Name: optimizing the growth of endothiapepsin crystals for serial crystallography experiments
Uploaded: 2021-02-04T12:30:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimizing the Growth of Endothiapepsin Crystals for Serial Crystallography Experiments at JoVE.com

Dit project heeft financiering ontvangen van het Horizon 2020-onderzoeks- en innovatieprogramma van de Europese Unie in het kader van de Marie Skłodowska-Curie-subsidieovereenkomst nr. 701647. Hartelijk dank voor de hulp en steun van beamline wetenschappers bij de Swiss Light Source beamline X10SA-PXII.

De auteurs hebben geen belangenconflicten bekend te maken.

De gepresenteerde methode laat zien hoe de kristallisatie van endothiapepsine kan worden geoptimaliseerd van grote kristallen (≥ langste afmeting van 100 μm), gekweekt in schermen met een dunne matrix 96 put, tot microkristallen, gekweekt in centrifugebuizen (300 μL volume) via batch. Het idee achter het protocol is dat de stappen die worden genomen om endothiapepsine te optimaliseren ook voor andere eiwitten kunnen worden gebruikt. Uiteindelijk het oplossen van het probleem van het creëren van grote volumes (>100 μL) microkristallen (10-20 μm) voor seriële kristallografie-experimenten bij XFELs en synchrotrons.
Het protocol verdeelt de taak van microkristallisatie met groot volume in drie stappen: (1) Het optimaliseren van kristalmorfologie, (2) Overschakelen naar batch en (3) Schalen. In stap 1 moet het bereik van kristalvormen dat een eiwit kan creëren, worden onderzocht in dampdiffusieplaten. Omstandigheden die aanleiding geven tot enkele, doosachtige kristallen die diffracten tot de vereiste resolutie moeten het doel zijn. In stap 2 kunnen geselecteerde omstandigheden vervolgens worden omgezet van dampdiffusie in batch. Hier is het optimalisatiecriterium de kristalgroeitijd en om omstandigheden te vinden die binnen 24 uur aanleiding geven tot eiwitkristallen. Een morfogram kan ook worden uitgezet om de experimentator een idee te geven van de locatie van de oplosbaarheidslijn en nucleatiezonegrenzen. Dit morfogram is van groot nut in stap 3, Schalen. Het morfogram geeft een indicatie van de vraag of nucleatie alleen Xn kan verhogen en Xs kan verlagen. Naarmate het volume van het experiment toeneemt, kunnen Xn en Xs voortdurend worden beoordeeld als de belangrijkste criteria voor schaalsucces.
In het geval van endothiapepsine onthulde stap 1 wat mogelijk een voorheen onbekende kristalmorfologie voor endothiapepsine was. Deze morfologie had dezelfde ruimtegroep als die eerder gemeld, maar, belangrijk voor seriële kristallografie, een meer doosachtige vorm. Enkele kristallen leken ook te groeien uit enkele nucleatiepunten, in tegenstelling tot de ventilatoren die uit andere omstandigheden werden gecreëerd (figuur 4). Voor de geselecteerde voorwaarde was stap 2 al gedeeltelijk vervuld omdat kristalgroei in < 24 uur plaatsvond. Het morfogram gaf aan dat zowel een straight als seeded-batch protocol succesvol zou kunnen zijn bij het schalen in stap 3. Initiële schaling in rechte batch, creëerde een toestand die kristallen produceerde met een Xn en Xs bereik van 3,6 ± 1,2 x 106 kristallen · ml-1 en 42 ± 4,1 μm, respectievelijk. Deze kristallen, hoewel acceptabel voor sommige seriële kristallografie-experimenten, werden te groot geacht. Er werden dus extra optimalisaties uitgevoerd. Het uiteindelijke protocol produceerde kristallen met een concentratie en groottebereik van respectievelijk 3,1 x 106 kristallen·ml-1 en 15 ± 3,9 μm. Dit was meer dan ideaal voor de geplande experimenten.
De methode richt zich op de transformatie van 'oplosbare' eiwitkristallen gekweekt in dampdiffusieplaten naar batch. De reden voor deze focus is dat de overgrote meerderheid van oplosbare eiwitkristallen wordt gekweekt via dampdiffusie26. De gepresenteerde concepten kunnen echter ook worden toegepast op oplosbare eiwitkristallen die zijn gekweekt met behulp van andere methoden, zoals microbatches. De concepten kunnen ook van toepassing zijn op membraaneiwitkristallen gekweekt in LCP; want ook dit is een batchkristallisatieproces.
