Name: optimizing the growth of endothiapepsin crystals for serial crystallography experiments
Uploaded: 2021-02-04T12:30:00
Duration: 9 min 52 s
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Ce projet a reçu un financement du programme de recherche et d’innovation Horizon 2020 de l’Union européenne dans le cadre de la convention de subvention Marie Skłodowska-Curie n° 701647. Merci beaucoup pour l’aide et le soutien des scientifiques de la ligne de faisceau de la ligne de faisceau X10SA-PXII de la Source de Lumière Suisse.

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

La méthode présentée montre comment optimiser la cristallisation de l’endothiapepsine à partir de gros cristaux (≥ dimension la plus longue de 100 μm), cultivés dans des cribles à 96 puits à matrice clairsemée, à des microcristaux, cultivés dans des tubes à centrifuger (volume de 300 μL) par lots. L’idée derrière le protocole est que les mesures prises pour optimiser l’endothiapepsine pourraient également être utilisées pour d’autres protéines. En fin de compte, répondre au problème de la création de grands volumes (>100 μL) de microcristaux (10-20 μm) pour des expériences de cristallographie en série dans des XFEL et des synchrotrons.
Le protocole divise la tâche de microcristallisation à grand volume en trois étapes: (1) optimisation de la morphologie cristalline, (2) transition vers le lot et (3) mise à l’échelle. À l’étape 1, la gamme de formes cristallines qu’une protéine peut créer doit être explorée dans des plaques de diffusion de vapeur. Les conditions qui donnent naissance à des cristaux uniques en forme de boîte qui diffractent à la résolution requise devraient être l’objectif. À l’étape 2, les conditions sélectionnées peuvent ensuite être transformées de la diffusion de vapeur en lot. Ici, le critère d’optimisation est le temps de croissance des cristaux et de trouver des conditions qui donnent naissance à des cristaux de protéines dans les 24 heures. Un morphogramme peut également être tracé donnant à l’expérimentateur une idée de l’emplacement de la ligne de solubilité et des limites de la zone de nucléation. Ce morphogramme est d’une grande utilité à l’étape 3, Mise à l’échelle. Le morphogramme indiquera si la nucléation seule peut augmenter Xn et faire descendre Xs. Au fur et à mesure que le volume de l’expérience augmente, Xn et Xs peuvent être continuellement évalués comme les critères clés du succès de la mise à l’échelle.
Dans le cas de l’endothiapepsine, l’étape 1 a mis au jour ce qui était potentiellement une morphologie cristalline jusqu’alors inconnue pour l’endothiapepsine. Cette morphologie avait le même groupe spatial que ceux précédemment rapportés mais, ce qui est important pour la cristallographie en série, une forme plus en forme de boîte. Les monocristaux semblaient également se développer à partir de points de nucléation simples, contrairement aux ventilateurs créés à partir d’autres conditions (Figure 4). Pour la condition sélectionnée, l’étape 2 était déjà partiellement satisfaite car la croissance des cristaux s’est produite en < 24 heures. Le morphogramme indiquait qu’un protocole de lot direct ou ensemencé pouvait réussir lors de la mise à l’échelle à l’étape 3. La mise à l’échelle initiale en lot direct, a créé une condition qui a produit des cristaux avec une gamme Xn et Xs de 3,6 ± 1,2 x 106 cristaux ·mL-1 et 42 ± 4,1 μm, respectivement. Ces cristaux, bien qu’acceptables pour certaines expériences de cristallographie en série, ont été jugés trop gros. Des optimisations supplémentaires ont donc été effectuées. Le protocole final a produit des cristaux avec une concentration et une gamme de taille de 3,1 x 106 cristaux·mL-1 et 15 ± 3,9 μm, respectivement. C’était plus qu’idéal pour les expériences prévues.
La méthode se concentre sur la transformation en lots de cristaux de protéines « solubles » cultivés dans des plaques de diffusion de vapeur. La raison de cette focalisation est que la grande majorité des cristaux de protéines solubles sont cultivés par diffusion de vapeur26. Cependant, les concepts présentés pourraient également être appliqués à des cristaux de protéines solubles cultivés à l’aide d’autres méthodes, telles que les micro-lots. Les concepts peuvent également s’appliquer aux cristaux de protéines membranaires cultivés en LCP; car il s’agit également d’un processus de cristallisation par lots.
