulatrix</td>
			<td>Formulator</td>
			<td>96-well crystal screen creation liquid handling robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica MZ16 Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica MZ16</td>
			<td>Light microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS V4.6</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LAS V4.6</td>
			<td>Software for Leica microscopes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectra/Por 3.5 kDa dialysis tubing</td>
			<td>Spectrumlabs</td>
			<td>Spectra/Por 3 Dialysis Membrane</td>
			<td>3.5 kDa dialysis membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing closures</td>
			<td>Spectrumlabs</td>
			<td>Spectra/Por 3 Duniversal Closures</td>
			<td>Clips to seal the dialysis tubing ends</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon 10 kDa centrifugal concentrator</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>Amicon Ultra-15 10 kDa centrifugal concentrator</td>
			<td>10 kDa centrifugal filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5810 R swing bucket centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810 R Centrifuge</td>
			<td>Swing bucket centrifuge</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimizing the growth of endothiapepsin crystals for serial crystallography experiments

本文提出了一种协议，以促进创建适用于同步加速器和XFEL连续晶体学实验的大体积（>100μL）微晶浆料。该方法基于对蛋白质晶体相图的理解，以及如何利用这些知识。该方法分为三个阶段：（1）优化晶体形态，（2）过渡到批次，（3）缩放。第 1 阶段涉及发现衍射良好的单晶，希望但不一定以立方体状形态呈现。在第 2 阶段，阶段 1 条件通过晶体生长时间进行优化。这种策略可以将通过气相扩散生长的晶体转化为批量。一旦晶体生长可以在大约24小时内发生，就可以绘制蛋白质和沉淀剂混合物的形态图并用作缩放策略的基础（阶段3）。当晶体可以批量生长时，可以尝试缩放，并且随着体积的增加而优化晶体尺寸和浓度。内硫肽已被用作该方案的示范蛋白。提出的一些决定是针对内硫肽的。但是，希望它们的应用方式将激发一种思考该程序的方式，其他人可以适应自己的项目。

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Optimizing the Growth of Endothiapepsin Crystals for Serial Crystallography Experiments

本文的目的是让观众深入了解如何将用于生长大单蛋白晶体的小体积气扩散方案转化为用于连续晶体学的大体积批量微结晶方法。

优化用于连续晶体学实验的内硫肽晶体的生长

Here, a protocol is presented to facilitate the creation of large volumes (&#62; 100 &#181;L) of micro-crystalline slurries suitable for serial ...