Een belangrijk aspect van het protocol is het proces van het transformeren van de omstandigheden van kristallen die in dampdiffusieplaten worden gekweekt, zodat ze in batch kunnen worden gekweekt. Voor deze transformatie maakt de methode gebruik van het criterium voorgesteld door Beale et al. (2019)26. Kristallen die via een batchproces worden gekweekt, zelfs in dampdiffusieplaten, zullen zich snel vormen (< 24 uur). Dit criterium is een benadering op basis van de snelheid van dampdiffusiedruppelevenwicht en is het meest waar voor peg-gebaseerde precipitantcondities. Kristallisatiecondities zullen echter een grote verscheidenheid aan verbindingen bevatten die de evenwichtstijd zullen beïnvloeden. De equilibratie van kristallisatiecondities op basis van zout, bijvoorbeeld sterk geconcentreerd ammoniumchloride, kan in 1-2 dagen plaatsvinden. Daarom is het 24-uurscriterium mogelijk niet waar voor op zout gebaseerde omstandigheden. Op zout gebaseerde omstandigheden kunnen ook complexere fasediagrammen26,30 hebben die mogelijk niet voldoen aan het archetype dat in dit protocol wordt gepresenteerd. Een verkorting van het tijdscriterium voor op zout gebaseerde omstandigheden tot 12 of 6 uur kan nodig zijn als schalen naar grotere volumes onmogelijk blijkt.
Een andere beperking van deze methode is de schijnbare complexiteit. Het protocol dat werd gevolgd om de microkristallisatie van endothiapepsine te optimaliseren, veranderde de oorspronkelijke toestand van het sparse-matrixscherm relatief weinig. De eerste treffer die werd waargenomen in het PACT-scherm was 0,1 HEPES pH 7,0, 0,2 M MgCl2 en 20% (w / v) PEG 6.000. De uiteindelijke geschaalde kristallisatiebuffer was 0,1 Tris-HCl pH 7,0, 0,15 M MgCl2 en 40% (w/v) PEG 6.000. Het is ook heel goed mogelijk dat de verandering in buffer van HEPES naar Tris-HCl, en MgCl2-concentratie , weinig heeft bijgedragen aan het succes van het proces. De toename van de PEG 6.000-concentratie is de enige optimalisatie, en een die heel eenvoudig had kunnen worden bereikt.
Deze beoordeling is echter ook te simplistisch. Het verdisconteert niet alleen de problemen die zich voordoen tijdens het schalen (d.w.z. het gebruik van zaden en het doven), maar ook het feit dat alleen omdat dit eiwit eenvoudig bleek, er geen garantie is dat het volgende ook zal blijken te zijn. De stappen die in het protocol worden geadviseerd, zijn bedacht omdat het optimaliseren van de schaal van eiwitkristallisatievolumes erg eiwitduur kan zijn. Tijdens de zeven endothiapepsine-schaalproeven die worden aangetoond, werd 100 mg eiwit geconsumeerd. Toegegeven, sommige van deze stappen zijn uitgevoerd om hun gevolgen in het licht van dit protocol aan te tonen. Toch kan 100 mg van een eiwit, plus mogelijk nog eens 50 mg eiwit dat tijdens een experiment wordt geconsumeerd (tabel 1), een aanzienlijke investering in tijd of geld zijn.
Gelukkig is het niet duidelijk dat deze massa van het vereiste monster alomtegenwoordig is in alle eiwitten. Endothiapepsine was zeer oplosbaar en had daarom een grote eiwitconcentratie nodig om oververzadiging te bereiken. In andere (momenteel onder optimalisatie) kan oververzadiging worden bereikt bij 10 of zelfs 5 mg / ml. Dergelijke variabelen zijn eiwitspecifiek en moeten worden omarmd wanneer ze verschijnen.
Andere beperkingen van de methode zijn onder meer de afhankelijkheid van complexe apparatuur zoals vloeistofbehandelingsrobots voor het maken van schermen en platen, en imagers om platen automatisch in beeld te brengen wanneer dat nodig is. Er zijn alternatieve routines aangeboden om de behoefte aan sommige van deze apparaten te beperken, maar het protocol zal tijdrovender zijn om zonder hen te volgen. Het protocol stelt ook voor om de diffractie van geoptimaliseerde kristallen te testen. Voor kristallografen zonder regelmatige toegang tot een synchrotron kunnen deze tests een uitdaging zijn. Controles bij elke stap zijn misschien niet nodig, maar deze tests worden sterk aanbevolen zodra een treffer is geïdentificeerd en voor en na het schalen. Niet-diffracterende kristallen bij een XFEL zijn helaas niet ongewoon. Gezien dit, is het beter om voorzichtig te zijn met betrekking tot aannames over kristaldiffractie.
Uiteindelijk zullen dit protocol en de hier gepresenteerde resultaten een gids, ideeën en een voorbeeld bieden aan degenen die worstelen met het produceren van monsters voor seriële kristallografie-experimenten. Hopelijk, naarmate seriële kristallografie verder wordt ontwikkeld, zullen de monstervereisten van de techniek zodanig worden verminderd dat de behoefte aan protocollen zoals deze zal worden verminderd. Maar zelfs in dit geval zullen de hier gepresenteerde strategieën nog steeds nuttig zijn voor diegenen die de kristallisatieruimte van hun eiwit willen verkennen.

