Name: optimizing the growth of endothiapepsin crystals for serial crystallography experiments
Uploaded: 2021-02-04T12:30:00
Duration: 9 min 52 s
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इस परियोजना को यूरोपीय संघ के क्षितिज 2020 अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम से मैरी स्कोलोडोवस्का-क्यूरी अनुदान समझौते नंबर 701647 के तहत धन प्राप्त हुआ है। स्विस लाइट सोर्स बीमलाइन X10SA-PXII में बीमलाइन वैज्ञानिकों की सहायता और समर्थन के लिए बहुत धन्यवाद।

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

प्रस्तुत विधि से पता चलता है कि बड़े क्रिस्टल (≥ 100 μm सबसे लंबा आयाम) से एंडोथियापेप्सिन के क्रिस्टलीकरण को कैसे अनुकूलित किया जाए, जो विरल-मैट्रिक्स 96-वेल स्क्रीन में उगाया जाता है, माइक्रो-क्रिस्टल, जो बैच के माध्यम से सेंट्रीफ्यूज ट्यूब (300 μL वॉल्यूम) में उगाया जाता है। प्रोटोकॉल के पीछे विचार यह है कि एंडोथियापेप्सिन को अनुकूलित करने के लिए उठाए गए कदमों का उपयोग अन्य प्रोटीनों के लिए भी किया जा सकता है। अंततः, एक्सएफईएल और सिंक्रोट्रॉन पर सीरियल क्रिस्टलोग्राफी प्रयोगों के लिए माइक्रो-क्रिस्टल (10-20 μm) की बड़ी मात्रा (>100 μL) बनाने की समस्या का जवाब देना।
प्रोटोकॉल बड़ी मात्रा में माइक्रो-क्रिस्टलीकरण के कार्य को तीन चरणों में विभाजित करता है: (1) क्रिस्टल आकृति विज्ञान का अनुकूलन, (2) बैच में संक्रमण, और (3) स्केलिंग। चरण 1 में, क्रिस्टल रूपों की सीमा जो एक प्रोटीन बना सकता है, वाष्प प्रसार प्लेटों में पता लगाया जाना चाहिए। ऐसी स्थितियां जो एकल, बॉक्स जैसे क्रिस्टल को जन्म देती हैं जो आवश्यक संकल्प से अलग होती हैं, लक्ष्य होना चाहिए। चरण 2 में, चयनित स्थितियों को वाष्प प्रसार से बैच में परिवर्तित किया जा सकता है। यहां, अनुकूलन मानदंड क्रिस्टल विकास समय है और उन स्थितियों को ढूंढना है जो 24 घंटे के भीतर प्रोटीन क्रिस्टल को जन्म देते हैं। एक मोर्फोग्राम को भी प्लॉट किया जा सकता है जिससे प्रयोगकर्ता को घुलनशीलता रेखा और न्यूक्लियेशन ज़ोन सीमाओं के स्थान का अंदाजा हो सके। यह मोर्फोग्राम चरण 3, स्केलिंग में बहुत उपयोगी है। मोर्फोग्राम इस बात का संकेत देगा कि क्या न्यूक्लियेशन अकेले एक्सएन को बढ़ा सकता है और एक्स एस को नीचे चलासकता है। जैसा कि प्रयोग की मात्रा में वृद्धि हुई है, एक्सएन और एक्सएस को स्केलिंग सफलता के प्रमुख मानदंडों के रूप में लगातार मूल्यांकन किया जा सकता है।
एंडोथियापेप्सिन के मामले में, चरण 1 ने एंडोथियापेप्सिन के लिए पहले से अज्ञात क्रिस्टल आकृति विज्ञान का पता लगाया। इस आकृति विज्ञान में वही अंतरिक्ष समूह था जो पहले रिपोर्ट किया गया था, लेकिन, महत्वपूर्ण रूप से सीरियल क्रिस्टलोग्राफी के लिए, एक अधिक बॉक्स जैसी आकृति थी। एकल क्रिस्टल भी एकल न्यूक्लियेशन बिंदुओं से बढ़ते प्रतीत होते थे, अन्य स्थितियों से बनाए गए प्रशंसकों के विपरीत (चित्रा 4)। चयनित स्थिति के लिए, चरण 2 पहले से ही आंशिक रूप से संतुष्ट था क्योंकि क्रिस्टल वृद्धि < 24 घंटे में हुई थी। मोर्फोग्राम ने संकेत दिया कि चरण 3 में स्केलिंग करते समय एक सीधे या बीज वाले बैच प्रोटोकॉल दोनों सफल हो सकते हैं। सीधे बैच में प्रारंभिक स्केलिंग ने एक ऐसी स्थिति पैदा की जिसने क्रमशः 3.6 ± 1.2 x 106 क्रिस्टल-एमएल -1 और 42 ± 4.1 μm की Xn और Xs रेंज के साथ क्रिस्टल का उत्पादन किया। ये क्रिस्टल, हालांकि कुछ सीरियल क्रिस्टलोग्राफी प्रयोगों के लिए स्वीकार्य थे, उन्हें बहुत बड़ा माना जाता था। इसलिए अतिरिक्त अनुकूलन किए गए थे। अंतिम प्रोटोकॉल ने क्रमशः 3.1 x 106 क्रिस्टल -1 और 15 ± 3.9 μm की एकाग्रता और आकार सीमा के साथ क्रिस्टल का उत्पादन किया। यह नियोजित प्रयोगों के लिए आदर्श से अधिक था।