Un aspect clé du protocole est le processus de transformation des conditions des cristaux cultivés dans des plaques de diffusion de vapeur afin qu’ils puissent être cultivés par lots. Pour cette transformation, la méthode utilise le critère proposé par Beale et al. (2019)26. Les cristaux cultivés par un procédé discontinu, même dans des plaques de diffusion de vapeur, se formeront rapidement (< 24 h). Ce critère est une approximation basée sur la vitesse d’équilibration des gouttes de diffusion de vapeur, et est particulièrement vrai pour les conditions précipitantes basées sur le PEG. Cependant, les conditions de cristallisation contiendront une grande variété de composés qui influenceront le temps d’équilibre. L’équilibrage des conditions de cristallisation à base de sel, par exemple le chlorure d’ammonium hautement concentré, peut se produire en 1-2 jours. Par conséquent, le critère des 24 h peut ne pas être vrai pour les conditions à base de sel. Les conditions à base de sel peuvent également avoir des diagrammes de phase plus complexes26,30 qui peuvent ne pas être conformes à l’archétype présenté dans ce protocole. Une réduction du critère de temps pour les conditions à base de sel à 12 ou 6 heures peut être nécessaire si la mise à l’échelle en plus grands volumes s’avère impossible.
Une autre limite de cette méthode est sa complexité apparente. Le protocole qui a été suivi pour optimiser la micro-cristallisation de l’endothiapepsine a en fait changé relativement peu l’état d’origine du criblage à matrice clairsemée. Le premier résultat observé dans le criblage PACT était de 0,1 HEPES pH 7,0, 0,2 M MgCl2 et 20% (p/v) PEG 6 000. Le tampon de cristallisation à l’échelle finale était de 0,1 Tris-HCl pH 7,0, 0,15 M MgCl2 et 40 % (p/v) PEG 6 000. Il est également très possible que le changement de tampon de HEPES à Tris-HCl, et la concentration de MgCl2 , aient peu contribué au succès du processus. Laisser l’augmentation de la concentration de PEG 6 000 comme seule optimisation, et celle qui aurait pu être réalisée tout simplement.
Cependant, cette évaluation est également trop simpliste. Cela ne tient pas compte seulement des problèmes rencontrés lors du détartrage (c’est-à-dire l’utilisation de graines et la trempe), mais aussi du fait que ce n’est pas parce que cette protéine s’est avérée simple que la prochaine s’avérera également être. Les étapes conseillées dans le protocole ont été conçues parce que l’optimisation de la mise à l’échelle des volumes de cristallisation des protéines peut être très coûteuse en protéines. Au cours des sept essais de détartrage de l’endothiapepsine qui sont montrés, 100 mg de protéines ont été consommés. Certes, certaines de ces étapes ont été effectuées pour montrer leurs conséquences à la lumière de ce protocole. Même ainsi, 100 mg d’une protéine, plus potentiellement 50 mg supplémentaires pour les protéines consommées au cours d’une expérience (tableau 1), peuvent être un investissement important en temps ou en argent.
Heureusement, il n’est pas clair que cette masse d’échantillon requis soit omniprésente dans toutes les protéines. L’endothiapepsine était très soluble et nécessitait donc une forte concentration de protéines pour atteindre la sursaturation. Dans d’autres (actuellement en cours d’optimisation), la sursaturation peut être atteinte à 10 voire 5 mg/mL. Ces variables sont spécifiques aux protéines et doivent être adoptées lorsqu’elles apparaissent.
Parmi les autres limites de la méthode, citons sa dépendance à l’égard d’équipements complexes tels que des robots de manipulation de liquides pour la création de cribles et de plaques, et des imageurs pour imager automatiquement les plaques en cas de besoin. Des routines alternatives ont été proposées pour limiter le besoin de certains de ces équipements, mais le protocole prendra plus de temps à suivre sans elles. Le protocole suggère également de tester la diffraction de cristaux optimisés. Pour les cristallographes qui n’ont pas d’accès régulier à un synchrotron, ces tests pourraient s’avérer difficiles. Des contrôles à chaque étape peuvent ne pas être nécessaires, mais ces tests sont fortement recommandés une fois qu’un résultat positif a été identifié, ainsi qu’avant et après la mise à l’échelle. Les cristaux non diffractés dans un XFEL ne sont malheureusement pas rares. Compte tenu de cela, il est préférable de pécher par excès de prudence en ce qui concerne les hypothèses sur la diffraction cristalline.
En fin de compte, ce protocole et les résultats présentés ici offriront un guide, des idées et un exemple à ceux qui luttent avec la production d’échantillons pour des expériences de cristallographie en série. Espérons qu’au fur et à mesure que la cristallographie en série sera développée, les demandes d’échantillons de la technique seront réduites de sorte que le besoin de protocoles comme celui-ci sera réduit. Cependant, même dans cet événement, les stratégies présentées ici seront toujours utiles à ceux qui souhaitent explorer l’espace de cristallisation de leur protéine.