Kamertemperatuur (RT) macromoleculaire kristallografie is weer populair binnen de structurele biologie gemeenschap. De ontwikkeling van X-ray Free Electron Laser (XFEL) lichtbronnen heeft de ontwikkeling van RT-monsterafgiftebenaderingen 1,2,3,4 gestimuleerd en deze methoden zijn nu toegepast op synchrotrons 5,6,7,8. RT-methoden openen niet alleen de mogelijkheid van pomp-sonde experimentele strageties 9,10,11,12, maar er is ook steeds meer bewijs dat ze alternatieve conformatietoestanden bevorderen binnen eiwitten 13,14,15,16,17.
De belangrijkste reden waarom cryo-methoden in de late jaren 1990 tractie kregen ten opzichte van RT-benaderingen, was echter de vertraging van stralingsschade door kristaltemperaturen onder nul18. Cryo-methoden19 begonnen het verzamelen van een complete dataset van een enkel eiwitkristal mogelijk te maken. Moderne RT-methoden bij XFELs en synchrotrons losten het probleem van single-crystal stralingsschade op door de ontwikkeling van snelle (> 100 Hz) kristalafgiftestrategieën 1,2,3,4. Deze methoden maken het mogelijk om een complete dataset te verzamelen van duizenden individueel blootgestelde kristallen. Deze RT-toedieningsbenaderingen vereisen daarom de productie van grote hoeveelheden oplossingen die homogene microkristallen bevatten (> 100 μL < 50 μm kristallen). Omdat cryo-methoden echter meestal alleen enkele kristallen vereisen, zijn methoden om dergelijke microkristallijne slurries te maken momenteel niet alomtegenwoordig in eiwitkristallografielaboratoria.
Er zijn voorbeelden in de literatuur van hoe delen van de microkristallisatie-optimalisatieprocedure voor seriële kristallografiemonsters moeten worden uitgevoerd. Hier moet een onderscheid worden gemaakt tussen membraan en oplosbare eiwitten. Protocollen om de groei van micromembraaneiwitkristallen gekweekt in monooleïne (of een ander lipide) voor lipide kubische fase (LCP) te optimaliseren, zijn goed beschreven20,21,22. Methoden voor de microkristallisatie van oplosbare eiwitten, waaronder membraaneiwitten die in niet-LCP-omstandigheden worden gekweekt, ontbreken echter over het algemeen. Eerdere studies hebben zich gericht op specifieke delen van het proces, zoals microkristalscreening 23,24, het verbeteren van nucleatie24 en schalen met behulp van vrije interfacediffusie 25, maar geen volledige methode.
Onlangs werd echter een methodebeschreven 26 die probeert een compleet protocol aan te bieden. Zoals veel aspecten van eiwitkristallografie is het niet nieuw. Veel van de voorgestelde ideeën werden al beschreven door Rayment (2002)27. De methode is bedoeld om kristallografen te laten zien hoe ze de conversie kunnen uitvoeren van een enkel, kristal gekweekt met behulp van dampdiffusie, naar een batchmethodologie om duizenden microkristallen te laten groeien. De methode richt zich op dampdiffusie als een gemeenschappelijk uitgangspunt, aangezien 95% van alle Protein Data Bank (PDB) -afzettingen afkomstig zijn van kristallen die zijn gekweekt in dampdiffusieplaten26. Dampdiffusie is echter niet de ideale methode voor microkristallisatie26, dus wordt een methodologie beschreven om dampdiffusie om te zetten in batchkristallisatie. Zodra kristallen in batch kunnen worden gekweekt, wordt het schalen van routes naar grotere volumes praktischer. Gezien de grillen van eiwitkristallisatie, zouden de auteurs benadrukken dat deze methode niet failsafe is. Het protocol moet echter op zijn minst inzicht geven in de 'kristallisatieruimte' van een eiwit.
Deze methode is gebaseerd op het eiwitkristallisatiefasediagram en hoe een goed begrip van dat diagram als leidraad kan dienen tijdens microkristallisatie-optimalisatie. Een eiwitfasediagram wordt gewoonlijk weergegeven als een x/y-plot met precipitant- en eiwitconcentraties op respectievelijk de x- en y-as (figuur 1A). Vanaf het zuiverwaterpunt (linkerbenedenhoek - figuur 1A) neemt de concentratie van zowel eiwit als precipitant toe totdat de oplosbaarheidslijn is bereikt. De oplosbaarheidslijn markeert het punt van oververzadiging (paarse lijn - Figuur 1A). Wanneer een eiwit oververzadigd is, wordt de oplossing thermodynamisch instabiel en begint te scheiden in twee fasen: 'eiwitrijk' en een stabiele verzadigde oplossing. Deze scheiding kan overal buiten de oplosbaarheidslijn plaatsvinden en de kinetiek ervan is afhankelijk van de eigenschappen van het eiwit en de componenten van de oplossing.
Wanneer de eiwit- en precipitantconcentraties te groot zijn, zal het eiwit onstabiel uit de oplossing uiteenvallen en resulteren in amorf neerslag (roze gebied - Figuur 1A). Geordende fasescheiding kan echter optreden in het nucleatiegebied [zie Garcia-Ruiz (2003)28 voor een gedetailleerde beschrijving] en kristalkernen hebben de neiging zich te vormen (groen gebied - Figuur 1A). Nucleatie en groei verwijdert eiwit uit de oplossing en verplaatst de druppel naar het metastabiele gebied waar de groei kan doorgaan totdat de oplosbaarheidslijn is bereikt [zie McPherson en Kuznetsov (2014) 29 voor gedetailleerde bespreking]. Het diagram is, voor de overgrote meerderheid van de kristallisatiecondities, een grove oversimplificatie30. Hoe dan ook, het diagram is nog steeds van groot nut voor microkristallografen, omdat de mapping van het diagram het mogelijk maakt om de oplosbaarheidslijn en de kinetiek van nucleatie te bepalen.
In termen van het maken van microkristallen zijn de twee factoren tijdens kristallisatie die moeten worden geoptimaliseerd het aantal kristallen (Xn) en hun gemiddelde, langste dimensie (Xs). X n zal evenredig zijn met het aantal nucleatiegebeurtenissen (n ) (Eq. 1).
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61896/61896fig01v2.jpg">     Eq. 1
X s is evenredig met de concentratie van vrij eiwit boven de oplosbaarheidslijn (Ps) gedeeld door Xn (Eq. 2).
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61896/61896eq02.jpg">     Eq. 2
In een perfecte situatie zou elke nucleatiegebeurtenis een mogelijk kristal opleveren en elk van deze kristallen zou gelijke toegang hebben tot het beschikbare eiwit in oplossing. Figuur 2 is een grafische weergave van een ideaalscenario van de relatie tussen Xn en Xs. Praktisch gezien is de belangrijkste controle die een kristallograaf heeft over Xn en Xs door de hoeveelheid nucleatie te beïnvloeden of door de toevoeging van zaadkristallen. De microkristallograaf moet beoordelen hoe Xn zodanig kan worden verhoogd dat een geschikte kristalconcentratie en kristalgrootte beide kunnen worden gecreëerd.