विधि वाष्प प्रसार प्लेटों में उगाए गए 'घुलनशील' प्रोटीन क्रिस्टल के बैच में परिवर्तन पर केंद्रित है। इस फोकस का कारण यह है कि घुलनशील प्रोटीन क्रिस्टल का विशाल बहुमत वाष्प प्रसार26 के माध्यम से उगाया जाता है। हालांकि, प्रस्तुत अवधारणाओं को अन्य तरीकों, जैसे माइक्रो-बैच का उपयोग करके उगाए गए घुलनशील प्रोटीन क्रिस्टल पर भी लागू किया जा सकता है। अवधारणाएं एलसीपी में उगाए गए झिल्ली प्रोटीन क्रिस्टल पर भी लागू हो सकती हैं; चूंकि यह भी एक बैच क्रिस्टलीकरण प्रक्रिया है।
प्रोटोकॉल का एक महत्वपूर्ण पहलू वाष्प प्रसार प्लेटों में उगाए गए क्रिस्टल की स्थितियों को बदलने की प्रक्रिया है ताकि उन्हें बैच में उगाया जा सके। इस परिवर्तन के लिए, विधि बील एट अल (2019)26 द्वारा प्रस्तावित मानदंड का उपयोग करती है। एक बैच प्रक्रिया के माध्यम से उगाए गए क्रिस्टल, यहां तक कि वाष्प प्रसार प्लेटों में भी, तेजी से (< 24 घंटे) बनेंगे। यह मानदंड वाष्प प्रसार ड्रॉप संतुलन की गति के आधार पर एक अनुमान है, और पीईजी-आधारित प्रीसिपेटेंट स्थितियों के लिए सबसे अधिक सच है। हालांकि, क्रिस्टलीकरण की स्थिति में विभिन्न प्रकार के यौगिक शामिल होंगे जो संतुलन समय को प्रभावित करेंगे। नमक आधारित क्रिस्टलीकरण स्थितियों का संतुलन, उदाहरण के लिए अत्यधिक केंद्रित अमोनियम क्लोराइड, 1-2 दिनों में हो सकता है। इसलिए, नमक आधारित स्थितियों के लिए 24 घंटे का मानदंड सही नहीं हो सकता है। नमक-आधारित स्थितियों में अधिक जटिल चरण आरेख26,30 भी हो सकते हैं जो इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत आर्किटाइप के अनुरूप नहीं हो सकते हैं। नमक-आधारित स्थितियों के लिए समय मानदंड में 12 या 6 घंटे तक की कमी आवश्यक हो सकती है यदि बड़ी मात्रा में स्केलिंग असंभव साबित होती है।
इस विधि की एक और सीमा इसकी स्पष्ट जटिलता है। एंडोथियापेप्सिन के सूक्ष्म-क्रिस्टलीकरण को अनुकूलित करने के लिए जिस प्रोटोकॉल का पालन किया गया था, उसने वास्तव में विरल-मैट्रिक्स स्क्रीन से मूल स्थिति को अपेक्षाकृत कम बदल दिया। पैक्ट स्क्रीन में देखा गया पहला हिट 0.1 एचईपीईएस पीएच 7.0, 0.2 एम एमजीसीएल2, और 20% (डब्ल्यू / वी) पीईजी 6,000 था। अंतिम स्केल क्रिस्टलीकरण बफर 0.1 ट्रिस-एचसीएल पीएच 7.0, 0.15 एम एमजीसीएल2, और 40% (डब्ल्यू / वी) पीईजी 6,000 था। यह भी बहुत संभव है कि एचईपीईएस से ट्रिस-एचसीएल और एमजीसीएल2 एकाग्रता में बफर में परिवर्तन ने प्रक्रिया की सफलता में बहुत कम योगदान दिया। पीईजी 6,000 एकाग्रता में वृद्धि को एकमात्र अनुकूलन छोड़ दें, और एक जिसे काफी आसानी से हासिल किया जा सकता था।
हालांकि, यह आकलन भी बहुत सरल है। यह न केवल स्केलिंग (यानी, बीज और शमन के उपयोग) के दौरान आने वाली समस्याओं को छूट देता है, बल्कि यह तथ्य भी है कि सिर्फ इसलिए कि यह प्रोटीन सीधा साबित हुआ, इस बात की कोई गारंटी नहीं है कि अगला भी साबित होगा। प्रोटोकॉल में बताए गए कदम, तैयार किए गए थे क्योंकि प्रोटीन क्रिस्टलीकरण वॉल्यूम के स्केलिंग को अनुकूलित करना बहुत प्रोटीन महंगा हो सकता है। दिखाए गए सात एंडोथियापेप्सिन स्केलिंग परीक्षणों में, 100 मिलीग्राम प्रोटीन का सेवन किया गया था। बेशक इनमें से कुछ कदम इस प्रोटोकॉल के प्रकाश में उनके परिणामों को दिखाने के लिए किए गए थे। फिर भी, एक प्रयोग के दौरान खपत प्रोटीन के लिए 100 मिलीग्राम प्रोटीन, साथ ही संभावित रूप से 50 मिलीग्राम प्रोटीन (तालिका 1), समय या धन में एक महत्वपूर्ण निवेश हो सकता है।
सौभाग्य से, यह स्पष्ट नहीं है कि आवश्यक नमूने का यह द्रव्यमान सभी प्रोटीनों में सर्वव्यापी है। एंडोथियापेप्सिन अत्यधिक घुलनशील था, और इसलिए सुपरसेसमेंट तक पहुंचने के लिए एक बड़ी प्रोटीन एकाग्रता की आवश्यकता होती है। दूसरों में (वर्तमान में अनुकूलन के तहत), 10 या 5 मिलीग्राम / एमएल पर भी सूखा पहुंच सकता है। ऐसे चर प्रोटीन विशिष्ट होते हैं और जब वे दिखाई देते हैं तो उन्हें गले लगाने की आवश्यकता होती है।
