Name: optimizing the growth of endothiapepsin crystals for serial crystallography experiments
Uploaded: 2021-02-04T12:30:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimizing the Growth of Endothiapepsin Crystals for Serial Crystallography Experiments at JoVE.com

Dette projekt har modtaget støtte fra EU's Horizon 2020 forsknings- og innovationsprogram under Marie Skłodowska-Curie-tilskudsaftale nr. 701647. Mange tak for hjælp og støtte fra beamline-forskere ved Swiss Light Source beamline X10SA-PXII.

Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.

Den præsenterede metode viser, hvordan man optimerer krystalliseringen af endothiapepsin fra store krystaller (≥ 100 μm længste dimension), dyrket i sparsomme matrix 96-brøndskærme, til mikrokrystaller, dyrket i centrifugerør (300 μL volumen) via batch. Ideen bag protokollen er, at de skridt, der er taget for at optimere endothiapepsin, også kan bruges til andre proteiner. I sidste ende besvarer problemet med at skabe store mængder (>100 μL) mikrokrystaller (10-20 μm) til serielle krystallografieksperimenter ved XFEL'er og synkrotroner.
Protokollen opdeler opgaven med mikrokrystallisation i store mængder i tre trin: (1) Optimering af krystalmorfologi, (2) Overgang til batch og (3) Skalering. I trin 1 skal rækkevidden af krystalformer, som et protein kan skabe, undersøges i dampdiffusionsplader. Betingelser, der giver anledning til enkelte, kasselignende krystaller, der diffrakterer til den krævede opløsning, bør være målet. I trin 2 kan udvalgte betingelser derefter omdannes fra dampdiffusion til batch. Her er optimeringskriteriet krystalvæksttid og at finde forhold, der giver anledning til proteinkrystaller inden for 24 timer. Et morfogram kan også plottes, hvilket giver eksperimentatoren en ide om placeringen af opløselighedslinjen og nukleationszonegrænserne. Dette morfogram er af stor nytte i trin 3, skalering. Morfogrammet vil give en indikation af, om kimdannelse alene kan øge Xn og drive Xs ned. Efterhånden som eksperimentets volumen øges, kanXn og Xs løbende vurderes som nøglekriterierne for skaleringssucces.
I tilfælde af endothiapepsin opdagede trin 1, hvad der potentielt var en tidligere ukendt krystalmorfologi for endothiapepsin. Denne morfologi havde den samme rumgruppe som de tidligere rapporterede, men vigtigere for seriel krystallografi, en mere kasselignende form. Enkeltkrystaller syntes også at vokse fra enkeltnukleationspunkter, i modsætning til ventilatorerne skabt af andre forhold (figur 4). For den valgte tilstand var trin 2 allerede delvist tilfreds, da krystalvækst fandt sted i < 24 timer. Morfogrammet indikerede, at både en ren eller seed-batch-protokol kan være vellykket ved skalering i trin 3. Indledende skalering i lige batch skabte en tilstand, der producerede krystaller med et X,n og Xs område på henholdsvis 3,6 ± 1,2 x 106 krystaller · ml-1 og 42 ± 4,1 μm. Disse krystaller, selvom de var acceptable for nogle serielle krystallografieksperimenter, blev anset for at være for store. Så yderligere optimeringer blev udført. Den endelige protokol producerede krystaller med en koncentration og størrelsesområde på henholdsvis 3,1 x 106 krystaller · ml-1 og 15 ± 3,9 μm. Dette var mere end ideelt til de planlagte eksperimenter.
Metoden fokuserer på transformation af 'opløselige' proteinkrystaller dyrket i dampdiffusionsplader til batch. Årsagen til dette fokus er, at langt størstedelen af opløselige proteinkrystaller dyrkes via dampdiffusion26. Imidlertid kunne de præsenterede koncepter også anvendes på opløselige proteinkrystaller dyrket ved hjælp af andre metoder, såsom mikrobatch. Begreberne kan også anvendes på membranproteinkrystaller dyrket i LCP; da dette også er en batchkrystallisationsproces.
Et centralt aspekt af protokollen er processen med at transformere betingelserne for krystaller dyrket i dampdiffusionsplader, så de kan dyrkes i batch. Til denne transformation anvender metoden det kriterium, der er foreslået af Beale et al. (2019)26. Krystaller dyrket via en batchproces, selv i dampdiffusionsplader, dannes hurtigt (< 24 timer). Dette kriterium er en tilnærmelse baseret på hastigheden af dampdiffusionsfaldsligevægt og gælder mest for PEG-baserede bundfældningsbetingelser. Imidlertid vil krystallisationsbetingelser indeholde en lang række forbindelser, som vil påvirke ligevægtstiden. Ligevægten af saltbaserede krystallisationsbetingelser, f.eks. stærkt koncentreret ammoniumchlorid, kan ske på 1-2 dage. Derfor er 24 timer-kriteriet muligvis ikke sandt for saltbaserede forhold. Saltbaserede forhold kan også have mere komplekse fasediagrammer26,30, der muligvis ikke er i overensstemmelse med arketypen præsenteret i denne protokol. Det kan være nødvendigt at reducere tidskriteriet for saltbaserede forhold til 12 eller 6 timer, hvis det viser sig umuligt at skalere til større mængder.
En anden begrænsning af denne metode er dens tilsyneladende kompleksitet. Protokollen, der blev fulgt for at optimere mikrokrystallisationen af endothiapepsin, ændrede faktisk den oprindelige tilstand fra den sparsomme matrixskærm relativt lidt. Det første hit, der blev observeret på PACT-skærmen, var 0,1 HEPES pH 7,0, 0,2 MMgCl2 og 20% (w/v) PEG 6.000. Den endelige skalerede krystallisationsbuffer var 0,1 Tris-HCl pH 7,0, 0,15 MMgCl2 og 40% (w/v) PEG 6.000. Det er også meget muligt, at ændringen i buffer fra HEPES til Tris-HCI ogMgCl2-koncentration bidrog lidt til processens succes. At lade stigningen i PEG 6.000-koncentrationen være den eneste optimering, og en, der kunne have været opnået ganske enkelt.
Denne vurdering er imidlertid også for forenklet. Det diskonterer ikke kun de problemer, der opstår under skalering (dvs. brugen af frø og slukning), men også det faktum, at bare fordi dette protein viste sig ligetil, er der ingen garanti for, at det næste også vil vise sig at være. De trin, der anbefales i protokollen, blev udtænkt, fordi optimering af skalering af proteinkrystalliseringsvolumener kan være meget proteindyrt. I løbet af de syv endothiapepsinskaleringsforsøg, der vises, blev 100 mg protein forbrugt. Nogle af disse skridt blev ganske vist udført for at vise deres konsekvenser i lyset af denne protokol. Alligevel kan 100 mg af et protein plus potentielt yderligere 50 mg for protein, der indtages under et eksperiment (tabel 1), være en betydelig investering i enten tid eller penge.
Heldigvis er det ikke klart, at denne masse af krævet prøve er allestedsnærværende på tværs af alle proteiner. Endothiapepsin var meget opløseligt og krævede derfor en stor proteinkoncentration for at nå overmætning. I andre (i øjeblikket under optimering) kan overmætning nås ved 10 eller endda 5 mg / ml. Sådanne variabler er proteinspecifikke og skal omfavnes, når de vises.
Andre begrænsninger ved metoden inkluderer dens afhængighed af komplekst udstyr såsom væskehåndteringsrobotter til skærm- og pladeoprettelse og billeddannere til automatisk billedplader, når det er nødvendigt. Alternative rutiner er blevet tilbudt for at begrænse behovet for nogle af disse stykker udstyr, men protokollen vil være mere tidskrævende at følge uden dem. Protokollen foreslår også at teste diffraktionen af optimerede krystaller. For krystallografer uden regelmæssig adgang til en synkrotron kan disse tests vise sig udfordrende. Kontrol på hvert trin er muligvis ikke nødvendig, men disse tests anbefales kraftigt, når et hit er blevet identificeret, og før og efter skalering. Ikke-diffrakterende krystaller ved en XFEL er desværre ikke en ualmindelig forekomst. I betragtning af dette er det bedre at fejle på forsigtighedssiden med hensyn til antagelser om krystaldiffraktion.
I sidste ende vil denne protokol og resultater, der præsenteres her, tilbyde en guide, ideer og et eksempel til dem, der kæmper med at producere prøver til serielle krystallografieksperimenter. Forhåbentlig, efterhånden som seriel krystallografi videreudvikles, vil prøvekravene til teknikken blive reduceret, således at behovet for protokoller som dette vil blive reduceret. Men selv i dette tilfælde vil de strategier, der præsenteres her, stadig være nyttige for dem, der ønsker at udforske krystalliseringsrummet for deres protein.

