Name: optimizing the growth of endothiapepsin crystals for serial crystallography experiments
Uploaded: 2021-02-04T12:30:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimizing the Growth of Endothiapepsin Crystals for Serial Crystallography Experiments at JoVE.com

פרויקט זה קיבל מימון מתוכנית המחקר והחדשנות Horizon 2020 של האיחוד האירופי במסגרת הסכם המענק מס' 701647 ע"ש מארי סקלודובסקה-קירי. תודה רבה על הסיוע והתמיכה של מדעני אלומות ב- Swiss Light Source beamline X10SA-PXII.

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

השיטה שהוצגה מראה כיצד לייעל את ההתגבשות של אנדותיאפפסין מגבישים גדולים (≥ 100 מיקרומטר הממד הארוך ביותר), הגדלים במסכים דלילים של 96 בארות, למיקרו-גבישים, הגדלים בצינורות צנטריפוגות (נפח 300 מיקרוליטר) באמצעות אצווה. הרעיון מאחורי הפרוטוקול הוא כי הצעדים שננקטו כדי לייעל endothiapepsin יכול לשמש גם עבור חלבונים אחרים. בסופו של דבר, מענה לבעיה של יצירת נפחים גדולים (>100 μL) של מיקרו-גבישים (10-20 מיקרומטר) עבור ניסויי קריסטלוגרפיה סדרתיים ב-XFELs ובסינכרוטרונים.
הפרוטוקול מחלק את המשימה של מיקרו-התגבשות בנפח גדול לשלושה שלבים: (1) אופטימיזציה של מורפולוגיה גבישית, (2) מעבר לאצווה, ו-(3) קנה מידה. בשלב 1, יש לבחון את טווח צורות הגביש שחלבון יכול ליצור בלוחות דיפוזיה של אדים. תנאים היוצרים גבישים בודדים, דמויי קופסה, המתפצלים לרזולוציה הנדרשת צריכים להיות המטרה. בשלב 2, התנאים שנבחרו יכולים להפוך מדיפוזיית אדים לאצווה. כאן, קריטריון האופטימיזציה הוא זמן גדילת הגביש ומציאת תנאים היוצרים גבישי חלבון תוך 24 שעות. ניתן גם לשרטט מורפוגרמה הנותנת לנסיין מושג על מיקום קו המסיסות וגבולות אזור הגרעין. מורפוגרמה זו מועילה מאוד בשלב 3, קנה מידה. המורפוגרמה תיתן אינדיקציה האם נוקלציה לבדה יכולה להגדיל את Xn ולהוריד את Xs. ככל שנפח הניסוי גדל, ניתן להעריך ללא הרף את Xn ו- Xs כקריטריון המפתח להצלחה בקנה מידה.
במקרה של אנדותיאפפסין, שלב 1 חשף את מה שעשוי להיות מורפולוגיה גבישית שלא הייתה ידועה קודם לכן עבור אנדותיאפפסין. למורפולוגיה זו הייתה אותה קבוצת מרחב כמו אלה שדווחו קודם לכן, אך חשוב עבור קריסטלוגרפיה סדרתית, צורה דמוית קופסה יותר. נראה שגם גבישים בודדים צומחים מנקודות גרעין בודדות, בניגוד למניפות שנוצרו מתנאים אחרים (איור 4). עבור המצב שנבחר, שלב 2 כבר היה מרוצה חלקית כאשר צמיחת הגביש התרחשה < 24 שעות. המורפוגרמה הצביעה על כך שגם פרוטוקול ישר וגם פרוטוקול אצוות זרעים עשוי להצליח בעת שינוי קנה מידה בשלב 3. קנה מידה ראשוני באצווה ישרה, יצר מצב שיצר גבישים בטווחX n ו- X s של 3.6 ± 1.2 x 106 גבישים ·mL-1 ו- 42 ± 4.1 מיקרומטר, בהתאמה. גבישים אלה, למרות שהיו מקובלים בכמה ניסויים בקריסטלוגרפיה סדרתית, נחשבו גדולים מדי. אז בוצעו אופטימיזציות נוספות. הפרוטוקול הסופי ייצר גבישים בעלי טווח ריכוז וגודל של 3.1 x 106 גבישים ·mL-1 ו- 15 ± 3.9 מיקרומטר, בהתאמה. זה היה יותר מאידיאלי עבור הניסויים המתוכננים.
השיטה מתמקדת בטרנספורמציה של גבישי חלבון "מסיסים" הגדלים בלוחות דיפוזיה של אדים לאצווה. הסיבה להתמקדות זו היא שהרוב המכריע של גבישי החלבונים המסיסים גדלים באמצעות דיפוזיה של אדים26. עם זאת, המושגים שהוצגו יכולים להיות מיושמים גם על גבישי חלבון מסיסים שגודלו בשיטות אחרות, כגון מיקרו-אצווה. המושגים עשויים להיות ישימים גם לגבישי חלבון ממברנות הגדלים ב- LCP; מכיוון שגם זה תהליך התגבשות אצווה.
היבט מרכזי של הפרוטוקול הוא תהליך שינוי התנאים של גבישים הגדלים בלוחות דיפוזיה של אדים כך שניתן יהיה לגדל אותם באצווה. עבור טרנספורמציה זו, השיטה משתמשת בקריטריון המוצע על ידי Beale et al. (2019)26. גבישים הגדלים בתהליך אצווה, אפילו בלוחות דיפוזיה של אדים, ייווצרו במהירות (< 24 שעות). קריטריון זה הוא קירוב המבוסס על מהירות שיווי משקל נפילת דיפוזיה של אדים, והוא נכון ביותר עבור תנאי משקעים מבוססי PEG. עם זאת, תנאי התגבשות יכילו מגוון רחב של תרכובות שישפיעו על זמן שיווי המשקל. שיווי המשקל של תנאי התגבשות מבוססי מלח, למשל אמוניום כלורי מרוכז מאוד, יכול להתרחש תוך 1-2 ימים. לכן, קריטריון 24 שעות עשוי שלא להיות נכון עבור תנאים מבוססי מלח. תנאים מבוססי מלח יכולים גם להכיל דיאגרמות פאזה מורכבות יותר26,30 שעשויות שלא להתאים לארכיטיפ המוצג בפרוטוקול זה. הפחתה בקריטריון הזמן לתנאים מבוססי מלח ל -12 או 6 שעות עשויה להיות נחוצה אם קנה מידה לנפחים גדולים יותר יתברר כבלתי אפשרי.
מגבלה נוספת של שיטה זו היא המורכבות לכאורה שלה. הפרוטוקול שבוצע כדי לייעל את המיקרו-התגבשות של אנדותיאפפסין שינה למעשה את המצב המקורי ממסך המטריצה הדלילה יחסית מעט. הפגיעה הראשונה שנצפתה במסך PACT הייתה 0.1 HEPES pH 7.0, 0.2 M MgCl2 ו-20% (w/v) PEG 6,000. חיץ ההתגבשות הסופי היה 0.1 Tris-HCl pH 7.0, 0.15 M MgCl2 ו-40% (w/v) PEG 6,000. ייתכן מאוד גם שהשינוי בחיץ מ-HEPES ל-Tris-HCl, ובריכוז MgCl2 , תרמו מעט להצלחת התהליך. השארת העלייה בריכוז PEG 6,000 היא האופטימיזציה היחידה, וכזו שניתן היה להשיג בפשטות.
אולם גם הערכה זו פשטנית מדי. זה לא רק מזלזל בבעיות שנתקלו בהן במהלך קנה המידה (כלומר, השימוש בזרעים ומרווה), אלא גם את העובדה שרק בגלל שהחלבון הזה הוכח כפשוט, אין ערובה שגם הבא אחריו יוכיח את עצמו. הצעדים המומלצים בפרוטוקול, תוכננו מכיוון שאופטימיזציה של קנה המידה של נפחי התגבשות החלבונים יכולה להיות יקרה מאוד לחלבון. במהלך שבעת הניסויים בקנה מידה של אנדותיאפפסין שהוצגו, נצרכו 100 מ"ג חלבון. אמנם, חלק מהצעדים הללו בוצעו כדי להראות את השלכותיהם לאור פרוטוקול זה. אף על פי כן, 100 מ"ג חלבון, בתוספת 50 מ"ג נוספים לחלבון הנצרך במהלך ניסוי (טבלה 1), יכולים להיות השקעה משמעותית בזמן או בכסף.
למרבה המזל, לא ברור שהמסה הזו של הדגימה הנדרשת נמצאת בכל החלבונים. אנדותיאפפסין היה מסיס מאוד, ולכן דרש ריכוז חלבון גדול כדי להגיע לרוויה. באחרים (כרגע תחת אופטימיזציה), supersaturation ניתן להגיע ב 10 או אפילו 5 מ"ג / מ"ל. משתנים כאלה הם ספציפיים לחלבון ויש לאמץ אותם כאשר הם מופיעים.
מגבלות אחרות של השיטה כוללות את הסתמכותה על ציוד מורכב כגון רובוטים לטיפול בנוזלים ליצירת מסך וצלחות, ומכשירי הדמיה לצילום אוטומטי של לוחות בעת הצורך. שגרות חלופיות הוצעו כדי להגביל את הצורך בחלק מפריטי ציוד אלה, אך הפרוטוקול ייקח זמן רב יותר לעקוב בלעדיהם. הפרוטוקול מציע גם לבדוק את העקיפה של גבישים אופטימליים. עבור קריסטלוגרפים ללא גישה סדירה לסינכרוטרון, בדיקות אלה עשויות להיות מאתגרות. ייתכן שלא יהיה צורך בבקרות בכל שלב, אך בדיקות אלה מומלצות בחום לאחר זיהוי הפגיעה, ולפני ואחרי קנה המידה. גבישים לא עקיפים ב-XFEL הם, למרבה הצער, לא תופעה נדירה. בהתחשב בכך, עדיף לטעות בצד הזהירות לגבי הנחות לגבי עקיפה גבישית.
בסופו של דבר, פרוטוקול זה והתוצאות המוצגות כאן יציעו מדריך, רעיונות ודוגמה לאלה המתקשים בהפקת דגימות לניסויי קריסטלוגרפיה סדרתיים. יש לקוות שככל שהקריסטלוגרפיה הסדרתית תתפתח יותר, דרישות הדגימה של הטכניקה יצטמצמו כך שהצורך בפרוטוקולים כאלה יצטמצם. עם זאת, גם במקרה זה, האסטרטגיות המוצגות כאן עדיין יהיו שימושיות למי שרוצה לחקור את מרחב ההתגבשות של החלבון שלהם.