De meeste kristallisatietechnieken vereisen een 'overgangsperiode' (figuur 1B). Bijvoorbeeld, in een dampdiffusie-experiment, bij het mengen van het eiwit en de precipiterende oplossingen, zullen de concentraties van elk veranderen als de druppel in evenwicht is met de putoplossing. Men hoopt dat deze veranderingen de daling geleidelijk zullen overbrengen naar de nucleatiezone waar de neiging tot kristallisatie zal toenemen. Naarmate kristallen beginnen te nucleeren en groeien, zal de hoeveelheid eiwit in oplossing beginnen te dalen, waardoor de kans op verdere nucleatie afneemt. De uiteindelijke hoeveelheid nucleatie zal eiwit- en conditiespecifiek zijn, en ook afhankelijk van de diepte van penetratie in de nucleatiezone. Gezien de beperkte nucleatiezonepenetratie van methoden die een overgangsstap vereisen, zal het niveau van nucleatie uiteindelijk beperkt zijn tot de snelheid van nucleatie op de grens van het metastabiele-nucleatiegebied.
Vanwege het belang van het kunnen verbeteren van het niveau van nucleatie voor een microkristallograaf, is het belangrijk om over te stappen op een batchkristallisatiemethodologie. Batch kan meer voordeel halen uit het hele nucleatiegebied (figuur 1C). Bij batchmethoden is het idee om het eiwit en het precipitant zodanig te mengen dat een oververzadigde oplossing ontstaat zonder dat er veranderingen in de componentconcentraties nodig zijn. Nucleatie moet onmiddellijk na het mengen mogelijk zijn. Batchmethoden maken het daarom mogelijk om de hele nucleatiezone theoretisch te bereiken. Elke toename van de nucleatiekinetiek voorbij de metastabiele-nucleatiegrens kan dan worden gebruikt.
Als het basale niveau van kristalkernvorming niet voldoende is om een grote Xn te genereren, kunnen micro-seedingmethoden worden gebruikt. Bij microzaaien worden voorgekweekte kristallen afgebroken tot een brij van kristallijne fragmenten die kunnen fungeren als een steiger voor verse kristalgroei31,32. Microzaaien is op grote schaal gebruikt in seriële kristallografische monstervoorbereiding als een manier om Xn te vergroten zonder de noodzaak van toenemende kristalkernvorming (figuur 1C).
De overgang van dampdiffusie naar batch kan op een fasediagram worden gevisualiseerd als het verplaatsen van het experimentele startpunt van de niet-oververzadigde of metastabiele gebieden naar de nucleatiezone. Dit kan door de eiwit- en/of precipitantconcentraties en/of de verhouding van de twee binnen de druppel te verhogen (figuur 1D) en te observeren welke omstandigheden kristallen opleveren die snel verschijnen (< 24 uur)26. Volledige dampdiffusiedruppel kan dagen of weken duren33. Daarom, door te zoeken naar omstandigheden die snel verschijnende kristallen laten zien, kunnen batchcondities worden gevonden zonder over te stappen op alternatieve kristallisatiescreeningformaten zoals micro-batch34,35,36,37.
Zodra de nucleatiezone is gevonden, is een batchconditie gevonden en kan een morfogram - hier een ruw fasediagram - worden gemaakt. Het morfogram is van groot nut bij het overwegen of een seeded-batch of straight batch protocol moet worden gebruikt. Door de Xn uit te zetten als functie van de eiwit- en precipitantconcentratie kan een beoordeling van de nucleatiekinetiek worden gemaakt26. Als X n laag blijft over het hele nucleatiegebied, kan seeded-batch nodig zijn om Xn groot genoeg te maken om de kristalgroei te beperken. Deze beoordeling is de eerste stap in het proces van schaalvergroting naar grotere volumes (> 100 μL).
Deze methode is zo ontworpen dat deze in de meeste kristallisatielaboratoria kon worden uitgevoerd met behulp van standaard dampdiffusiekristallisatieapparatuur. Er zijn ook veel studies uitgevoerd die technieken beschrijven om veel delen van dit proces te vergemakkelijken, mocht de apparatuur beschikbaar zijn. Deze omvatten, maar zijn niet beperkt tot, dynamische lichtverstrooiing (DLS) 25,27, niet-lineaire beeldvorming 20,24,25, poederdiffractie 20,24,27 en elektronenmicroscopie26 [zie Cheng et al. (2020)40 voor een mooie beoordeling].
Het doel van dit werk is om een visuele demonstratie te geven van de methode om over te schakelen van kleine volume (< 500 nL) dampdiffusiekristallisatie naar grote volume (> 100 μL) batchkristallisatie. Endothiapepsine van Cryphonectria parasitica is gebruikt als een voorbeeldsysteem om deze vertaling aan te tonen. Het type experiment en de monsterafgiftemethode waarvoor de microkristallen nodig zijn, zal de ideale Xs-uitgang 26 beïnvloeden. Voor mengexperimenten die een milliseconde tijdresolutie41 of gasdynamische virtuele nozzles42 vereisen, kan een uiteindelijke Xs van < 5 μm wenselijk zijn. In dit geval was het doel om eiwitkristallen te produceren die diffracten tot ongeveer 1,5 Å, voor een foton-geactiveerd pomp-sonde-experiment, en met behulp van een fixed-target delivery benadering.
Om een illustratie te geven van de monstervereisten van een dergelijk serieel kristallografie-experiment met endothiapepsine, toont tabel 1 de experimentele parameters van een hypothetisch experiment. De voorbeeldinformatie was gebaseerd op het hieronder beschreven protocol. Gezien enkele conservatieve schattingen over hit rates en vereisten voor gegevensverzameling, is 50 mg de totale schatting van het monsterverbruik voor het hele experiment.
Figuur 3 toont een stroomschema van het volledige optimalisatieproces van de initiële kleine volume dampdiffusiekristallisatie tot grootschalige batch. Voor de meeste seriële kristallografieprojecten begint dit protocol bij stap 2: 'overgang naar batch', omdat het doeleiwit al is gekristalliseerd. Stap 1 is echter opgenomen voor de volledigheid en om de lezers te herinneren aan het belang ervan. Het vinden van een toestand die aanleiding geeft tot een goed diffracterend, enkel, groot kristal is het beste startpunt voor microkristaloptimalisatie. In stap 2 kan deze toestand vervolgens worden geoptimaliseerd van dampdiffusie tot batch en kan een morfogram van de nucleatie en metastabiele gebieden worden uitgezet. Zodra dit is gebeurd, kan de batchconditie worden geschaald naar grotere volumes in stap 3. Tegen het einde van het stroomdiagram heeft een kristallograaf een herhaalbaar, groot volume (> 100 μL), microkristallisatie, batchprotocol voor endothiapepsine gemaakt. Deze methode kan vervolgens worden toegepast op hun specifieke eiwit van belang.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Swissci 96-well 2-Drop plates</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD11-002</td>