विधि की अन्य सीमाओं में स्क्रीन और प्लेट निर्माण के लिए तरल हैंडलिंग रोबोट जैसे जटिल उपकरणों पर इसकी निर्भरता और आवश्यकता होने पर स्वचालित रूप से प्लेटों को चित्रित करने के लिए इमेजर्स शामिल हैं। उपकरणों के इन टुकड़ों में से कुछ की आवश्यकता को सीमित करने के लिए वैकल्पिक दिनचर्या की पेशकश की गई है, लेकिन प्रोटोकॉल उनके बिना पालन करने के लिए अधिक समय लेने वाला होगा। प्रोटोकॉल अनुकूलित क्रिस्टल के विवर्तन का परीक्षण करने का भी सुझाव देता है। सिंक्रोट्रॉन तक नियमित पहुंच के बिना क्रिस्टलोग्राफरों के लिए, ये परीक्षण चुनौतीपूर्ण साबित हो सकते हैं। हर कदम पर नियंत्रण आवश्यक नहीं हो सकता है, लेकिन हिट की पहचान होने के बाद, और प्री-और पोस्ट-स्केलिंग के बाद इन परीक्षणों की दृढ़ता से सिफारिश की जाती है। एक्सएफईएल में गैर-विच्छेदित क्रिस्टल, दुर्भाग्य से, एक असामान्य घटना नहीं है। इसे देखते हुए, क्रिस्टल विवर्तन के बारे में मान्यताओं के बारे में सावधानी के पक्ष में गलती करना बेहतर है।
अंततः, यह प्रोटोकॉल और यहां प्रस्तुत परिणाम सीरियल क्रिस्टलोग्राफी प्रयोगों के लिए नमूने बनाने के साथ संघर्ष करने वालों के लिए एक गाइड, विचार और एक उदाहरण प्रदान करेंगे। उम्मीद है, जैसा कि सीरियल क्रिस्टलोग्राफी को आगे विकसित किया गया है, तकनीक की नमूना मांगों को कम किया जाएगा ताकि इस तरह के प्रोटोकॉल की आवश्यकता कम हो जाए। हालांकि, इस घटना में भी, यहां प्रस्तुत रणनीतियां अभी भी उन लोगों के लिए उपयोगी होंगी जो अपने प्रोटीन के क्रिस्टलीकरण स्थान का पता लगाना चाहते हैं।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Swissci 96-well 2-Drop plates</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD11-002</td>
			<td>96-well 2-drop crystallisation plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swissci 96-well 3-Drop plates</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD11-003</td>
			<td>96-well 3-drop crystallisation plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mosquito LCP liquid handling robot</td>
			<td>sptlabtech</td>
			<td>mosquito LCP</td>
			<td>Crystallisation robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClearVue Sheets</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD6-015</td>
			<td>96-well crystallization plate seals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Tube 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td>1.5 mL centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scaple</td>
			<td>Swan and Morton</td>
			<td>No. 3 scalple and No. 3 handle</td>
			<td>Scalple for cutting open plate seals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS 3 Vortex</td>
			<td>IKA</td>
			<td>3319000</td>
			<td>Vortex for mixing solution and making seed stocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well XRL Plate</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD3-11</td>
			<td>24-well hanging-drop plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube revolver/rotator</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>88881001</td>
			<td>Tube revolver for mixing solution during scaling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Research plus pipettes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>Range of manual pipettes, 0.5-10, 1-20, 10-100, 100-1000 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf pipette tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>Range of tip sizes for manual pipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suparen 600</td>
			<td>Prochem AG</td>
			<td>Suparen 600</td>
			<td>Endothiapepsin solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>241245-1KG</td>