קריסטלוגרפיה מקרומולקולרית בטמפרטורת החדר (RT) פופולרית שוב בקרב קהילת הביולוגיה המבנית. הפיתוח של מקורות אור לייזר אלקטרונים חופשיים מקרני רנטגן (XFEL) דרבן את הפיתוח של גישות העברת דגימות RT 1,2,3,4, ושיטות אלה יושמו כעת על סינכרוטרונים 5,6,7,8. לא רק ששיטות RT פותחות את האפשרות של תחבולות ניסוימשאבה 9,10,11,12, אלא שיש גם ראיות מצטברות לכך שהן מקדמות מצבי קונפורמציה חלופיים בתוך חלבונים 13,14,15,16,17.
עם זאת, הסיבה העיקרית לכך ששיטות ההקפאה צברו תאוצה על פני גישות RT בסוף שנות התשעים הייתה האטת נזקי הקרינה על ידי טמפרטורות גבישים מתחת לאפס18. שיטותCryo-19 החלו לאפשר איסוף של מערך נתונים שלם מגביש חלבון יחיד. שיטות RT מודרניות ב-XFELs ובסינכרוטרונים פתרו את בעיית נזקי הקרינה החד-גבישית על ידי פיתוח אסטרטגיות העברת גבישים מהירות (> 100 הרץ) 1,2,3,4. שיטות אלה מאפשרות איסוף מערך נתונים שלם מאלפי גבישים שנחשפו בנפרד. גישות העברת RT אלה דורשות אפוא ייצור כמויות גדולות של תמיסות המכילות מיקרו-גבישים הומוגניים (> 100 מיקרוליטר של גבישי < 50 מיקרומטר). עם זאת, מאחר ששיטות הקפאה נוטות לדרוש גבישים בודדים בלבד, שיטות ליצירת תרחיפים מיקרו-גבישיים כאלה אינן נפוצות כיום במעבדות קריסטלוגרפיה של חלבונים.
ישנן דוגמאות בספרות כיצד לבצע חלקים מהליך אופטימיזציה של מיקרו-התגבשות עבור דגימות קריסטלוגרפיה סדרתיות. כאן, יש להבחין בין ממברנה לבין חלבונים מסיסים. פרוטוקולים לאופטימיזציה של הצמיחה של גבישי חלבון מיקרו-ממברניים הגדלים במונולאין (או שומנים אחרים), עבור שלב מעוקב ליפידי (LCP), תוארו היטב20,21,22. עם זאת, שיטות למיקרו-התגבשות של חלבונים מסיסים, כולל חלבוני ממברנה הגדלים בתנאים שאינם LCP, חסרות בדרך כלל. מחקרים קודמים התמקדו בחלקים ספציפיים של התהליך, כגון סינון מיקרו-גבישי 23,24, שיפור נוקלציה 24, וקנה מידה באמצעות דיפוזיה של ממשק חופשי 25, אך לא שיטה שלמה.
עם זאת, לאחרונה תוארה שיטה26 המנסה להציע פרוטוקול מלא. כמו היבטים רבים של קריסטלוגרפיה של חלבונים, היא אינה חדשה. רבים מהרעיונות המוצעים תוארו כבר על ידי Rayment (2002)27. השיטה נועדה להראות לקריסטלוגרפים כיצד לבצע את ההמרה מגביש יחיד שגדל באמצעות דיפוזיה של אדים, למתודולוגיית אצווה לגידול אלפי מיקרו-גבישים. השיטה מתמקדת בדיפוזיית אדים כנקודת מוצא משותפת, שכן 95% מכל שקיעי בנק נתוני החלבונים (PDB) מגיעים מגבישים הגדלים בלוחות דיפוזיהשל אדים 26. עם זאת, דיפוזיית אדים אינה השיטה האידיאלית למיקרו-התגבשות26, ולכן מתוארת מתודולוגיה להמרת דיפוזיית אדים להתגבשות אצווה. ברגע שניתן לגדל גבישים באצווה, נתיבי קנה מידה לנפחים גדולים יותר הופכים מעשיים יותר. בהתחשב בגחמות של התגבשות חלבונים, המחברים ידגישו כי שיטה זו אינה חסינה מפני תקלות. עם זאת, הפרוטוקול צריך, לכל הפחות, לספק תובנה לגבי "מרחב ההתגבשות" של חלבון.
שיטה זו מסתמכת על דיאגרמת שלב התגבשות החלבונים וכיצד הבנה של דיאגרמה זו יכולה לשמש כמדריך במהלך אופטימיזציה של מיקרו-קריסטליזציה. דיאגרמת פאזת חלבון מתוארת בדרך כלל כתרשים x/y עם ריכוזי משקעים וחלבונים על צירי x ו-y, בהתאמה (איור 1A). מנקודת המים הטהורים (בפינה השמאלית התחתונה - איור 1A), ריכוז החלבון והמשקע עולה עד שמגיעים לקו המסיסות. קו המסיסות מסמן את נקודת רוויית העל (קו סגול - איור 1A). כאשר חלבון הוא סופר-רווי, התמיסה הופכת לבלתי יציבה מבחינה תרמודינמית ותתחיל להיפרד לשני שלבים: "עשיר בחלבון" ותמיסה רוויה יציבה. הפרדה זו יכולה להתרחש בכל מקום מעבר לקו המסיסות והקינטיקה שלה תלויה בתכונות החלבון ובמרכיבי התמיסה.
כאשר ריכוזי החלבון והמשקעים גדולים מדי, החלבון יתפרק בצורה לא יציבה מחוץ לתמיסה והתוצאה תהיה משקע אמורפי (האזור הוורוד - איור 1A). אולם הפרדת פאזה מסודרת יכולה להתרחש באזור הנוקלציה [ראו Garcia-Ruiz (2003)28 לתיאור מפורט] ולנוקלינטים גבישיים יש נטייה להיווצר (אזור ירוק - איור 1A). גרעין וגדילה מסירים חלבון מהתמיסה ומעבירים את הטיפה לאזור המטא-יציב שבו הצמיחה יכולה להימשך עד שמגיעים לקו המסיסות [ראו McPherson and Kuznetsov (2014)29 לדיון מפורט]. התרשים הוא, ברוב המכריע של תנאי ההתגבשות, פישוט יתר גס30. עם זאת, ללא קשר לכך, הדיאגרמה עדיין שימושית מאוד עבור מיקרו-קריסטלוגרפים מכיוון שהמיפוי של הדיאגרמה מאפשר לקבוע את קו המסיסות ואת הקינטיקה של הנוקלאציה.
במונחים של יצירת מיקרו-גבישים, שני הגורמים במהלך ההתגבשות שצריכים להיות אופטימליים הם מספר הגבישים (Xn) והממד הממוצע והארוך ביותר שלהם (Xs). X n יהיה פרופורציונלי למספר אירועי הגרעין (n ) (Eq. 1).
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61896/61896fig01v2.jpg">     Eq. 1
X s פרופורציונלי לריכוז החלבון החופשי מעל קו המסיסות (Ps) חלקי Xn (Eq. 2).
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61896/61896eq02.jpg">     פרק 2
במצב מושלם, כל אירוע גרעין יניב גביש אפשרי ולכל אחד מהגבישים הללו, תהיה גישה שווה לחלבון הזמין בתמיסה. איור 2 הוא ייצוג גרפי מתרחיש אידיאלי של הקשר בין Xn ו-Xs. מעשית, השליטה העיקרית שיש לקריסטלוגרף על Xn ו-Xs היא על ידי השפעה על כמות הגרעין או על ידי הוספת גבישי זרעים. על המיקרו-קריסטלוגרף לשפוט כיצד להגדיל את Xn כך שניתן יהיה ליצור ריכוז גבישי מתאים וגודל גבישי מתאים.
רוב טכניקות ההתגבשות דורשות "תקופת מעבר" (איור 1B). לדוגמה, בניסוי דיפוזיה של אדים, בעת ערבוב החלבונים והתמיסות המזרזות, הריכוזים של כל אחד מהם ישתנו ככל שהטיפה תשתווה לתמיסת הבאר. יש לקוות ששינויים אלה יעבירו בהדרגה את הטיפה לאזור הגרעין שבו תגבר הנטייה להתגבשות. כאשר גבישים מתחילים להתגרעין ולגדול, כמות החלבון בתמיסה תתחיל לרדת, מה שמקטין את ההסתברות לגרעין נוסף. הכמות הסופית של הנוקלציה תהיה ספציפית לחלבון ולמצב, וגם תלויה בעומק החדירה של אזור הגרעין. בהינתן החדירה המוגבלת לאזור הנוקלציה של שיטות הדורשות שלב מעבר, רמת הנוקלציה תוגבל בסופו של דבר לקצב הנוקלציה בגבול אזור הנוקלציה המטא-יציבה.