			<td>96-well 2-drop crystallisation plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swissci 96-well 3-Drop plates</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD11-003</td>
			<td>96-well 3-drop crystallisation plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mosquito LCP liquid handling robot</td>
			<td>sptlabtech</td>
			<td>mosquito LCP</td>
			<td>Crystallisation robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClearVue Sheets</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD6-015</td>
			<td>96-well crystallization plate seals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Tube 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td>1.5 mL centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scaple</td>
			<td>Swan and Morton</td>
			<td>No. 3 scalple and No. 3 handle</td>
			<td>Scalple for cutting open plate seals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS 3 Vortex</td>
			<td>IKA</td>
			<td>3319000</td>
			<td>Vortex for mixing solution and making seed stocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well XRL Plate</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD3-11</td>
			<td>24-well hanging-drop plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube revolver/rotator</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>88881001</td>
			<td>Tube revolver for mixing solution during scaling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Research plus pipettes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>Range of manual pipettes, 0.5-10, 1-20, 10-100, 100-1000 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf pipette tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>Range of tip sizes for manual pipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suparen 600</td>
			<td>Prochem AG</td>
			<td>Suparen 600</td>
			<td>Endothiapepsin solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>241245-1KG</td>
			<td>Sodium Acetate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8382T014</td>
			<td>Tris</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670-1kg</td>
			<td>Magnesium Chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG 6,000</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>81255-1kg</td>
			<td>PEG 6,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethelyene glycol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>324558-1L</td>
			<td>Ethelyene glycol for cyro-protecting the crystals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PACT Premier HT screen</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD1-36</td>
			<td>PACT Premier 96-well crystal screen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOW CORNING high vacuum grease</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD6-02</td>
			<td>Grease for sealing 24-well plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hirschmann 22 x 22 mm glaser cover slides</td>
			<td>Hirschmann</td>
			<td>8000104</td>
			<td>Cover slides for sealing 24-well sitting drop plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal pins</td>
			<td>PSI</td>
			<td>Manufactured inhouse</td>
			<td>Thin-film supports for micro-crystals.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-1.3 mm SiLibeads Type S</td>
			<td>Faust</td>
			<td>6239547</td>
			<td>Glass beads for making mico-seed stocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macbook Pro</td>
			<td>Apple</td>
			<td>Macbook Pro</td>
			<td>Computer for performing data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCP4 software suite</td>
			<td>CCP4</td>
			<td></td>
			<td>Diffraction pattern data processing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>Microsoft Office</td>
			<td>Plotting tool for phase diagram</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hausser Scientific Bright-Line counting chamber</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>02-671-51B</td>
			<td>Tool to calculate crystal concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PACT Premier</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD1-29-ECO</td>
			<td>Sparse-matrix crystallization screen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rock Imager</td>
			<td>Formulatrix</td>
			<td>Rock Imager</td>
			<td>Temperature controlled crystal plate storage and imager</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rock MakerWeb</td>
			<td>Formulatrix</td>
			<td>Rock MakerWeb</td>
			<td>Crystal plate creation and image storage stoftware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formulator</td>
			<td>Formulatrix</td>
			<td>Formulator</td>
			<td>96-well crystal screen creation liquid handling robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica MZ16 Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica MZ16</td>
			<td>Light microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS V4.6</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LAS V4.6</td>
			<td>Software for Leica microscopes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectra/Por 3.5 kDa dialysis tubing</td>
			<td>Spectrumlabs</td>
			<td>Spectra/Por 3 Dialysis Membrane</td>
			<td>3.5 kDa dialysis membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing closures</td>
			<td>Spectrumlabs</td>
			<td>Spectra/Por 3 Duniversal Closures</td>
			<td>Clips to seal the dialysis tubing ends</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon 10 kDa centrifugal concentrator</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>Amicon Ultra-15 10 kDa centrifugal concentrator</td>
			<td>10 kDa centrifugal filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5810 R swing bucket centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810 R Centrifuge</td>
			<td>Swing bucket centrifuge</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimizing the growth of endothiapepsin crystals for serial crystallography experiments