			<td>Sodium Acetate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8382T014</td>
			<td>Tris</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670-1kg</td>
			<td>Magnesium Chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG 6,000</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>81255-1kg</td>
			<td>PEG 6,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethelyene glycol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>324558-1L</td>
			<td>Ethelyene glycol for cyro-protecting the crystals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PACT Premier HT screen</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD1-36</td>
			<td>PACT Premier 96-well crystal screen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOW CORNING high vacuum grease</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD6-02</td>
			<td>Grease for sealing 24-well plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hirschmann 22 x 22 mm glaser cover slides</td>
			<td>Hirschmann</td>
			<td>8000104</td>
			<td>Cover slides for sealing 24-well sitting drop plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal pins</td>
			<td>PSI</td>
			<td>Manufactured inhouse</td>
			<td>Thin-film supports for micro-crystals.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-1.3 mm SiLibeads Type S</td>
			<td>Faust</td>
			<td>6239547</td>
			<td>Glass beads for making mico-seed stocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macbook Pro</td>
			<td>Apple</td>
			<td>Macbook Pro</td>
			<td>Computer for performing data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCP4 software suite</td>
			<td>CCP4</td>
			<td></td>
			<td>Diffraction pattern data processing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>Microsoft Office</td>
			<td>Plotting tool for phase diagram</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hausser Scientific Bright-Line counting chamber</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>02-671-51B</td>
			<td>Tool to calculate crystal concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PACT Premier</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD1-29-ECO</td>
			<td>Sparse-matrix crystallization screen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rock Imager</td>
			<td>Formulatrix</td>
			<td>Rock Imager</td>
			<td>Temperature controlled crystal plate storage and imager</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rock MakerWeb</td>
			<td>Formulatrix</td>
			<td>Rock MakerWeb</td>
			<td>Crystal plate creation and image storage stoftware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formulator</td>
			<td>Formulatrix</td>
			<td>Formulator</td>
			<td>96-well crystal screen creation liquid handling robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica MZ16 Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica MZ16</td>
			<td>Light microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS V4.6</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LAS V4.6</td>
			<td>Software for Leica microscopes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectra/Por 3.5 kDa dialysis tubing</td>
			<td>Spectrumlabs</td>
			<td>Spectra/Por 3 Dialysis Membrane</td>
			<td>3.5 kDa dialysis membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing closures</td>
			<td>Spectrumlabs</td>