בשל החשיבות של היכולת לשפר את רמת הנוקלציה עבור מיקרו-קריסטלוגרף, חשוב לעבור למתודולוגיית התגבשות אצווה. אצווה יכולה לנצל טוב יותר את כל אזור הנוקלציה (איור 1C). בשיטות אצווה, הרעיון הוא לערבב את החלבון והמשקע יחד כך שתיווצר תמיסה סופר-רוויה ללא צורך בשינויים בריכוזי הרכיבים. נוקלציה צריכה להיות אפשרית מיד עם הערבוב. שיטות אצווה מאפשרות אפוא להגיע באופן תיאורטי לכל אזור הנוקלציה. לאחר מכן ניתן לנצל כל עלייה בקינטיקה של נוקלציה מעבר לגבול המטא-נוקלציה.
אם הרמה הבסיסית של נוקלציית הגביש אינה מספיקה כדי ליצור Xn גדול, ניתן להשתמש בשיטות זריעה זעירות. במיקרו-זריעה, גבישים שגדלו מראש מפורקים כדי ליצור תרחיף של שברים גבישיים שיכולים לשמש כפיגום לצמיחת גבישים טריים31,32. מיקרו-זריעה נמצאת בשימוש נרחב בהכנת דגימות קריסטלוגרפיות סדרתיות כדרך להגדיל את Xn ללא צורך בהגדלת הגרעין הגבישי (איור 1C).
ניתן להמחיש את המעבר מדיפוזיית אדים לאצווה בדיאגרמת פאזה כהעברת נקודת ההתחלה של הניסוי מהאזורים הלא רוויים או המטא-יציבים לאזור הנוקלציה. ניתן לעשות זאת על-ידי הגדלת ריכוזי החלבונים ו/או המשקעים, ו/או היחס בין השניים בתוך הטיפה (איור 1D), והתבוננות באילו תנאים נוצרים גבישים המופיעים במהירות (< 24 שעות)26. שיווי משקל מלא של נפילת אדים יכול להימשך ימים או שבועות33. לכן, על ידי חיפוש תנאים המראים גבישים המופיעים במהירות, ניתן למצוא תנאי אצווה ללא צורך לעבור לתבניות סינון התגבשות חלופיות כגון מיקרו-אצווה 34,35,36,37.
לאחר מציאת אזור הגרעין, נמצא מצב אצווה וניתן ליצור מורפוגרמה - כאן, דיאגרמת פאזה גסה. המורפוגרמה מועילה מאוד כאשר שוקלים אם להשתמש בפרוטוקול אצווה של זרעים או אצווה ישרה. על ידי שרטוט ה-Xn כפונקציה של החלבון וריכוז המשקעים, ניתן לבצע הערכה של קינטיקה של הנוקלציה26. אם X n נשאר נמוך בכל אזור הנוקלציה, ייתכן שיהיה צורך באצוות זרעים כדי להפוך את Xn לגדול מספיק כדי להגביל את צמיחת הגביש. הערכה זו היא הצעד הראשון בתהליך קנה המידה לנפחים גדולים יותר (> 100 μL).
שיטה זו תוכננה כך שניתן יהיה לבצע אותה ברוב מעבדות ההתגבשות באמצעות ציוד סטנדרטי להתגבשות דיפוזיה של אדים. מחקרים רבים נערכו גם המתארים טכניקות כדי להקל על חלקים רבים של תהליך זה, אם הציוד יהיה זמין. אלה כוללים, אך אינם מוגבלים לפיזור אור דינמי (DLS) 25,27, הדמיה לא ליניארית 20,24,25, עקיפה אבקה 20,24,27 ומיקרוסקופ אלקטרונים 26 [ראו Cheng et al. (2020)40 לסקירה נחמדה].
מטרת עבודה זו היא לספק הדגמה חזותית של השיטה למעבר מהתגבשות דיפוזיה של אדים בנפח קטן (< 500 nL) להתגבשות אצווה בנפח גדול (> 100 μL). Endothiapepsin מ Cryphonectria parasitica שימש כמערכת לדוגמה להדגמת תרגום זה. סוג הניסוי ושיטת מסירת הדגימות שהמיקרו-גבישים נדרשים להם ישפיעו על פלט Xs האידיאלי26. עבור ניסויי ערבוב הדורשים רזולוציית זמן של אלפית שנייה41 או חרירי גז וירטואלייםדינמיים 42, Xs סופי של < 5 מיקרומטר עשוי להיות רצוי. במקרה זה, המטרה הייתה לייצר גבישי חלבון המתפצלים לכ-1.5 Å, לצורך ניסוי משאבה-גשושית המופעלת באמצעות פוטון, ושימוש בגישת העברת מטרה קבועה.
כדי להמחיש את דרישות הדגימה של ניסוי קריסטלוגרפיה סדרתי כזה באמצעות אנדותיאפפסין, טבלה 1 מציגה את הפרמטרים הניסיוניים של ניסוי היפותטי. המידע לדוגמה התבסס על הפרוטוקול המתואר להלן. בהתחשב בכמה הערכות שמרניות לגבי שיעורי פגיעה ודרישות איסוף נתונים, 50 מ"ג הוא אומדן צריכת המדגם הכולל של הניסוי כולו.
איור 3 מציג תרשים זרימה של תהליך האופטימיזציה המלא מהתגבשות ראשונית של דיפוזיית אדים בנפח קטן ועד אצווה בקנה מידה גדול. עבור רוב פרויקטי הקריסטלוגרפיה הסדרתית, פרוטוקול זה יתחיל בשלב 2: "מעבר לאצווה", מכיוון שחלבון המטרה כבר התגבש. עם זאת, שלב 1 נכלל כדי להשלים ולהזכיר לקוראים את חשיבותו. מציאת מצב המוליד גביש יחיד וגדול המתפצל היטב היא נקודת ההתחלה הטובה ביותר לאופטימיזציה של מיקרו-גבישים. בשלב 2, ניתן למטב מצב זה מדיפוזיית אדים לאצווה, וניתן לשרטט מורפוגרמה של אזורי הנוקלציה והמטא-יציבות. לאחר ביצוע פעולה זו, ניתן לשנות את קנה המידה של מצב האצווה לנפחים גדולים יותר בשלב 3. עד סוף תרשים הזרימה, קריסטלוגרף ייצור פרוטוקול חוזר בנפח גדול (> 100 μL), מיקרו-התגבשות, פרוטוקול אצווה עבור אנדותיאפפסין. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על חלבון מסוים של עניין.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Swissci 96-well 2-Drop plates</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD11-002</td>
			<td>96-well 2-drop crystallisation plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swissci 96-well 3-Drop plates</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD11-003</td>
			<td>96-well 3-drop crystallisation plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mosquito LCP liquid handling robot</td>
			<td>sptlabtech</td>
			<td>mosquito LCP</td>
			<td>Crystallisation robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClearVue Sheets</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD6-015</td>
			<td>96-well crystallization plate seals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Tube 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td>1.5 mL centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scaple</td>
			<td>Swan and Morton</td>
			<td>No. 3 scalple and No. 3 handle</td>
			<td>Scalple for cutting open plate seals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS 3 Vortex</td>