Hier wordt een protocol gepresenteerd om het maken van grote volumes (> 100 μL) van microkristallijne slurries die geschikt zijn voor seriële kristallografie-experimenten bij zowel synchrotrons als XFELs te vergemakkelijken. De methode is gebaseerd op een goed begrip van het eiwitkristalfasediagram en hoe die kennis kan worden gebruikt. De methode is verdeeld in drie fasen: (1) het optimaliseren van de kristalmorfologie, (2) de overgang naar batch en (3) het schalen. Fase 1 omvat het vinden van goed diffracterende, enkelvoudige kristallen, hopelijk maar niet noodzakelijkerwijs, presenterend in een kubusachtige morfologie. In fase 2 wordt de fase 1-conditie geoptimaliseerd door de kristalgroeitijd. Deze strategie kan kristallen die door dampdiffusie zijn gegroeid, omzetten in batches. Zodra kristalgroei binnen ongeveer 24 uur kan plaatsvinden, kan een morfogram van het eiwit- en precipitantmengsel worden uitgezet en gebruikt als basis voor een schaalstrategie (fase 3). Wanneer kristallen in batch kunnen worden gekweekt, kan worden geprobeerd te schalen en de kristalgrootte en -concentratie worden geoptimaliseerd naarmate het volume wordt verhoogd. Endothiapepsine is gebruikt als demonstratie-eiwit voor dit protocol. Sommige van de gepresenteerde beslissingen zijn specifiek voor endothiapepsine. Het is echter te hopen dat de manier waarop ze zijn toegepast een manier van denken over deze procedure zal inspireren die anderen kunnen aanpassen aan hun eigen projecten.