La cristallographie macromoléculaire à température ambiante (RT) est à nouveau populaire au sein de la communauté de la biologie structurale. Le développement de sources lumineuses à rayons X (XFEL) a stimulé le développement d’approches de livraison d’échantillons RT 1,2,3,4, et ces méthodes ont maintenant été appliquées aux synchrotrons 5,6,7,8. Non seulement les méthodes RT ouvrent la possibilité de stratégies expérimentales pompe-sonde 9,10,11,12, mais il y a aussi de plus en plus de preuves qu’elles favorisent des états conformationnels alternatifs dans les protéines 13,14,15,16,17.
Cependant, la principale raison pour laquelle les méthodes cryogéniques ont gagné du terrain par rapport aux approches RT à la fin des années 1990 était le ralentissement des dommages causés par les rayonnements par des températures cristallines inférieures à zéro18. Les méthodes cryogéniques19 ont commencé à permettre la collecte d’un ensemble de données complet à partir d’un seul cristal de protéine. Les méthodes modernes de RT dans les XFEL et les synchrotrons ont résolu le problème des dommages causés par le rayonnement monocristallin par le développement de stratégies d’administration rapide (> 100 Hz)de cristaux 1,2,3,4. Ces méthodes permettent de collecter un ensemble de données complet à partir de milliers de cristaux exposés individuellement. Ces approches d’administration RT nécessitent donc la production de grandes quantités de solutions contenant des microcristaux homogènes (> 100 μL de cristaux < 50 μm). Cependant, étant donné que les cryo-méthodes ont tendance à ne nécessiter que des monocristaux, les méthodes de création de telles boues microcristallines ne sont actuellement pas omniprésentes dans les laboratoires de cristallographie des protéines.
Il existe des exemples dans la littérature sur la façon de faire des parties de la procédure d’optimisation de la microcristallisation pour les échantillons de cristallographie en série. Ici, une distinction doit être faite entre les protéines membranaires et solubles. Les protocoles visant à optimiser la croissance des cristaux de protéines micro-membranaires cultivés dans la monooléine (ou un autre lipide), pour la phase cubique lipidique (LCP), ont été bien décrits20,21,22. Cependant, les méthodes de microcristallisation des protéines solubles, y compris les protéines membranaires cultivées dans des conditions non LCP, font généralement défaut. Des études antérieures se sont concentrées sur des parties spécifiques du processus, telles que le criblage de microcristaux 23,24, l’amélioration de la nucléation 24 et la mise à l’échelle à l’aide de la diffusion à interface libre 25, mais pas une méthode complète.
Cependant, une méthode a récemment été décrite26 qui tente d’offrir un protocole complet. Comme beaucoup d’aspects de la cristallographie des protéines, elle n’est pas nouvelle. Bon nombre des idées proposées ont déjà été décrites par Rayment (2002)27. La méthode vise à montrer aux cristallographes comment effectuer la conversion d’un seul cristal cultivé par diffusion de vapeur en une méthodologie de lot pour cultiver des milliers de microcristaux. La méthode se concentre sur la diffusion de vapeur comme point de départ commun, car 95% de tous les dépôts de banques de données sur les protéines (PDB) proviennent de cristaux cultivés dans des plaques de diffusion de vapeur26. La diffusion de vapeur n’est cependant pas la méthode idéale pour la micro-cristallisation26, c’est pourquoi une méthodologie est décrite pour convertir la diffusion de vapeur en cristallisation par lots. Une fois que les cristaux peuvent être cultivés par lots, les voies de mise à l’échelle vers de plus grands volumes deviennent plus pratiques. Compte tenu des aléas de la cristallisation des protéines, les auteurs soulignent que cette méthode n’est pas infaillible. Cependant, le protocole devrait, au moins, fournir un aperçu de « l’espace de cristallisation » d’une protéine.
Cette méthode repose sur le diagramme de phase de cristallisation des protéines et sur la façon dont la compréhension de ce diagramme peut servir de guide lors de l’optimisation de la micro-cristallisation. Un diagramme de phase protéique est généralement représenté comme un diagramme x/y avec des concentrations de précipitants et de protéines sur les axes x et y, respectivement (Figure 1A). À partir du point d’eau pure (coin inférieur gauche - Figure 1A), la concentration de protéines et de précipitants augmente jusqu’à ce que la ligne de solubilité soit atteinte. La ligne de solubilité marque le point de sursaturation (ligne violette - Figure 1A). Lorsqu’une protéine est sursaturée, la solution devient thermodynamiquement instable et commence à se séparer en deux phases: « riche en protéines » et une solution saturée stable. Cette séparation peut se produire n’importe où au-delà de la ligne de solubilité et sa cinétique dépend des propriétés de la protéine et des composants de la solution.