			<td>IKA</td>
			<td>3319000</td>
			<td>Vortex for mixing solution and making seed stocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well XRL Plate</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD3-11</td>
			<td>24-well hanging-drop plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube revolver/rotator</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>88881001</td>
			<td>Tube revolver for mixing solution during scaling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Research plus pipettes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>Range of manual pipettes, 0.5-10, 1-20, 10-100, 100-1000 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf pipette tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>Range of tip sizes for manual pipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suparen 600</td>
			<td>Prochem AG</td>
			<td>Suparen 600</td>
			<td>Endothiapepsin solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>241245-1KG</td>
			<td>Sodium Acetate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8382T014</td>
			<td>Tris</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670-1kg</td>
			<td>Magnesium Chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG 6,000</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>81255-1kg</td>
			<td>PEG 6,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethelyene glycol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>324558-1L</td>
			<td>Ethelyene glycol for cyro-protecting the crystals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PACT Premier HT screen</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD1-36</td>
			<td>PACT Premier 96-well crystal screen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOW CORNING high vacuum grease</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD6-02</td>
			<td>Grease for sealing 24-well plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hirschmann 22 x 22 mm glaser cover slides</td>
			<td>Hirschmann</td>
			<td>8000104</td>
			<td>Cover slides for sealing 24-well sitting drop plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal pins</td>
			<td>PSI</td>
			<td>Manufactured inhouse</td>
			<td>Thin-film supports for micro-crystals.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-1.3 mm SiLibeads Type S</td>
			<td>Faust</td>
			<td>6239547</td>
			<td>Glass beads for making mico-seed stocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macbook Pro</td>
			<td>Apple</td>
			<td>Macbook Pro</td>
			<td>Computer for performing data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCP4 software suite</td>
			<td>CCP4</td>
			<td></td>
			<td>Diffraction pattern data processing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>Microsoft Office</td>
			<td>Plotting tool for phase diagram</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hausser Scientific Bright-Line counting chamber</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>02-671-51B</td>
			<td>Tool to calculate crystal concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PACT Premier</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD1-29-ECO</td>
			<td>Sparse-matrix crystallization screen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rock Imager</td>
			<td>Formulatrix</td>
			<td>Rock Imager</td>
			<td>Temperature controlled crystal plate storage and imager</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rock MakerWeb</td>
			<td>Formulatrix</td>
			<td>Rock MakerWeb</td>
			<td>Crystal plate creation and image storage stoftware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formulator</td>
			<td>Formulatrix</td>
			<td>Formulator</td>
			<td>96-well crystal screen creation liquid handling robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica MZ16 Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica MZ16</td>
			<td>Light microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS V4.6</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LAS V4.6</td>
			<td>Software for Leica microscopes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectra/Por 3.5 kDa dialysis tubing</td>
			<td>Spectrumlabs</td>
			<td>Spectra/Por 3 Dialysis Membrane</td>
			<td>3.5 kDa dialysis membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing closures</td>
			<td>Spectrumlabs</td>
			<td>Spectra/Por 3 Duniversal Closures</td>
			<td>Clips to seal the dialysis tubing ends</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon 10 kDa centrifugal concentrator</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>Amicon Ultra-15 10 kDa centrifugal concentrator</td>
			<td>10 kDa centrifugal filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5810 R swing bucket centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810 R Centrifuge</td>
			<td>Swing bucket centrifuge</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimizing the growth of endothiapepsin crystals for serial crystallography experiments