Rumtemperatur (RT) makromolekylær krystallografi er populær igen inden for strukturbiologi samfund. Udviklingen af røntgenfri elektronlaser (XFEL) lyskilder har ansporet udviklingen af RT-prøveleveringsmetoder 1,2,3,4, og disse metoder er nu blevet anvendt på synkrotroner 5,6,7,8. RT-metoder åbner ikke kun muligheden for pumpesondeeksperimentelle strageties 9,10,11,12, men der er også stigende beviser for, at de fremmer alternative konformationstilstande inden for proteiner 13,14,15,16,17.
Hovedårsagen til, at kryo-metoder fik trækkraft over RT-tilgange i slutningen af 1990'erne, var imidlertid opbremsningen af strålingsskader ved krystaltemperaturerunder nul 18. Kryo-metoder19 begyndte at muliggøre indsamling af et komplet datasæt fra en enkelt proteinkrystal. Moderne RT-metoder ved XFELs og synkrotroner løste problemet med enkeltkrystalstrålingsskader ved udvikling af hurtige (> 100 Hz) krystalleveringsstrategier 1,2,3,4. Disse metoder giver mulighed for indsamling af et komplet datasæt fra tusindvis af individuelt eksponerede krystaller. Disse RT-leveringsmetoder kræver derfor produktion af store mængder opløsninger indeholdende homogene mikrokrystaller (> 100 μL < 50 μm krystaller). Men da kryometoder har tendens til kun at kræve enkeltkrystaller, er metoder til at skabe sådanne mikrokrystallinske opslæmninger i øjeblikket ikke allestedsnærværende på tværs af proteinkrystallografilaboratorier.
Der er eksempler i litteraturen på, hvordan man gør dele af mikrokrystallisationsoptimeringsproceduren for serielle krystallografiprøver. Her skal der skelnes mellem membran og opløselige proteiner. Protokoller til optimering af væksten af mikromembranproteinkrystaller dyrket i monoolein (eller et andet lipid) til lipidisk kubisk fase (LCP) er blevet godt beskrevet20,21,22. Imidlertid mangler der generelt metoder til mikrokrystallisation af opløselige proteiner, herunder membranproteiner dyrket under ikke-LCP-betingelser. Tidligere undersøgelser har fokuseret på specifikke dele af processen, såsom mikrokrystalscreening 23,24, forbedring af kimdannelse24 og skalering ved hjælp af fri grænsefladediffusion 25, men ikke en komplet metode.
Imidlertid blev der for nylig beskreveten metode 26 , der forsøger at tilbyde en komplet protokol. Ligesom mange aspekter af proteinkrystallografi er det ikke nyt. Mange af de foreslåede ideer blev allerede beskrevet af Rayment (2002)27. Metoden har til formål at vise krystallografer, hvordan man udfører konverteringen fra en enkelt krystal dyrket ved hjælp af dampdiffusion til en batchmetode til dyrkning af tusindvis af mikrokrystaller. Metoden fokuserer på dampdiffusion som et fælles udgangspunkt, da 95% af alle Protein Data Bank (PDB) aflejringer kommer fra krystaller dyrket i dampdiffusionsplader26. Dampdiffusion er imidlertid ikke den ideelle metode til mikrokrystallisation26, så der beskrives en metode til at konvertere dampdiffusion til batchkrystallisation. Når krystaller kan dyrkes i batch, bliver skaleringsruter til større mængder mere praktiske. I betragtning af proteinkrystalliseringens luner vil forfatterne understrege, at denne metode ikke er fejlsikker. Protokollen skal dog i det mindste give et indblik i et proteins 'krystalliseringsrum'.
Denne metode er afhængig af proteinkrystalliseringsfasediagrammet, og hvordan en forståelse af dette diagram kan fungere som vejledning under mikrokrystallisationsoptimering. Et proteinfasediagram er almindeligvis afbildet som et x/y-plot med udfældnings- og proteinkoncentrationer på henholdsvis x- og y-akserne (figur 1A). Fra punktet rent vand (nederste venstre hjørne - figur 1A) øges koncentrationen af både protein og bundfald, indtil opløselighedslinjen er nået. Opløselighedslinjen markerer overmætningspunktet (lilla linje - figur 1A). Når et protein er overmættet, bliver opløsningen termodynamisk ustabil og begynder at adskille sig i to faser: 'proteinrig' og en stabil mættet opløsning. Denne adskillelse kan forekomme hvor som helst uden for opløselighedslinjen, og dens kinetik afhænger af proteinets egenskaber og opløsningens komponenter.
Når protein- og bundfaldkoncentrationerne er for store, nedbrydes proteinet ustabilt ud af opløsningen og resulterer i amorft bundfald (lyserødt område - figur 1A). Imidlertid kan ordnet faseadskillelse forekomme i kimdannelsesområdet [se Garcia-Ruiz (2003) 28 for detaljeret beskrivelse], og krystalnukleanter har tilbøjelighed til at danne (grøn region - figur 1A). Nukleation og vækst fjerner protein fra opløsningen og flytter dråben ind i det metastabile område, hvor væksten kan fortsætte, indtil opløselighedslinjen er nået [se McPherson og Kuznetsov (2014) 29 for detaljeret diskussion]. Diagrammet er for langt de fleste krystalliseringsbetingelser en grov oversimplificering30. Uanset dette er diagrammet dog stadig af stor nytte for mikrokrystallografer, da kortlægningen af diagrammet gør det muligt at bestemme opløselighedslinjen og kinetikken for kimdannelse.
Med hensyn til at skabe mikrokrystaller er de to faktorer under krystallisering, der skal optimeres, antallet af krystaller (Xn) og deres gennemsnitlige, længste dimension (Xs). X n vil være proportional med antallet af kimdannelseshændelser (n ) (Eq. 1).
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61896/61896fig01v2.jpg">     Eq. 1
X s er proportional med koncentrationen af frit protein over opløselighedslinjen (Ps) divideret med Xn (Eq. 2).
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61896/61896eq02.jpg">     Eq. 2
I en perfekt situation ville enhver kimdannelsesbegivenhed give en mulig krystal, og hver eneste af disse krystaller ville have lige adgang til det tilgængelige protein i opløsning. Figur 2 er en grafisk repræsentation fra et ideelt scenario af forholdet mellem Xn og Xs. I praksis er den vigtigste kontrol, en krystallograf har over Xn og Xs , ved at påvirke mængden af kimdannelse eller ved tilsætning af frøkrystaller. Mikrokrystallografen skal bedømme, hvordan man øger Xn , således at der både kan skabes en passende krystalkoncentration og krystalstørrelse.