Lorsque les concentrations de protéines et de précipitants sont trop élevées, la protéine se décompose de manière instable hors de la solution et donne un précipité amorphe (région rose - Figure 1A). Cependant, une séparation de phase ordonnée peut se produire dans la région de nucléation [voir Garcia-Ruiz (2003)28 pour une description détaillée] et les nucléants cristallins ont la propension à se former (région verte - Figure 1A). La nucléation et la croissance éliminent les protéines de la solution et déplacent la goutte dans la région métastable où la croissance peut se poursuivre jusqu’à ce que la ligne de solubilité soit atteinte [voir McPherson et Kuznetsov (2014)29 pour une discussion détaillée]. Le diagramme est, pour la grande majorité des conditions de cristallisation, une simplification grossière30. Indépendamment de cela, le diagramme est toujours d’une grande utilité pour les micro-cristallographes car la cartographie du diagramme permet de déterminer la ligne de solubilité et la cinétique de nucléation.
En termes de création de micro-cristaux, les deux facteurs lors de la cristallisation qui doivent être optimisés sont le nombre de cristaux (Xn) et leur dimension moyenne la plus longue (Xs). X n sera proportionnel au nombre d’événements de nucléation (n ) (Eq. 1).
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61896/61896fig01v2.jpg">     Éq. 1
X s est proportionnelle à la concentration de protéines libres au-dessus de la ligne de solubilité (Ps) divisée par Xn (Eq. 2).
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61896/61896eq02.jpg">     Éq. 2
Dans une situation parfaite, chaque événement de nucléation produirait un cristal possible et chacun de ces cristaux aurait un accès égal à la protéine disponible en solution. La figure 2 est une représentation graphique d’un scénario idéal de la relation entre Xn et Xs. En pratique, le principal contrôle qu’un cristallographe a sur Xn et X s est en influençant la quantité de nucléation ou par l’ajout de cristaux graines. Le microcristallographe doit juger comment augmenter Xn de telle sorte qu’une concentration cristalline et une taille cristalline appropriées puissent être créées.
La majorité des techniques de cristallisation nécessitent une « période de transition » (Figure 1B). Par exemple, dans une expérience de diffusion de vapeur, lors du mélange de la protéine et des solutions précipitantes, les concentrations de chacune changeront à mesure que la goutte s’équilibre avec la solution du puits. On espère que ces changements feront progressivement passer la goutte dans la zone de nucléation où la propension à la cristallisation augmentera. Au fur et à mesure que les cristaux commencent à nucléer et à croître, la quantité de protéines en solution commence à diminuer, ce qui diminue la probabilité d’une nucléation supplémentaire. La quantité ultime de nucléation sera spécifique à la protéine et à la condition, et dépendra également de la profondeur de pénétration dans la zone de nucléation. Compte tenu de la pénétration limitée de la zone de nucléation des méthodes qui nécessitent une étape de transition, le niveau de nucléation sera finalement limité au taux de nucléation à la limite de la région de nucléation métastable.
En raison de l’importance de pouvoir améliorer le niveau de nucléation pour un micro-cristallographe, il est important de passer à une méthodologie de cristallisation par lots. Le lot peut tirer davantage parti de l’ensemble de la région de nucléation (Figure 1C). Dans les méthodes discontinues, l’idée est de mélanger la protéine et le précipitant ensemble de sorte qu’une solution sursaturée soit créée sans qu’il soit nécessaire de modifier les concentrations des composants. La nucléation devrait être possible immédiatement après le mélange. Les méthodes batch permettent donc d’atteindre théoriquement toute la zone de nucléation. Toute augmentation de la cinétique de nucléation au-delà de la limite de nucléation métastable peut alors être utilisée.
Si le niveau basal de nucléation cristalline n’est pas suffisant pour générer un grand Xn, des méthodes de micro-ensemencement peuvent être utilisées. Dans le micro-ensemencement, les cristaux pré-cultivés sont brisés pour créer une boue de fragments cristallins qui peut agir comme un échafaudage pour la croissance des cristaux frais31,32. Le micro-ensemencement a été largement utilisé dans la préparation d’échantillons cristallographiques en série comme moyen d’augmenter Xn sans avoir besoin d’augmenter la nucléation cristalline (Figure 1C).
La transition de la diffusion de vapeur au lot peut être visualisée sur un diagramme de phase comme déplaçant le point de départ expérimental des régions non sursaturées ou métastables vers la zone de nucléation. Cela peut être fait en augmentant les concentrations de protéines et/ou de précipitants, et/ou le rapport des deux dans la goutte (Figure 1D), et en observant quelles conditions produisent des cristaux apparaissant rapidement (< 24 h)26. L’équilibrage complet des gouttes de diffusion de vapeur peut prendre des jours ou des semaines33. Par conséquent, en recherchant des conditions qui montrent des cristaux apparaissant rapidement, les conditions des lots peuvent être trouvées sans avoir à passer à d’autres formats de criblage de cristallisation tels que le micro-lot34,35,36,37.