כאן, פרוטוקול מוצג כדי להקל על יצירת כמויות גדולות (> 100 μL) של slurries מיקרו-גבישי מתאים לניסויים קריסטלוגרפיה סדרתית הן בסינכרוטרונים והן ב- XFELs. השיטה מבוססת על הבנה של דיאגרמת הפאזה הגבישית החלבונית, וכיצד ניתן לנצל ידע זה. השיטה מחולקת לשלושה שלבים: (1) אופטימיזציה של מורפולוגיה גבישית, (2) מעבר לאצווה, ו-(3) קנה מידה. שלב 1 כולל מציאת גבישים בודדים מתפצלים היטב, בתקווה אך לא בהכרח, המוצגים במורפולוגיה דמוית קובייה. בשלב 2, מצב שלב 1 ממוטב על ידי זמן גדילת גביש. אסטרטגיה זו יכולה להפוך גבישים הגדלים על ידי דיפוזיה אדים לאצווה. ברגע שצמיחת הגביש יכולה להתרחש תוך כ-24 שעות, ניתן לשרטט מורפוגרמה של תערובת החלבונים והמשקעים ולהשתמש בה כבסיס לאסטרטגיית קנה מידה (שלב 3). כאשר ניתן לגדל גבישים באצווה, ניתן לנסות שינוי קנה מידה, ולמטב את גודל הגביש וריכוזו ככל שהנפח גדל. אנדותיאפפסין שימש כחלבון הדגמה לפרוטוקול זה. חלק מההחלטות המוצגות הן ספציפיות לאנדותיאפפסין. עם זאת, יש לקוות כי הדרך שבה הם יושמו יעורר דרך לחשוב על הליך זה כי אחרים יכולים להסתגל לפרויקטים שלהם.