De fleste krystalliseringsteknikker kræver en "overgangsperiode" (figur 1B). For eksempel i et dampdiffusionseksperiment, ved blanding af protein- og bundfældningsopløsningerne, vil koncentrationerne af hver ændre sig, når dråben udligner sig med brøndopløsningen. Man håber, at disse ændringer gradvist vil overføre faldet til kimdannelseszonen, hvor tilbøjeligheden til krystallisation vil stige. Når krystaller begynder at nukleere og vokse, vil mængden af protein i opløsning begynde at falde, hvilket reducerer sandsynligheden for yderligere kimdannelse. Den ultimative mængde kimdannelse vil være protein- og tilstandsspecifik og også afhængig af dybden af penetration af i nukleationszonen. I betragtning af den begrænsede kimdannelseszonepenetration af metoder, der kræver et overgangstrin, vil kimdannelsesniveauet i sidste ende være begrænset til kimdannelseshastigheden ved metastabil-nukleationsregionsgrænsen.
På grund af vigtigheden af at kunne forbedre kimdannelsesniveauet for en mikrokrystallograf er det vigtigt at flytte til en batchkrystallisationsmetode. Batch kan drage større fordel af hele nukleationsområdet (figur 1C). I batchmetoder er ideen at blande proteinet og bundfaldet sammen, således at der skabes en overmættet opløsning uden behov for ændringer i komponentkoncentrationer. Nukleation bør være mulig umiddelbart efter blanding. Batchmetoder tillader derfor, at hele kimdannelseszonen teoretisk nås. Enhver stigning i kimdannelseskinetik ud over metastabil-nukleationsgrænsen kan derefter udnyttes.
Hvis det basale niveau af krystalkimdannelse ikke er nok til at generere et stort Xn, kan mikrosåningsmetoder anvendes. Ved mikrosåning brydes forvoksede krystaller op for at skabe en opslæmning af krystallinske fragmenter, der kan fungere som et stillads for frisk krystalvækst31,32. Mikrosåning har været meget udbredt i seriel krystallografisk prøveforberedelse som en måde at øge Xn uden behov for at øge krystalkimdannelsen (figur 1C).
Overgangen fra dampdiffusion til batch kan visualiseres på et fasediagram som at flytte det eksperimentelle udgangspunkt fra enten de ikke-overmættede eller metastabile regioner til kimdannelseszonen. Dette kan gøres ved at øge protein- og/eller udfældningskoncentrationerne og/eller forholdet mellem de to inden for faldet (figur 1D) og observere, hvilke betingelser der giver krystaller, der viser sig hurtigt (< 24 timer)26. Fuldstændig dampdiffusionsdråbeligevægt kan tage dage eller uger33. Derfor, ved at lede efter betingelser, der viser hurtigt fremkomne krystaller, kan batchbetingelser findes uden at skulle flytte til alternative krystalliseringsscreeningsformater såsom mikrobatch34,35,36,37.
Når kimdannelseszonen er fundet, er der fundet en batchtilstand, og der kan oprettes et morfogram - her et groft fasediagram. Morfogrammet er af stor nytte, når man overvejer, om man skal bruge en podet batch eller lige batchprotokol. Ved at plotte Xn som funktion af protein- og bundfældningskoncentrationen kan der foretages en vurdering af kimdannelseskinetikken26. Hvis X n forbliver lav over hele kimdannelsesområdet, kan det være nødvendigt med frøbatch for at gøre Xn stor nok til at begrænse krystalvækst. Denne vurdering er det første skridt i processen med at skalere til større mængder (> 100 μL).
Denne metode blev designet således, at den kunne udføres i de fleste krystallisationslaboratorier ved hjælp af standard dampdiffusionskrystallisationsudstyr. Der er også udført mange undersøgelser, som beskriver teknikker til at lette mange dele af denne proces, hvis udstyret er tilgængeligt. Disse omfatter, men er ikke begrænset til, dynamisk lysspredning (DLS) 25,27, ikke-lineær billeddannelse 20,24,25, pulverdiffraktion 20,24,27 og elektronmikroskopi 26 [se Cheng et al. (2020) 40 for en god gennemgang].
Formålet med dette arbejde er at give en visuel demonstration af metoden til overgang fra lille volumen (< 500 nL) dampdiffusionskrystallisation til stor volumen (> 100 μL) batchkrystallisering. Endothiapepsin fra Cryphonectria parasitica er blevet brugt som et eksempelsystem til demonstration af denne oversættelse. Den type eksperiment og prøveleveringsmetode, som mikrokrystallerne er nødvendige for, vil påvirke det ideelleX-s output26. For blandingsforsøg, der kræver en millisekundtidsopløsning41 eller gasdynamiske virtuelle dyser42, kan en endelig Xs på < 5 μm være ønskelig. I dette tilfælde var målet at producere proteinkrystaller, der diffrakterer til ca. 1,5 Å, til et fotonaktiveret pumpesondeeksperiment og ved hjælp af en leveringsmetode med fast mål.
For at give en illustration af prøvekravene til et sådant serielt krystallografieksperiment ved anvendelse af endothiapepsin viser tabel 1 de eksperimentelle parametre for et hypotetisk eksperiment. Eksempeloplysningerne var baseret på den protokol, der er beskrevet nedenfor. I betragtning af nogle konservative skøn over hitrater og dataindsamlingskrav er 50 mg det samlede prøveforbrugsestimat for hele eksperimentet.
Figur 3 viser et rutediagram over den komplette optimeringsproces fra indledende dampdiffusionskrystallisation i lille volumen til storskalabatch. For de fleste serielle krystallografiprojekter begynder denne protokol på trin 2: 'overgang til batch', da målproteinet allerede vil være krystalliseret. Trin 1 er dog medtaget for fuldstændighed og for at minde læserne om dens betydning. At finde en tilstand, der giver anledning til en godt diffrakterende, enkelt, stor krystal, er det bedste udgangspunkt for mikrokrystaloptimering. I trin 2 kan denne tilstand derefter optimeres fra dampdiffusion til batch, og et morfogram af nukleations- og metastabile regioner kan plottes. Når dette er gjort, kan batchbetingelsen skaleres til større mængder i trin 3. Ved afslutningen af rutediagrammet vil en krystallograf have skabt en gentagelig, stor volumen (> 100 μL), mikrokrystallisation, batchprotokol for endothiapepsin. Denne metode kan derefter anvendes på deres særlige protein af interesse.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Swissci 96-well 2-Drop plates</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD11-002</td>