Une fois que la zone de nucléation a été trouvée, une condition de lot a été trouvée et un morphogramme - ici, un diagramme de phase approximatif - peut être créé. Le morphogramme est d’une grande utilité lorsqu’il s’agit d’utiliser un protocole de lot ensemencé ou de lot direct. En traçant le Xn en fonction de la concentration en protéines et en précipitants, on peut évaluer la cinétique de nucléation26. Si X n reste faible dans toute la région de nucléation, un lot ensemencé peut être nécessaire pour rendre Xn assez grand pour limiter la croissance cristalline. Cette évaluation est la première étape du processus de mise à l’échelle vers des volumes plus importants (> 100 μL).
Cette méthode a été conçue de manière à pouvoir être réalisée dans la majorité des laboratoires de cristallisation en utilisant un équipement standard de cristallisation par diffusion de vapeur. De nombreuses études ont également été menées qui décrivent des techniques pour faciliter de nombreuses parties de ce processus, si l’équipement est disponible. Ceux-ci incluent, mais ne sont pas limités à, la diffusion dynamique de la lumière (DLS)25,27, l’imagerie non linéaire 20,24,25, la diffraction des poudres 20,24,27 et la microscopie électronique 26 [voir Cheng et al. (2020)40 pour une belle revue].
L’objectif de ce travail est de fournir une démonstration visuelle de la méthode de transition de la cristallisation par diffusion de vapeur en petit volume (< 500 nL) à la cristallisation par lots à grand volume (> 100 μL). L’endothiapepsine de Cryphonectria parasitica a été utilisée comme exemple de système pour démontrer cette traduction. Le type d’expérience et la méthode d’administration d’échantillons pour lesquels les microcristaux sont nécessaires influenceront la sortieidéale de Xs 26. Pour les expériences de mélange nécessitant une résolution temporelle de l’ordre de la milliseconde41 ou des buses virtuellesdynamiques en phase gazeuse42, un X s final de < 5 μm peut être souhaitable. Dans ce cas, l’objectif était de produire des cristaux de protéines diffractés à environ 1,5 Å, pour une expérience pompe-sonde activée par photon, et en utilisant une approche de livraison à cible fixe.
Pour illustrer les besoins en échantillons d’une telle expérience de cristallographie en série utilisant l’endothiapepsine, le tableau 1 montre les paramètres expérimentaux d’une expérience hypothétique. L’échantillon d’information était basé sur le protocole décrit ci-dessous. Compte tenu de certaines estimations prudentes sur les taux de réussite et les exigences de collecte de données, 50 mg est l’estimation de la consommation totale de l’échantillon pour l’ensemble de l’expérience.
La figure 3 montre un organigramme du processus d’optimisation complet depuis la cristallisation initiale par diffusion de vapeur à petit volume jusqu’au lot à grande échelle. Pour la majorité des projets de cristallographie en série, ce protocole commencera à l’étape 2 : « transition vers le lot », puisque la protéine cible aura déjà été cristallisée. Cependant, l’étape 1 a été incluse pour être complète et pour rappeler aux lecteurs son importance. Trouver une condition qui donne lieu à un cristal simple, grand et bien diffractant est le meilleur point de départ pour l’optimisation des microcristaux. À l’étape 2, cette condition peut ensuite être optimisée de la diffusion de vapeur au lot, et un morphogramme des régions de nucléation et métastables peut être tracé. Une fois cette opération effectuée, la mise à l’échelle de la condition de lot à des volumes plus importants peut être effectuée à l’étape 3. À la fin de l’organigramme, un cristallographe aura créé un protocole de microcristallisation reproductible et de grand volume (> 100 μL) pour l’endothiapepsine. Cette méthode peut ensuite être appliquée à leur protéine d’intérêt particulière.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Swissci 96-well 2-Drop plates</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD11-002</td>
			<td>96-well 2-drop crystallisation plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swissci 96-well 3-Drop plates</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD11-003</td>
			<td>96-well 3-drop crystallisation plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mosquito LCP liquid handling robot</td>
			<td>sptlabtech</td>
			<td>mosquito LCP</td>
			<td>Crystallisation robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClearVue Sheets</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD6-015</td>
			<td>96-well crystallization plate seals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Tube 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td>1.5 mL centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scaple</td>
			<td>Swan and Morton</td>
			<td>No. 3 scalple and No. 3 handle</td>
			<td>Scalple for cutting open plate seals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS 3 Vortex</td>
			<td>IKA</td>
			<td>3319000</td>
			<td>Vortex for mixing solution and making seed stocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well XRL Plate</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD3-11</td>
			<td>24-well hanging-drop plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube revolver/rotator</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>88881001</td>
			<td>Tube revolver for mixing solution during scaling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Research plus pipettes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>Range of manual pipettes, 0.5-10, 1-20, 10-100, 100-1000 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf pipette tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>Range of tip sizes for manual pipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suparen 600</td>