连续晶体学实验可能具有挑战性。他们实践中的一个关键障碍是微晶样品的创建。该协议显示了如何可靠地创建此类样本。该方法使用内硫肽来提供用于优化在小体积蒸汽扩散板中生长的大晶体到大体积微晶浆料的框架。我们不能声称这个协议会普遍成功。然而，我们希望这里提出的想法和方法能为其他人提供一个用于其他蛋白质的实验框架。首先，使用Formulatrix机器人准备带有结晶缓冲液的两滴96孔板。使用液体处理机器人混合物，在每个孔中将150纳升新鲜解冻的内硫肽与150纳升结晶缓冲液混合。密封板，让晶体在Formulatrix酒店内生长24小时。24小时后，从96孔结晶板的五个孔中分解并去除晶体。将它们放入250微升结晶缓冲液中，置于置于冰桶中的1.5毫升离心管中。将 10 至 15 个 1 毫米大小的玻璃珠加入离心管中。以 1000 RPM 的速度涡旋晶体和珠子 30 秒，然后在冰上更换它们 30 秒。然后种子可以立即使用或储存在零下20摄氏度。为了进行形态图实验，沿着两滴96孔网格筛选的板柱加入5%至40%浓度的PEG 6000，pH为7的1摩尔Tris-HCl和0.15摩尔氯化镁在8个步骤中从每毫升100至12.5毫克修复内硫肽的顺序稀释。然后移液将每次稀释液8微升，然后将2微升种子原液放入液体处理机器人平板中。使用液体处理机器人，将每次稀释的 150 纳脂肽分配到筛网的第一和二子孔中。从子孔二中多次吸出50纳升解冻的种子原液和100纳升的孔溶液，并将两者分配到蛋白质溶液中。加入结晶缓冲液或结晶缓冲液和种子混合物后混合溶液三次。现在将板和图像密封在第一天的零、三、六、12、18 和 24 小时，第一周每天，在接下来的四周每周在 20 摄氏度下。24小时后，在显微镜下观察板，估计每个孔内的晶体数量并测量晶体样品。将这些估计值记录在提供的形态图生成器工作表中。将内硫肽和PEG 6000的起始浓度输入到适当的框中。工作表将自动以传统的相图格式绘制结果，沉淀剂和蛋白质浓度分别位于X轴和Y轴上。仅在晶种液滴中产生晶体的井条件表示图的亚稳区域，而晶种和非晶种液滴中都有晶体的条件表示成核区。从形态图分析中，选择最有希望缩放到24孔板的条件。然后从每毫升100毫克的内噻菌肽和35%PEG 6000开始。用35%PEG 6000，pH 7的0.1摩尔Tris-HCl和0.15摩尔氯化镁制备5毫升结晶缓冲液。现在将0.5毫升结晶缓冲液放入涂有油脂的24孔悬挂式滴板的三个孔中。在玻璃盖玻片上将15微升内噻菌素与15微升结晶溶液混合。将溶液放在孔上，将板放置24小时。24小时后，在显微镜下观察板，估计液滴中的晶体数量，并测量它们的大小。如果晶体不正确，请重复此步骤，但如果晶体成核不够高，则更改蛋白质浓度或添加种子。通过添加较高浓度的PEG 6000的种子来重复24孔缩放实验。将0.5毫升新的结晶缓冲液放入涂有油脂的24孔悬挂板的三个孔中。将15微升内噻菌素放在玻璃盖玻片上，并将5微升种子原液和10微升结晶溶液与内噻菌肽溶液混合。倒置盖玻片，将它们放在孔上，放置 24 小时。重新检查液滴，看看晶体是否更小，浓度是否更高。估计液滴中的晶体数量并再次测量它们的大小，看看它们现在是否是正确的大小。为了执行晶种批次方案，制备40%PEG 6000，0.1摩尔Tris-HCl，pH为7和0.15摩尔氯化镁的结晶缓冲液。预混合50微升种子原液和100微升结晶液，并在1.5毫升离心管中与蛋白质溶液混合。涡旋管10秒钟，然后将其放在20摄氏度的摇臂或摇床上。每20分钟取2.5微升等分试样的批次溶液。使用血细胞计数器监测晶体的大小和数量。计算晶体的数量并在显微镜下测量它们的大小。当晶体达到约15微米尺寸时，用150微升0.5摩尔乙酸钠补充0.5摩尔Tris-HCl，0.075摩尔氯化镁和20%PEG 6000淬灭反应。使用血细胞计数器重新检查晶体尺寸和浓度。将晶体储存在 20 摄氏度。内硫肽素形态图分析表明，成核受蛋白质和沉淀物浓度的影响。图中的亚稳态、成核和沉淀区域可以很好地区分。与没有种子的液滴相比，添加种子显着增加了晶体数量。对200至300微升体积的内噻性肽微结晶的分析揭示了晶体成核的变化和最长尺寸随时间的变化。将PEG浓度提高到35%明显改善结晶，最终晶体浓度约为每毫升10至6的3.6倍，最长晶体尺寸为42微米。为了减小最终晶体的尺寸，应用了蛋白质浓度降低方法，不幸的是，该方法显着降低了晶体浓度，最终产生了更大的晶体。然而，将PEG浓度增加到40%的方法产生了大约3.1乘以10至每毫升6的晶体，尺寸约为39微米。此外，添加晶种导致晶体浓度的显着增加，约为每毫升8的1.1倍10和约4.2微米的较小尺寸。在结晶反应中尝试的淬灭效应使最终晶体浓度约为每毫升6的2.6乘以10，尺寸约为15微米。根据X射线数据的分辨率绘制的CC半值显示晶体分辨率从10微升略微下降到200至300微升体积。然而，晶体仍然衍射到1.5安格，这被认为是足够的。内噻菌素是一种宽容的蛋白质。我们希望尝试这种内噻菌肽方案将为其他蛋白质产生有用的想法和方法。特别是在晶体学方面，看到事物的外观和感觉是有益的，而不是试图只遵循书面协议。希望这个视频能给你一些这样的感觉。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography

制备及脂质立方相反应蛋白微晶交付串行飞秒晶体

Membrane proteins (MPs) are essential components of cellular membranes and primary drug targets. Rational drug design relies on precise structural ...

科研

生物化学

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

自动声胶肽受体激动剂的效价测定测定的连续稀释

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

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蛋白晶体的微结晶和<em&gt;在Cellulo</em&gt;衍射

The advent of high-quality microfocus beamlines at many synchrotron facilities has permitted the routine analysis of crystals smaller than 10 &#181;m in ...

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

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采用自动结晶耦合原位动态光散射的不同尺寸生长蛋白晶体

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

用 X 射线晶体学和生物物理技术表征免疫球蛋白折叠的糖蛋白

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An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

用于大分子 X 射线晶体学的一体式样品支架,具有最小的背景散射

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X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

X射线晶体学研究热木体马里蒂玛M42氨基肽TmPep1050的寡聚态过渡

The M42 aminopeptidases form functionally active complexes made of 12 subunits. Their assembly process appears to be regulated by their metal ion ...

Derivatization of Protein Crystals with I3C using Random Microseed Matrix Screening

使用随机微种子基质筛选与 I3C 的蛋白质晶体的衍生

Protein structure elucidation using X-ray crystallography requires both high quality diffracting crystals and computational solution of the diffraction ...

Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip

酶的结晶和结构确定：多功能微流体芯片中串行晶体学的基板复合物

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We ...

Workflow and Tools for Crystallographic Fragment Screening at the Helmholtz-Zentrum Berlin

赫尔姆霍尔茨-曾特鲁姆柏林水晶碎片筛选工作流程和工具

Fragment screening is a technique that helps to identify promising starting points for ligand design. Given that crystals of the target protein are ...