			<td>96-well 2-drop crystallisation plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swissci 96-well 3-Drop plates</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD11-003</td>
			<td>96-well 3-drop crystallisation plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mosquito LCP liquid handling robot</td>
			<td>sptlabtech</td>
			<td>mosquito LCP</td>
			<td>Crystallisation robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClearVue Sheets</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD6-015</td>
			<td>96-well crystallization plate seals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Tube 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td>1.5 mL centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scaple</td>
			<td>Swan and Morton</td>
			<td>No. 3 scalple and No. 3 handle</td>
			<td>Scalple for cutting open plate seals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS 3 Vortex</td>
			<td>IKA</td>
			<td>3319000</td>
			<td>Vortex for mixing solution and making seed stocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well XRL Plate</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD3-11</td>
			<td>24-well hanging-drop plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube revolver/rotator</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>88881001</td>
			<td>Tube revolver for mixing solution during scaling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Research plus pipettes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>Range of manual pipettes, 0.5-10, 1-20, 10-100, 100-1000 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf pipette tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>Range of tip sizes for manual pipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suparen 600</td>
			<td>Prochem AG</td>
			<td>Suparen 600</td>
			<td>Endothiapepsin solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>241245-1KG</td>
			<td>Sodium Acetate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8382T014</td>
			<td>Tris</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670-1kg</td>
			<td>Magnesium Chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG 6,000</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>81255-1kg</td>
			<td>PEG 6,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethelyene glycol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>324558-1L</td>
			<td>Ethelyene glycol for cyro-protecting the crystals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PACT Premier HT screen</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD1-36</td>
			<td>PACT Premier 96-well crystal screen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOW CORNING high vacuum grease</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD6-02</td>
			<td>Grease for sealing 24-well plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hirschmann 22 x 22 mm glaser cover slides</td>
			<td>Hirschmann</td>
			<td>8000104</td>
			<td>Cover slides for sealing 24-well sitting drop plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal pins</td>
			<td>PSI</td>
			<td>Manufactured inhouse</td>
			<td>Thin-film supports for micro-crystals.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-1.3 mm SiLibeads Type S</td>
			<td>Faust</td>
			<td>6239547</td>
			<td>Glass beads for making mico-seed stocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macbook Pro</td>
			<td>Apple</td>
			<td>Macbook Pro</td>
			<td>Computer for performing data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCP4 software suite</td>
			<td>CCP4</td>
			<td></td>
			<td>Diffraction pattern data processing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>Microsoft Office</td>
			<td>Plotting tool for phase diagram</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hausser Scientific Bright-Line counting chamber</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>02-671-51B</td>
			<td>Tool to calculate crystal concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PACT Premier</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD1-29-ECO</td>
			<td>Sparse-matrix crystallization screen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rock Imager</td>
			<td>Formulatrix</td>
			<td>Rock Imager</td>
			<td>Temperature controlled crystal plate storage and imager</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rock MakerWeb</td>
			<td>Formulatrix</td>
			<td>Rock MakerWeb</td>
			<td>Crystal plate creation and image storage stoftware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formulator</td>
			<td>Formulatrix</td>
			<td>Formulator</td>
			<td>96-well crystal screen creation liquid handling robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica MZ16 Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica MZ16</td>
			<td>Light microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS V4.6</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LAS V4.6</td>
			<td>Software for Leica microscopes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectra/Por 3.5 kDa dialysis tubing</td>
			<td>Spectrumlabs</td>
			<td>Spectra/Por 3 Dialysis Membrane</td>
			<td>3.5 kDa dialysis membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing closures</td>
			<td>Spectrumlabs</td>
			<td>Spectra/Por 3 Duniversal Closures</td>
			<td>Clips to seal the dialysis tubing ends</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon 10 kDa centrifugal concentrator</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>Amicon Ultra-15 10 kDa centrifugal concentrator</td>
			<td>10 kDa centrifugal filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5810 R swing bucket centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810 R Centrifuge</td>
			<td>Swing bucket centrifuge</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimizing the growth of endothiapepsin crystals for serial crystallography experiments