			<td>Prochem AG</td>
			<td>Suparen 600</td>
			<td>Endothiapepsin solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>241245-1KG</td>
			<td>Sodium Acetate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8382T014</td>
			<td>Tris</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670-1kg</td>
			<td>Magnesium Chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG 6,000</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>81255-1kg</td>
			<td>PEG 6,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethelyene glycol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>324558-1L</td>
			<td>Ethelyene glycol for cyro-protecting the crystals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PACT Premier HT screen</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD1-36</td>
			<td>PACT Premier 96-well crystal screen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOW CORNING high vacuum grease</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD6-02</td>
			<td>Grease for sealing 24-well plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hirschmann 22 x 22 mm glaser cover slides</td>
			<td>Hirschmann</td>
			<td>8000104</td>
			<td>Cover slides for sealing 24-well sitting drop plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal pins</td>
			<td>PSI</td>
			<td>Manufactured inhouse</td>
			<td>Thin-film supports for micro-crystals.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-1.3 mm SiLibeads Type S</td>
			<td>Faust</td>
			<td>6239547</td>
			<td>Glass beads for making mico-seed stocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macbook Pro</td>
			<td>Apple</td>
			<td>Macbook Pro</td>
			<td>Computer for performing data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCP4 software suite</td>
			<td>CCP4</td>
			<td></td>
			<td>Diffraction pattern data processing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>Microsoft Office</td>
			<td>Plotting tool for phase diagram</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hausser Scientific Bright-Line counting chamber</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>02-671-51B</td>
			<td>Tool to calculate crystal concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PACT Premier</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD1-29-ECO</td>
			<td>Sparse-matrix crystallization screen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rock Imager</td>
			<td>Formulatrix</td>
			<td>Rock Imager</td>
			<td>Temperature controlled crystal plate storage and imager</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rock MakerWeb</td>
			<td>Formulatrix</td>
			<td>Rock MakerWeb</td>
			<td>Crystal plate creation and image storage stoftware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formulator</td>
			<td>Formulatrix</td>
			<td>Formulator</td>
			<td>96-well crystal screen creation liquid handling robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica MZ16 Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica MZ16</td>
			<td>Light microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS V4.6</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LAS V4.6</td>
			<td>Software for Leica microscopes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectra/Por 3.5 kDa dialysis tubing</td>
			<td>Spectrumlabs</td>
			<td>Spectra/Por 3 Dialysis Membrane</td>
			<td>3.5 kDa dialysis membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing closures</td>
			<td>Spectrumlabs</td>
			<td>Spectra/Por 3 Duniversal Closures</td>
			<td>Clips to seal the dialysis tubing ends</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon 10 kDa centrifugal concentrator</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>Amicon Ultra-15 10 kDa centrifugal concentrator</td>
			<td>10 kDa centrifugal filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5810 R swing bucket centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810 R Centrifuge</td>
			<td>Swing bucket centrifuge</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimizing the growth of endothiapepsin crystals for serial crystallography experiments

Ici, un protocole est présenté pour faciliter la création de grands volumes (> 100 μL) de boues microcristallines adaptées aux expériences de cristallographie en série à la fois aux synchrotrons et aux XFEL. La méthode est basée sur une compréhension du diagramme de phase des cristaux de protéines et sur la façon dont ces connaissances peuvent être utilisées. La méthode est divisée en trois étapes: (1) optimisation de la morphologie cristalline, (2) transition vers le lot et (3) mise à l’échelle. L’étape 1 consiste à trouver des monocristaux bien diffractants, espérons-le mais pas nécessairement, se présentant dans une morphologie cubique. Au stade 2, la condition de stade 1 est optimisée par le temps de croissance des cristaux. Cette stratégie peut transformer les cristaux cultivés par diffusion de vapeur en lots. Une fois que la croissance des cristaux peut se produire dans environ 24 heures, un morphogramme du mélange de protéines et de précipitants peut être tracé et utilisé comme base pour une stratégie de mise à l’échelle (étape 3). Lorsque les cristaux peuvent être cultivés par lots, il est possible de tenter de mettre à l’échelle et d’optimiser la taille et la concentration des cristaux à mesure que le volume augmente. L’endothiapepsine a été utilisée comme protéine de démonstration pour ce protocole. Certaines des décisions présentées sont spécifiques à l’endothiapepsine. Cependant, on espère que la façon dont ils ont été appliqués inspirera une façon de penser cette procédure que d’autres pourront adapter à leurs propres projets.