Watch this Scientific Journal Video about Optimizing the Growth of Endothiapepsin Crystals for Serial Crystallography Experiments at JoVE.com

Optimizing the Growth of Endothiapepsin Crystals for Serial Crystallography Experiments

מטרת מאמר זה היא לתת לצופה הבנה מוצקה כיצד להפוך את פרוטוקול פיזור האדים הקטן שלהם, לגידול גבישי חלבון גדולים ובודדים, לשיטת מיקרו-קריסטליזציה של אצווה בנפח גדול לקריסטלוגרפיה סדרתית.

אופטימיזציה של הצמיחה של גבישי אנדותיאפפסין לניסויי קריסטלוגרפיה סדרתיים

Here, a protocol is presented to facilitate the creation of large volumes (&#62; 100 &#181;L) of micro-crystalline slurries suitable for serial ...

ניסויי קריסטלוגרפיה סדרתיים יכולים להיות מאתגרים. משוכה מרכזית בפרקטיקה שלהם היא יצירת דגימות מיקרוקריסטליניות. פרוטוקול זה מראה כיצד ניתן ליצור דגימות כאלה באופן אמין.שיטה זו משתמשת באנדותיאפפסין כדי לתת מסגרת לאופטימיזציה של גבישים גדולים הגדלים בלוחות דיפוזיה של אדים בנפח קטן לתרחיפים מיקרוקריסטלינים בנפח גדול. איננו יכולים לטעון שפרוטוקול זה יצליח באופן אוניברסלי. עם זאת, אנו מקווים שהרעיונות והשיטות המוצעים כאן יעניקו לאחרים מסגרת ניסויית להשתמש בה על חלבונים אחרים.כדי להתחיל, להכין צלחת שתי טיפות 96 באר עם חיץ התגבשות באמצעות הרובוט Formulatrix. באמצעות תערובת רובוטים לטיפול בנוזל, ערבבו 150 ננוליטר של אנדותיאפפסין שזה עתה הופשר עם 150 ננוליטר של חיץ ההתגבשות בכל באר. אטמו את הצלחת ואפשרו לגבישים לגדול במשך 24 שעות בתוך מלון פורמולטריקס.לאחר 24 שעות, לפרק ולהסיר את הגבישים מחמש בארות של צלחת התגבשות 96 בארות. הניחו אותם ב-250 מיקרוליטר של חיץ ההתגבשות בצינור צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר הממוקם בדלי קרח. הוסף 10 עד 15 חרוזי זכוכית בגודל מילימטר אחד לתוך צינור הצנטריפוגה.מערבלים את הגבישים והחרוזים ב-1000 סל"ד למשך 30 שניות, ומחליפים אותם על קרח למשך 30 שניות. לאחר מכן ניתן להשתמש בזרעים מיד או לאחסן במינוס 20 מעלות צלזיוס. כדי לבצע ניסוי מורפוגמה, הוסף ריכוזים של חמישה עד 40% של PEG 6000 עם Tris-HCl טוחנת אחת ב- pH שבע ו- 0.15 מגנזיום כלורי מולארי לאורך עמודות הצלחת של מסך רשת בן שתי טיפות 96 בארות תקן דילול רציף של אנדותיאפפסין בנתרן אצטט מולארי 0.1 מ -100 עד 12.5 מיליגרם למיליליטר במשך שמונה צעדים.לאחר מכן פיפטה שמונה מיקרוליטרים מכל דילול ואחריה שני מיקרוליטרים של מלאי זרעים לתוך צלחת הרובוט לטיפול בנוזל. באמצעות רובוט לטיפול בנוזלים, יש לפזר 150 ננוליטר מכל דילול של אנדותיאפפסין לבארות משנה אחת ושתיים של המסך. יש לשאוף 50 ננוליטר של מלאי זרעים מופשר ו-100 ננוליטר של תמיסת הבאר מתת-באר שתיים ולחלק את שניהם לתמיסת החלבון.מערבבים תמיסות שלוש פעמים עם הוספת חיץ ההתגבשות או חיץ ההתגבשות ותערובת הזרעים. כעת אטמו את הצלחת והתמונה באפס, שלוש, שש, 12, 18 ו-24 שעות של היום הראשון בכל יום בשבוע הראשון ובכל שבוע במשך ארבעת השבועות הבאים ב-20 מעלות צלזיוס. לאחר 24 שעות, התבוננו בצלחת תחת מיקרוסקופ, העריכו את מספר הגבישים בתוך כל באר ומדדו דגימה של הגבישים.רשום הערכות אלה בגליון העבודה שסופק מחולל מורפוגרמות. הזן את הריכוזים ההתחלתיים של endothiapepsin ו- PEG 6000 בתיבות המתאימות. גליון העבודה יתווה באופן אוטומטי את התוצאות בתבנית דיאגרמת הפאזה המסורתית עם ריכוזי המשקע והחלבון בציר X ו- Y בהתאמה.ובכן, תנאים המולידים גבישים רק בטיפות הזרעים שלהם מצביעים על אזור המטא-יציב של הדיאגרמה, בעוד שתנאים עם גבישים הן בטיפות הזרעים והן בטיפות שאינן זרעים מציינים את אזור הגרעין. מניתוח המורפוגרמה, בחר את התנאי המבטיח ביותר לשינוי קנה מידה ל -24 לוחות באר. לאחר מכן להתחיל עם 100 מיליגרם למיליליטר של endothiapepsin ו 35% PEG 6000.