Her præsenteres en protokol for at lette dannelsen af store mængder (> 100 μL) mikrokrystallinske opslæmninger, der er egnede til serielle krystallografieksperimenter ved både synkrotroner og XFEL'er. Metoden er baseret på en forståelse af proteinkrystalfasediagrammet, og hvordan denne viden kan udnyttes. Metoden er opdelt i tre faser: (1) optimering af krystalmorfologi, (2) overgang til batch og (3) skalering. Trin 1 indebærer at finde godt diffrakterende, enkelte krystaller, forhåbentlig men ikke nødvendigvis, der præsenterer i en terninglignende morfologi. I trin 2 optimeres trin 1-tilstanden efter krystalvæksttid. Denne strategi kan omdanne krystaller dyrket ved dampdiffusion til batch. Når krystalvækst kan forekomme inden for ca. 24 timer, kan et morfogram af protein- og bundfældningsblandingen plottes og anvendes som grundlag for en skaleringsstrategi (trin 3). Når krystaller kan dyrkes i batch, kan skalering forsøges, og krystalstørrelsen og koncentrationen optimeres, når volumenet øges. Endothiapepsin er blevet anvendt som demonstrationsprotein til denne protokol. Nogle af de præsenterede beslutninger er specifikke for endothiapepsin. Det er dog håbet, at den måde, de er blevet anvendt på, vil inspirere til en måde at tænke på denne procedure, som andre kan tilpasse til deres egne projekter.