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Optimizing the Growth of Endothiapepsin Crystals for Serial Crystallography Experiments

Le but de cet article est de donner au spectateur une solide compréhension de la façon de transformer leur protocole de diffusion de vapeur de petit volume, pour la croissance de gros cristaux de protéines uniques, en une méthode de micro-cristallisation par lots de grands volumes pour la cristallographie en série.

Optimisation de la croissance des cristaux d’endothiapepsine pour les expériences de cristallographie en série

Here, a protocol is presented to facilitate the creation of large volumes (&#62; 100 &#181;L) of micro-crystalline slurries suitable for serial ...

Les expériences de cristallographie en série peuvent être difficiles. Un obstacle clé dans leur pratique est la création d’échantillons microcristallins. Ce protocole montre comment de tels échantillons peuvent être créés de manière fiable.Cette méthode utilise l’endothiapepsine pour donner un cadre d’optimisation des gros cristaux cultivés dans des plaques de diffusion de vapeur de petit volume en boues microcristallines de grand volume. Nous ne pouvons pas prétendre que ce protocole connaîtra un succès universel. Cependant, nous espérons que les idées et les méthodes proposées ici donneront à d’autres un cadre expérimental à utiliser sur d’autres protéines.Pour commencer, préparez une plaque de 96 puits à deux gouttes avec le tampon de cristallisation à l’aide du robot Formulatrix. À l’aide d’un mélange robotisé de manipulation de liquides, mélanger 150 nanolitres d’endothiapepsine fraîchement décongelée avec 150 nanolitres de tampon de cristallisation dans chaque puits. Scellez la plaque et laissez les cristaux croître pendant 24 heures à l’intérieur de l’hôtel Formulatrix.Après 24 heures, briser et retirer les cristaux de cinq puits de la plaque de cristallisation de 96 puits. Placez-les dans 250 microlitres du tampon de cristallisation dans un tube centrifuge de 1,5 millilitre placé dans un seau à glace. Ajouter 10 à 15 billes de verre d’un millimètre dans le tube à centrifuger.Tourbillonnez les cristaux et les perles à 1000 tr / min pendant 30 secondes et replacez-les sur la glace pendant 30 secondes. Les graines peuvent ensuite être utilisées immédiatement ou stockées à moins 20 degrés Celsius. Pour effectuer une expérience de morphogramme, ajouter cinq à 40% de concentrations de PEG 6000 avec une molaire Tris-HCl à pH sept et 0,15 molaire de chlorure de magnésium le long des colonnes de plaque d’un criblage quadrillé à 96 puits à deux gouttes Réparer une dilution séquentielle de l’endothiapepsine dans 0,1 molaire d’acétate de sodium de 100 à 12,5 milligrammes par millilitre en huit étapes.Ensuite, pipeter huit microlitres de chaque dilution suivis de deux microlitres de stock de graines dans la plaque du robot de manipulation de liquide. À l’aide d’un robot de manipulation de liquides, distribuer 150 nanolitres de chaque dilution d’endothiapepsine dans les sous-puits un et deux du crible. Multi-aspirer 50 nanolitres de stock de graines décongelées et 100 nanolitres de la solution de puits du sous-puits deux et distribuer les deux dans la solution protéique.Mélanger les solutions trois fois après l’ajout du tampon de cristallisation ou du tampon de cristallisation et du mélange de graines. Maintenant, scellez la plaque et l’image à zéro, trois, six, 12, 18 et 24 heures du premier jour tous les jours pendant la première semaine et chaque semaine pendant les quatre semaines suivantes à 20 degrés Celsius. Après 24 heures, regardez la plaque au microscope, estimez le nombre de cristaux dans chaque puits et mesurez un échantillon des cristaux.Notez ces estimations dans la feuille de travail du générateur de morphogramme fournie. Entrez les concentrations initiales d’endothiapepsine et de PEG 6000 dans les cases appropriées. La feuille de calcul tracera automatiquement les résultats dans le format traditionnel du diagramme de phase avec les concentrations de précipitant et de protéines sur les axes X et Y respectivement.Les conditions de puits qui ne donnent lieu qu’à des cristaux dans leurs gouttes ensemencées indiquent la région métastable du diagramme, tandis que les conditions avec des cristaux dans les gouttes ensemencées et non ensemencées indiquent la zone de nucléation. À partir de l’analyse morphogramme, sélectionnez la condition la plus prometteuse pour la mise à l’échelle en plaques de 24 puits. Ensuite, commencez avec 100 milligrammes par millilitre d’endothiapepsine et 35% PEG 6000.Préparer cinq millilitres de tampon de cristallisation avec 35% PEG 6000, 0,1 molaire Tris-HCl avec pH sept et 0,15 molaire de chlorure de magnésium. Placez maintenant 0,5 millilitre du tampon de cristallisation dans