הכינו חמישה מיליליטר של חיץ התגבשות עם 35% PEG 6000, 0.1 Tris-HCl טוחנת עם pH שבע ו-0.15 מגנזיום כלורי טוחן. כעת מניחים 0.5 מיליליטר של חיץ ההתגבשות בשלוש בארות של צלחת טיפה תלויה משומנת של 24 בארות. מערבבים 15 מיקרוליטר של אנדותיאפפסין עם 15 מיקרוליטר של תמיסת התגבשות על משטח זכוכית.מניחים את הפתרון מעל הבארות ומשאירים את הצלחת למשך 24 שעות. לאחר 24 שעות, התבוננו בצלחת תחת מיקרוסקופ, העריכו את מספר הגבישים בטיפה ומדדו את גודלם. אם הגבישים שגויים, חזרו על שלב זה, אך שנו את ריכוז החלבונים או הוסיפו זרעים אם הגרעין הגבישי אינו גבוה מספיק.חזור על ניסוי קנה המידה של 24 בארות על ידי הוספת זרעים בריכוז גבוה יותר של PEG 6000. מניחים 0.5 מיליליטר של חיץ ההתגבשות החדש בשלוש בארות של צלחת טיפה תלויה משומנת של 24 בארות. הניחו 15 מיקרוליטר של אנדותיאפפסין על מכסה זכוכית, החליקו וערבבו חמישה מיקרוליטרים של ציר זרעים ו-10 מיקרוליטר של תמיסת התגבשות עם תמיסת אנדותיאפפסין.הפכו את פתקי הכיסוי, הניחו אותם מעל הבארות והשאירו למשך 24 שעות. בדוק שוב את הטיפות כדי לראות אם הגבישים קטנים יותר ויש להם ריכוז גבוה יותר. הערך את מספר הגבישים בטיפה ומדוד שוב את גודלם כדי לראות אם הם כעת בגודל הנכון.כדי לבצע פרוטוקול אצווה זרעים, הכינו את חיץ ההתגבשות של 40%PEG 6000, 0.1 Tris-HCl מולארי עם pH של שבע, ו-0.15 מגנזיום כלורי טוחן. ערבבו מראש 50 מיקרוליטר מלאי זרעים ו-100 מיקרוליטר תמיסת התגבשות, וערבבו עם תמיסת חלבון בצינור הצנטריפוגה 1.5 מיליליטר. סובבו את הצינור למשך 10 שניות והניחו אותו על נדנדה או שייקר בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס.קח aliquot 2.5 מיקרוליטר של פתרון אצווה כל 20 דקות. עקוב אחר גודל ומספר הגבישים באמצעות המוציטומטר. ספרו את מספר הגבישים ומדדו את גודלם תחת המיקרוסקופ.כאשר הגבישים הגיעו לממד של כ-15 מיקרון, הרוו את התגובה עם 150 מיקרוליטר של נתרן אצטט מולארי 0.5 בתוספת 0.5 טריס-HCl טוחן, 0.075 מגנזיום כלורי מולארי ו-20% PEG 6000. בדוק שוב את גודל הגביש וריכוזו באמצעות ההמוציטומטר. אחסנו את הגבישים בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס.ניתוח מורפוגרמת אנדותיאפפסין הציע כי נוקלציה הושפעה הן מריכוזי חלבונים והן מריכוזי מזרזים. ניתן להבחין יפה בין אזורי MetaStable, נוקלציה ומשקעים של הדיאגרמה. תוספת הזרעים הגדילה משמעותית את מספר הגבישים בהשוואה לטיפות ללא זרעים.ניתוח של התגבשות מיקרו אנדותיאפפסין בנפחים של 200 עד 300 מיקרוליטר חשף את השינויים בגרעין הגביש ואת הממד הארוך ביותר לאורך זמן. הגדלת ריכוז ה-PEG ל-35% שיפרה משמעותית את ההתגבשות, עם ריכוז גבישי סופי של בערך פי 3.6 פי 10 עד שש למיליליטר, וממד הגביש הארוך ביותר של 42 מיקרומטר. כדי להקטין את גודל הגבישים הסופיים, יושמה גישה להפחתת ריכוז החלבון, שלמרבה הצער הפחיתה את ריכוז הגביש באופן משמעותי, ובסופו של דבר יצרה גבישים גדולים עוד יותר.עם זאת, הגישה של הגדלת ריכוז ה-PEG ל-40% הניבה גבישים בערך פי 3.1 פי 10 עד שישה למיליליטר וגודל של כ-39 מיקרומטר. יתר על כן, הוספת זרעים הובילה לעלייה משמעותית בריכוז הגביש, בסביבות פי 1.1 פי 10 לשמונה למיליליטר וממדים קטנים יותר של כ -4.2 מיקרומטר. אפקט המרווה שניסה בתגובת ההתגבשות נתן ריכוז גבישי סופי של כ-2.6 כפול 10 עד שש למיליליטר וגודל של כ-15 מיקרומטר.חצי CC שזוהה כנגד הרזולוציה מנתוני קרני הרנטגן הראה ירידה קלה ברזולוציית הגביש מנפח של 10 מיקרוליטר לנפח של 200 עד 300 מיקרוליטר. עם זאת, הגביש עדיין התפזר ל -1.5 אנגסטרום, אשר נחשב מספיק. אנדותיאפפסין הוא חלבון סלחני לעבוד איתו.אנו מקווים כי ניסיון פרוטוקול זה של endothiapepsin ייצור רעיונות שימושיים ושיטות עבור חלבונים אחרים. במיוחד עם קריסטלוגרפיה, זה מועיל לראות איך הדברים נראים ומרגישים במקום לנסות רק לעקוב אחר פרוטוקול כתוב. יש לקוות שהסרטון הזה ייתן לכם חלק מהתחושה הזו.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography

הכנה והגשת microcrystals חלבון בשלב lipidic מעוקב עבור קריסטלוגרפיה Femtosecond סידורי

Membrane proteins (MPs) are essential components of cellular membranes and primary drug targets. Rational drug design relies on precise structural ...

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

אקוסטית אוטומטית מחלק עבור דילול סדרה של אגוניסטים פפטיד ב מבחני קביעת און

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

Microcrystallography של קריסטלים חלבון ו<em&gt; בסולו</em&gt; השתברות

The advent of high-quality microfocus beamlines at many synchrotron facilities has permitted the routine analysis of crystals smaller than 10 &#181;m in ...

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

גידול גבישים חלבון עם ממדים ברורים באמצעות כלים אוטומטיים התגבשות בשילוב עם בחיי עיר פיזור אור דינאמי

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

אפיון של Glycoproteins עם הקיפול בנוגדנים על ידי קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן וטכניקות ביופיזיקלי

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

מחזיק מדגם All-in-one עבור קריסטלוגרפיה Macromolecular X-ray עם פיזור רקע מינימלי

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

קריסטלוגרפיה רנטגן כדי ללמוד את המעבר המדינה אוליגומרית של Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

The M42 aminopeptidases form functionally active complexes made of 12 subunits. Their assembly process appears to be regulated by their metal ion ...

Derivatization of Protein Crystals with I3C using Random Microseed Matrix Screening

גניבות של גבישי חלבון עם I3C באמצעות הקרנת מטריצת מיקרו-זרעים אקראית

Protein structure elucidation using X-ray crystallography requires both high quality diffracting crystals and computational solution of the diffraction ...

Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip

התגבשות וקביעת מבנה של אנזים:קומפלקס מצע על ידי התגבשות סדרתית בשבב מיקרופלואידי רב-תכליתי

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We ...

Workflow and Tools for Crystallographic Fragment Screening at the Helmholtz-Zentrum Berlin

זרימת עבודה וכלים להקרנת שברים קריסטלוגרפיים בהלמהולץ-זנטרום ברלין

Fragment screening is a technique that helps to identify promising starting points for ligand design. Given that crystals of the target protein are ...