Watch this Scientific Journal Video about Optimizing the Growth of Endothiapepsin Crystals for Serial Crystallography Experiments at JoVE.com

Optimizing the Growth of Endothiapepsin Crystals for Serial Crystallography Experiments

Formålet med denne artikel er at give seeren en solid forståelse af, hvordan man omdanner deres lille volumen, dampdiffusionsprotokol til dyrkning af store, enkeltproteinkrystaller til en storvolumenbatchmikrokrystallisationsmetode til seriel krystallografi.

Optimering af væksten af endothiapepsinkrystaller til serielle krystallografieksperimenter

Here, a protocol is presented to facilitate the creation of large volumes (&#62; 100 &#181;L) of micro-crystalline slurries suitable for serial ...

Serielle krystallografieksperimenter kan være udfordrende. En vigtig hindring i deres praksis er oprettelsen af mikrokrystallinske prøver. Denne protokol viser, hvordan sådanne prøver kan oprettes pålideligt.Denne metode bruger endothiapepsin til at give en ramme for optimering af store krystaller dyrket i dampdiffusionsplader med lille volumen til mikrokrystallinske opslæmninger med stort volumen. Vi kan ikke påstå, at denne protokol vil blive en universel succes. Vi håber dog, at de ideer og metoder, der foreslås her, giver andre en eksperimentel ramme at anvende på andre proteiner.Til at begynde med skal du forberede en to-dråbe 96 brøndplade med krystallisationsbufferen ved hjælp af Formulatrix-robotten. Ved hjælp af en væskehåndteringsrobotblanding blandes 150 nanoliter frisk optøet endothiapepsin med 150 nanoliter krystallisationsbuffer i hver brønd. Forsegl pladen og lad krystallerne vokse i 24 timer inde i Formulatrix Hotel.Efter 24 timer brydes op og fjernes krystallerne fra fem brønde i krystallisationspladen med 96 brønde. Anbring dem i 250 mikroliter krystallisationsbuffer i et 1,5 ml centrifugerør anbragt i en isspand. Tilsæt 10 til 15 glasperler på en millimeter i centrifugerøret.Vortex krystallerne og perlerne ved 1000 RPM i 30 sekunder, og udskift dem på is i 30 sekunder. Frøene kan derefter bruges med det samme eller opbevares ved minus 20 grader Celsius. For at udføre et morfogrameksperiment tilsættes fem til 40% koncentrationer af PEG 6000 med en molær Tris-HCI ved pH syv og 0,15 molær magnesiumchlorid langs pladekolonnerne på en to-dråbe 96-brønds gitterskærm Reparer en sekventiel fortynding af endothiapepsin i 0,1 molær natriumacetat fra 100 til 12,5 milligram pr. milliliter over otte trin.Derefter pipetteres otte mikroliter af hver fortynding efterfulgt af to mikroliter frøbestand i væskehåndteringsrobotpladen. Brug en væskehåndteringsrobot til at dispensere 150 nanoliter af hver fortynding af endothiapepsin i underbrønd en og to af skærmen. Multi-aspirere 50 nanoliter optøet frøbestand og 100 nanoliter af brøndopløsningen fra underbrønd to og dispensere begge i proteinopløsningen.Opløsningerne blandes tre gange efter tilsætning af krystallisationsbufferen eller krystallisationsbufferen og frøblandingen. Luk nu pladen og billedet ved nul, tre, seks, 12, 18 og 24 timer den første dag hver dag i den første uge og hver uge i de næste fire uger ved 20 grader Celsius. Efter 24 timer skal du se på pladen under et mikroskop, estimere antallet af krystaller i hver brønd og måle en prøve af krystallerne.Optag disse estimater i det medfølgende regneark til morfogramgenerator. Startkoncentrationerne af endothiapepsin og PEG 6000 indtastes i de relevante kasser. Arbejdsarket plotter automatisk resultaterne i det traditionelle fasediagramformat med bundfalds- og proteinkoncentrationerne på henholdsvis X- og Y-aksen.Brøndforhold, der kun giver anledning til krystaller i deres frøede dråber, angiver diagrammets metastabile region, mens forhold med krystaller i både de frøede og ikke-frøede dråber indikerer kimdannelseszonen. Fra morfogramanalysen skal du vælge den mest lovende betingelse for skalering i 24 brøndplader. Begynd derefter med 100 milligram pr. milliliter endothiapepsin og 35% PEG 6000.Forbered fem ml krystallisationsbuffer med 35% PEG 6000, 0,1 molær Tris-HCI med pH syv og 0,15 molært magnesiumchlorid. Anbring nu 0,5 ml af krystallisationsbufferen