trois puits d’une plaque de goutte suspendue graissée de 24 puits. Mélanger 15 microlitres d’endothiapepsine avec 15 microlitres de solution de cristallisation sur un couvercle en verre.Placez la solution sur les puits et laissez la plaque pendant 24 heures. Après 24 heures, regardez la plaque au microscope, estimez le nombre de cristaux dans la goutte et mesurez leur taille. Si les cristaux sont incorrects, répétez cette étape, mais modifiez la concentration en protéines ou ajoutez des graines si la nucléation cristalline n’est pas assez élevée.Répétez l’expérience de mise à l’échelle de 24 puits en ajoutant des graines à une concentration plus élevée de PEG 6000. Placez 0,5 millilitre du nouveau tampon de cristallisation dans trois puits d’une plaque de goutte suspendue graissée de 24 puits. Placez 15 microlitres d’endothiapepsine sur un couvercle en verre et mélangez cinq microlitres de stock de graines et 10 microlitres de solution de cristallisation avec la solution d’endothiapepsine.Inversez les feuillets de couverture, placez-les au-dessus des puits et laissez-les reposer pendant 24 heures. Revérifiez les gouttes pour voir si les cristaux sont plus petits et ont une concentration plus élevée. Estimez le nombre de cristaux dans la goutte et mesurez à nouveau leur taille pour voir s’ils sont maintenant de la bonne taille.Pour effectuer un protocole de lot ensemencé, préparez le tampon de cristallisation de 40% PEG 6000, 0,1 molaire Tris-HCl avec un pH de sept et 0,15 molaire de chlorure de magnésium. Prémélangez 50 microlitres de stock de graines et 100 microlitres de solution de cristallisation, et mélangez avec une solution protéique dans le tube à centrifuger de 1,5 millilitre. Tourbillonnez le tube pendant 10 secondes et placez-le sur une bascule ou un shaker à 20 degrés Celsius.Prendre une partie aliquote de 2,5 microlitres de la solution discontinue toutes les 20 minutes. Surveillez la taille et le nombre de cristaux à l’aide d’un hémocytomètre. Comptez le nombre de cristaux et mesurez leur taille au microscope.Lorsque les cristaux ont atteint une dimension d’environ 15 microns, éteignez la réaction avec 150 microlitres d’acétate de sodium 0,5 molaire supplémenté avec 0,5 molaire de Tris-HCl, 0,075 molaire de chlorure de magnésium et 20% de PEG 6000. Vérifiez à nouveau la taille et la concentration des cristaux à l’aide de l’hémocytomètre. Conservez les cristaux à 20 degrés Celsius.L’analyse morphogramme de l’endothiapepsine a suggéré que la nucléation était influencée à la fois par les concentrations de protéines et de précipitants. Les régions MetaStable, de nucléation et de précipitation du diagramme peuvent être bien distinguées. L’ajout de graines a considérablement augmenté le nombre de cristaux par rapport aux gouttes sans graines.L’analyse de la microcristallisation de l’endothiapepsine dans des volumes de 200 à 300 microlitres a révélé les changements dans la nucléation des cristaux et la dimension la plus longue au fil du temps. L’augmentation de la concentration de PEG à 35% a nettement amélioré la cristallisation, avec une concentration finale de cristaux d’environ 3,6 fois 10 à six par millilitre, et la plus longue dimension cristalline de 42 micromètres. Pour réduire la taille des cristaux finaux, une approche de réduction de la concentration en protéines a été appliquée, ce qui a malheureusement réduit considérablement la concentration en cristaux et a finalement produit des cristaux encore plus gros.Cependant, l’approche consistant à augmenter la concentration de PEG à 40% a donné des cristaux environ 3,1 fois 10 à six par millilitre et une taille d’environ 39 micromètres. En outre, l’ajout de graines a entraîné une augmentation significative de la concentration en cristaux, environ 1,1 fois 10 à huit par millilitre et des dimensions plus petites d’environ 4,2 micromètres. L’effet de trempe tenté dans la réaction de cristallisation a donné une concentration cristalline finale d’environ 2,6 fois 10 à six par millilitre et une taille d’environ 15 micromètres.La moitié CC tracée par rapport à la résolution des données radiographiques a montré une légère diminution de la résolution des cristaux de 10 microlitres à 200 à 300 microlitres. Cependant, le cristal s’est toujours diffracté à 1,5 angstrum, ce qui a été jugé suffisant. L’endothiapepsine est une protéine indulgente avec laquelle travailler.Nous espérons qu’essayer ce protocole d’endothiapepsine générera des idées et des méthodes utiles pour d’autres protéines. En particulier avec la cristallographie, il est bénéfique de voir à quoi ressemblent les choses plutôt que d’essayer de suivre uniquement un protocole écrit. J’espère que cette vidéo vous donnera une partie de cette sensation.

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