Watch this Scientific Journal Video about Optimizing the Growth of Endothiapepsin Crystals for Serial Crystallography Experiments at JoVE.com

Optimizing the Growth of Endothiapepsin Crystals for Serial Crystallography Experiments

Het doel van dit artikel is om de kijker een goed begrip te geven van hoe ze hun kleine volume, dampdiffusieprotocol, voor het kweken van grote, enkele eiwitkristallen, kunnen transformeren in een grote batch microkristallisatiemethode voor seriële kristallografie.

Optimaliseren van de groei van endothiapepsine kristallen voor seriële kristallografie experimenten

Here, a protocol is presented to facilitate the creation of large volumes (&#62; 100 &#181;L) of micro-crystalline slurries suitable for serial ...

Seriële kristallografie-experimenten kunnen een uitdaging zijn. Een belangrijke hindernis in hun praktijk is het maken van microkristallijne monsters. Dit protocol laat zien hoe dergelijke monsters betrouwbaar kunnen worden gemaakt.Deze methode maakt gebruik van endothiapepsine om een kader te bieden voor het optimaliseren van grote kristallen die in dampdiffusieplaten met een klein volume worden gekweekt tot microkristallijne slurries met een groot volume. We kunnen niet beweren dat dit protocol universeel succesvol zal zijn. We hopen echter dat de ideeën en methoden die hier worden voorgesteld, anderen een experimenteel kader bieden om op andere eiwitten te gebruiken.Om te beginnen, bereid een twee-druppel 96 putplaat voor met de kristallisatiebuffer met behulp van de Formulatrix-robot. Meng met behulp van een vloeistofbehandelingsrobotmix 150 nanoliter vers ontdooid endothiapepsine met 150 nanoliter van de kristallisatiebuffer in elke put. Sluit de plaat af en laat de kristallen 24 uur groeien in het Formulatrix Hotel.Breek na 24 uur de kristallen op en verwijder ze uit vijf putten van de kristallisatieplaat met 96 putten. Plaats ze in 250 microliter van de kristallisatiebuffer in een centrifugebuis van 1,5 milliliter in een ijsemmer. Voeg 10 tot 15 glasparels van een millimeter grootte toe aan de centrifugebuis.Draai de kristallen en kralen op 1000 RPM gedurende 30 seconden en vervang ze gedurende 30 seconden op ijs. De zaden kunnen dan direct gebruikt worden of bewaard worden bij min 20 graden Celsius. Om een morfogramexperiment uit te voeren, voegt u vijf tot 40% concentraties PEG 6000 toe met één kies Tris-HCl bij pH zeven en 0,15 molair magnesiumchloride langs de plaatkolommen van een twee-druppel 96-well rasterscherm Repareer een sequentiële verdunning van endothiapepsine in 0,1 molair natriumacetaat van 100 tot 12,5 milligram per milliliter gedurende acht stappen.Vervolgens pipetteer acht microliter van elke verdunning gevolgd door twee microliter zaadvoorraad in de vloeistofbehandelingsrobotplaat. Gebruik een vloeistofbehandelingsrobot om 150 nanoliter van elke verdunning van endothiapepsine in subputten één en twee van het scherm af te geven. Multi-aspirateer 50 nanoliter ontdooide zaadvoorraad en 100 nanoliter van de putoplossing uit subput twee en doseer beide in de eiwitoplossing.Meng oplossingen drie keer na toevoeging van de kristallisatiebuffer of kristallisatiebuffer en zaadmix. Verzegel nu de plaat en het beeld op nul, drie, zes, 12, 18 en 24 uur van de eerste dag elke dag voor de eerste week en elke week voor de komende vier weken bij 20 graden Celsius. Bekijk na 24 uur de plaat onder een microscoop, schat het aantal kristallen in elke put en meet een monster van de kristallen.Noteer deze schattingen in het meegeleverde werkblad morfogramgenerator. Voer de beginconcentraties van endothiapepsine en PEG 6000 in de juiste dozen in. Het werkblad plot de resultaten automatisch in de traditionele fasediagramindeling met de precipitant- en eiwitconcentraties op respectievelijk de X- en Y-as.Welnu, omstandigheden die alleen aanleiding geven tot kristallen in hun gezaaide druppels geven het MetaStable-gebied van het diagram aan, terwijl omstandigheden met kristallen in zowel de gezaaide als niet-gezaaide druppels de nucleatiezone aangeven. Selecteer uit de morfogramanalyse de meest veelbelovende voorwaarde voor het schalen in 24 putplaten. Begin dan met 100 milligram per milliliter endothiapepsine en 35% PEG 6000.Bereid vijf milliliter kristallisatiebuffer met 35% PEG 6000, 0,1 molair Tris-HCl met pH zeven en 0,15 molair magnesiumchloride. Plaats nu 0,5 milliliter van de kristallisatiebuffer in drie putjes van een ingevette 24-well hangende dropplate. Meng 15 microliter endothiapepsine met 15 microliter kristallisatieoplossing op een glazen afdekslip.Plaats de oplossing over de putjes en laat de plaat 24 uur staan. Bekijk na 24 uur de plaat onder een microscoop, schat het aantal kristallen in de druppel en meet hun grootte. Als de kristallen onjuist zijn, herhaal dan deze stap, maar verander de eiwitconcentratie of voeg zaden toe als de kristalkernvorming niet hoog genoeg is.Herhaal het 24-well scaling experiment door zaden toe te voegen met een hogere concentratie PEG 6000. Plaats 0,5 milliliter van de nieuwe kristallisatiebuffer in drie putjes van een ingevette 24-well hangende dropplate. Plaats 15 microliter endothiapepsine op een glazen afdekslip en meng vijf microliter zaadvoorraad en 10 microliter kristallisatieoplossing met de endothiapepsine-oplossing.Keer de afdekstroken om, plaats ze over de putten en laat ze 24 uur staan. Controleer de druppels opnieuw om te zien of de kristallen kleiner zijn en een hogere concentratie hebben. Schat het aantal kristallen in de druppel en meet hun grootte opnieuw om te zien of ze nu de juiste grootte hebben.Om een seeded-batch-protocol uit te voeren, bereidt u de kristallisatiebuffer voor van 40% PEG 6000, 0,1 molair Tris-HCl met een pH van zeven en 0,15 molair magnesiumchloride. Meng vooraf 50 microliter zaadvoorraad en 100 microliter kristallisatieoplossing en meng met eiwitoplossing in de centrifugebuis van 1,5 milliliter. Draai de buis gedurende 10 seconden en plaats deze op een rocker of shaker bij 20 graden Celsius.Neem elke 20 minuten een aliquot van 2,5 microliter van de batchoplossing. Controleer de grootte en het aantal kristallen met behulp van een hemocytometer. Tel het aantal kristallen en meet hun grootte onder de microscoop.Wanneer de kristallen ongeveer 15 micron dimensie hebben bereikt, dooft u de reactie met 150 microliter 0,5 molair natriumacetaat aangevuld met 0,5 molair Tris-HCl, 0,075 molair magnesiumchloride en 20% PEG 6000. Controleer de kristalgrootte en -concentratie opnieuw met behulp van de hemocytometer. Bewaar de kristallen bij 20 graden Celsius.De endothiapepsine morfogram analyse suggereerde dat nucleatie werd beïnvloed door zowel eiwit- als precipitantconcentraties. De MetaStable, nucleatie en neerslaggebieden van het diagram kunnen mooi worden onderscheiden. De toevoeging van zaden verhoogde het kristalgetal aanzienlijk in vergelijking met druppels zonder zaden.Analyse van de endothiapepsine microkristallisatie in volumes van 200 tot 300 microliter onthulde de veranderingen in kristalnucleatie en de langste dimensie in de loop van de tijd. Het verhogen van de PEG-concentratie tot 35% verbeterde de kristallisatie, met een uiteindelijke kristalconcentratie van ongeveer 3,6 keer 10 tot de zes per milliliter, en de langste kristaldimensie van 42 micrometer. Om de grootte van de uiteindelijke kristallen te verkleinen, werd een eiwitconcentratiereductiebenadering toegepast, die helaas de kristalconcentratie aanzienlijk verminderde en uiteindelijk nog grotere kristallen produceerde.De aanpak van het verhogen van de PEG-concentratie tot 40% leverde echter kristallen op van ongeveer 3,1 keer 10 tot zes per milliliter en een grootte van ongeveer 39 micrometer. Verder leidde het toevoegen van zaden tot een aanzienlijke toename van de kristalconcentratie, ongeveer 1,1 keer 10 tot acht per milliliter en kleinere afmetingen van ongeveer 4,2 micrometer. Het bluseffect dat in de kristallisatiereactie werd geprobeerd, gaf een uiteindelijke kristalconcentratie van ongeveer 2,6 maal 10 tot de zes per milliliter en een grootte van ongeveer 15 micrometer.De CC-helft uitgezet tegen de resolutie van de röntgengegevens vertoonde een lichte afname van de kristalresolutie van de volumes van 10 microliter naar 200 tot 300 microliter. Het kristal diffracteerde echter nog steeds tot 1,5 angstrum, wat voldoende werd geacht. Endothiapepsine is een vergevingsgezind eiwit om mee te werken.We hopen dat het proberen van dit protocol van endothiapepsine nuttige ideeën en methoden voor andere eiwitten zal genereren. Vooral bij kristallografie is het nuttig om te zien hoe dingen eruit zien en voelen in plaats van alleen te proberen een geschreven protocol te volgen. Deze video zal je hopelijk een deel van dat gevoel geven.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography

Voorbereiding en Levering van Protein Microcrystals in lipidische Cubic fase voor Serial Femtoseconde Kristallografie

Membrane proteins (MPs) are essential components of cellular membranes and primary drug targets. Rational drug design relies on precise structural ...

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

Geautomatiseerde Acoustic Afgifte voor de seriële verdunning van Peptide agonisten in potentie Bepaling Testen

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

Microkristallografie van eiwitkristallen en<em&gt; In Cellulo</em&gt; Diffractie

The advent of high-quality microfocus beamlines at many synchrotron facilities has permitted the routine analysis of crystals smaller than 10 &#181;m in ...

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Groeiende eiwit kristallen met verschillende afmetingen, met behulp van geautomatiseerde kristallisatie in combinatie met In Situ Dynamische lichtverstrooiing

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

Karakterisering van glycoproteïnen met de vouw van de immunoglobuline door middel van röntgendiffractie en biofysische technieken

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

Een alles-in-een monsterhouder voor macromoleculaire X-Ray kristallografie met minimale achtergrond verstrooiing

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

X-Ray Kristallografie om de oligomerische staat overgang van de Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050 studie

The M42 aminopeptidases form functionally active complexes made of 12 subunits. Their assembly process appears to be regulated by their metal ion ...

Derivatization of Protein Crystals with I3C using Random Microseed Matrix Screening

De afleiding van eiwitkristallen met I3C met behulp van Random Microseed Matrix Screening

Protein structure elucidation using X-ray crystallography requires both high quality diffracting crystals and computational solution of the diffraction ...

Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip

Kristallisatie en structurele bepaling van een enzym: substraatcomplex door seriële kristallografie in een veelzijdige microfluïdische chip

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We ...

Workflow and Tools for Crystallographic Fragment Screening at the Helmholtz-Zentrum Berlin

Workflow en tools voor kristallografische fragmentscreening in het Helmholtz-Zentrum Berlin

Fragment screening is a technique that helps to identify promising starting points for ligand design. Given that crystals of the target protein are ...