i tre brønde i en smurt 24-brøndhængende dråbeplade. Bland 15 mikroliter endothiapepsin med 15 mikroliter krystallisationsopløsning på en glasdæksel.Anbring opløsningen over brøndene og lad pladen stå i 24 timer. Efter 24 timer skal du se på pladen under et mikroskop, estimere antallet af krystaller i dråben og måle deres størrelse. Hvis krystallerne er forkerte, gentag dette trin, men skift proteinkoncentrationen eller tilsæt frø, hvis krystalkimdannelsen ikke er høj nok.Gentag skaleringseksperimentet med 24 brønde ved at tilføje frø i en højere koncentration af PEG 6000. Anbring 0,5 ml af den nye krystallisationsbuffer i tre brønde i en smurt 24-brønds hængende dråbeplade. Anbring 15 mikroliter endothiapepsin på en glasdæksel, slip og bland fem mikroliter frøbestand og 10 mikroliter krystallisationsopløsning med endothiapepsinopløsningen.Vend dækslet glider, læg dem over brøndene og lad dem stå i 24 timer. Kontroller dråberne igen for at se, om krystallerne er mindre og har en højere koncentration. Anslå antallet af krystaller i dråben og mål deres størrelse igen for at se, om de nu har den rigtige størrelse.For at udføre en podet batchprotokol fremstilles krystallisationsbufferen på 40% PEG 6000, 0,1 molær Tris-HCI med en pH på syv og 0,15 molært magnesiumchlorid. Bland 50 mikroliter frøbestand og 100 mikroliter krystallisationsopløsning, og bland med proteinopløsning i 1,5 ml centrifugerøret. Vortex røret i 10 sekunder og læg det på en vipper eller ryster ved 20 grader Celsius.Tag en 2,5 mikroliter alikvote af batchopløsningen hvert 20. minut. Overvåg størrelsen og antallet af krystallerne ved hjælp af et hæmocytometer. Tæl antallet af krystaller og mål deres størrelse under mikroskopet.Når krystallerne har nået ca. 15 mikron dimension, slukkes reaktionen med 150 mikroliter 0,5 molært natriumacetat suppleret med 0,5 molært Tris-HCI, 0,075 molært magnesiumchlorid og 20% PEG 6000. Kontroller krystalstørrelsen og koncentrationen igen ved hjælp af hæmocytometeret. Opbevar krystallerne ved 20 grader Celsius.Endothiapepsinmorfogramanalysen antydede, at kimdannelse blev påvirket af både protein- og bundfældningskoncentrationer. MetaStable-, kimdannelses- og nedbørsområderne i diagrammet kan pænt skelnes. Tilsætningen af frø øgede krystaltallet signifikant sammenlignet med dråber uden frø.Analyse af endothiapepsinmikrokrystallisationen i 200 til 300 mikroliter volumener afslørede ændringerne i krystalkimdannelse og den længste dimension over tid. Forøgelse af PEG-koncentrationen til 35% markant forbedret krystallisering med en endelig krystalkoncentration på omkring 3,6 gange 10 til seks pr. milliliter og den længste krystaldimension på 42 mikrometer. For at reducere størrelsen af de endelige krystaller blev der anvendt en proteinkoncentrationsreduktionsmetode, som desværre reducerede krystalkoncentrationen betydeligt og i sidste ende producerede endnu større krystaller.Imidlertid gav tilgangen med at øge PEG-koncentrationen til 40% krystaller omkring 3,1 gange 10 til seks pr. milliliter og en størrelse på ca. 39 mikrometer. Endvidere førte tilsætning af frø til en signifikant stigning i krystalkoncentrationen, omkring 1,1 gange 10 til de otte pr. milliliter og mindre dimensioner på ca. 4,2 mikrometer. Den slukningseffekt, der blev forsøgt i krystallisationsreaktionen, gav en endelig krystalkoncentration på ca. 2,6 gange 10 til de seks pr. milliliter og en størrelse på ca. 15 mikrometer.CC-halvdelen, der blev plottet mod opløsningen fra røntgendataene, viste et lille fald i krystalopløsningen fra 10 mikroliter til 200 til 300 mikroliter volumener. Imidlertid diffrakterer krystallen stadig til 1,5 angstrum, hvilket blev anset for tilstrækkeligt. Endothiapepsin er et tilgivende protein at arbejde med.Vi håber, at forsøg med denne protokol af endothiapepsin vil generere nyttige ideer og metoder til andre proteiner. Især med krystallografi er det gavnligt at se, hvordan tingene ser ud og føles i stedet for kun at forsøge at følge en skriftlig protokol. Denne video vil forhåbentlig give dig som noget af den følelse.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography

Udarbejdelse og levering af Protein Mikrokrystaller i lipide Cubic fase for Serial Femtosekund Krystallografi

Membrane proteins (MPs) are essential components of cellular membranes and primary drug targets. Rational drug design relies on precise structural ...

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

Automatiseret Akustisk Udlevering til seriel fortynding af peptid agonister i Potens Bestemmelse assays

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

Mikrokrystallografi af proteinkrystaller og<em&gt; I Cellulo</em&gt; Diffraktion

The advent of high-quality microfocus beamlines at many synchrotron facilities has permitted the routine analysis of crystals smaller than 10 &#181;m in ...

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Voksende Protein krystaller med forskellige dimensioner ved hjælp af automatiseret krystallisering kombineret med In Situ dynamisk lysspredning

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

Karakterisering af glykoproteiner med immunglobulin Fold af røntgenkrystallografi og biofysiske metoder

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

En all-in-One-prøve holder til makromolekylær røntgenkrystallografi med minimal baggrunds spredning

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

X-Ray krystallografi at studere oligomeric stat Overgang af Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

The M42 aminopeptidases form functionally active complexes made of 12 subunits. Their assembly process appears to be regulated by their metal ion ...

Derivatization of Protein Crystals with I3C using Random Microseed Matrix Screening

Derivatization af Protein Krystaller med I3C ved hjælp af Random Microseed Matrix Screening

Protein structure elucidation using X-ray crystallography requires both high quality diffracting crystals and computational solution of the diffraction ...

Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip

Krystallisering og strukturel bestemmelse af et enzym:Substratkompleks ved seriel krystallografi i en alsidig mikrofluidisk chip

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We ...

Workflow and Tools for Crystallographic Fragment Screening at the Helmholtz-Zentrum Berlin

Workflow and Tools for Crystallographic Fragment Screening på Helmholtz-Zentrum Berlin

Fragment screening is a technique that helps to identify promising starting points for ligand design. Given that crystals of the target protein are ...