			<td>Spectra/Por 3 Duniversal Closures</td>
			<td>Clips to seal the dialysis tubing ends</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon 10 kDa centrifugal concentrator</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>Amicon Ultra-15 10 kDa centrifugal concentrator</td>
			<td>10 kDa centrifugal filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5810 R swing bucket centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810 R Centrifuge</td>
			<td>Swing bucket centrifuge</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimizing the growth of endothiapepsin crystals for serial crystallography experiments

यहां, सिंक्रोट्रॉन और एक्सएफईएल दोनों पर सीरियल क्रिस्टलोग्राफी प्रयोगों के लिए उपयुक्त सूक्ष्म-क्रिस्टलीय स्लरी की बड़ी मात्रा (> 100 μL) के निर्माण की सुविधा के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है। विधि प्रोटीन क्रिस्टल चरण आरेख की समझ पर आधारित है, और उस ज्ञान का उपयोग कैसे किया जा सकता है। विधि को तीन चरणों में विभाजित किया गया है: (1) क्रिस्टल आकृति विज्ञान का अनुकूलन, (2) बैच में संक्रमण, और (3) स्केलिंग। चरण 1 में अच्छी तरह से अलग किए गए, एकल क्रिस्टल खोजना शामिल है, उम्मीद है लेकिन जरूरी नहीं, क्यूब जैसी आकृति विज्ञान में प्रस्तुत करना। स्टेज 2 में, स्टेज 1 की स्थिति क्रिस्टल विकास समय द्वारा अनुकूलित की जाती है। यह रणनीति वाष्प प्रसार द्वारा उगाए गए क्रिस्टल को बैच में बदल सकती है। एक बार जब क्रिस्टल की वृद्धि लगभग 24 घंटे के भीतर हो सकती है, तो प्रोटीन और प्रीसिपेटेंट मिश्रण के एक मोर्फोग्राम को प्लॉट किया जा सकता है और स्केलिंग रणनीति (चरण 3) के आधार के रूप में उपयोग किया जा सकता है। जब क्रिस्टल को बैच में उगाया जा सकता है, तो स्केलिंग का प्रयास किया जा सकता है, और वॉल्यूम बढ़ने के साथ क्रिस्टल आकार और एकाग्रता को अनुकूलित किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल के लिए एंडोथियापेप्सिन का उपयोग प्रदर्शन प्रोटीन के रूप में किया गया है। प्रस्तुत किए गए कुछ निर्णय एंडोथियापेप्सिन के लिए विशिष्ट हैं। हालांकि, यह आशा की जाती है कि जिस तरह से उन्हें लागू किया गया है, वह इस प्रक्रिया के बारे में सोचने का एक तरीका प्रेरित करेगा जो अन्य अपनी परियोजनाओं के अनुकूल हो सकते हैं।

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Optimizing the Growth of Endothiapepsin Crystals for Serial Crystallography Experiments

इस लेख का उद्देश्य दर्शकों को एक ठोस समझ देना है कि बड़े, एकल प्रोटीन क्रिस्टल को बढ़ाने के लिए उनके छोटे-मात्रा, वाष्प-प्रसार प्रोटोकॉल को सीरियल क्रिस्टलोग्राफी के लिए एक बड़ी मात्रा बैच माइक्रो-क्रिस्टलीकरण विधि में कैसे बदला जाए।

सीरियल क्रिस्टलोग्राफी प्रयोगों के लिए एंडोथियापेप्सिन क्रिस्टल के विकास का अनुकूलन

Here, a protocol is presented to facilitate the creation of large volumes (&#62; 100 &#181;L) of micro-crystalline slurries suitable for serial ...

सीरियल क्रिस्टलोग्राफी प्रयोग चुनौतीपूर्ण हो सकते हैं। उनके अभ्यास में एक महत्वपूर्ण बाधा माइक्रोक्रिस्टलाइन नमूने का निर्माण है। यह प्रोटोकॉल दिखाता है कि ऐसे नमूने मज़बूती से कैसे बनाए जा सकते हैं।यह विधि छोटी मात्रा में वाष्प प्रसार प्लेटों में उगाए गए बड़े क्रिस्टल को बड़ी मात्रा में माइक्रोक्रिस्टलाइन स्लरी में अनुकूलित करने के लिए एक रूपरेखा देने के लिए एंडोथियापेप्सिन का उपयोग करती है। हम यह दावा नहीं कर सकते कि यह प्रोटोकॉल सार्वभौमिक रूप से सफल होगा। हालांकि, हम आशा करते हैं कि यहां प्रस्तावित विचार और विधियां दूसरों को अन्य प्रोटीनों पर नियोजित करने के लिए एक प्रयोगात्मक ढांचा देती हैं।शुरू करने के लिए, फॉर्मूलाट्रिक्स रोबोट का उपयोग करके क्रिस्टलीकरण बफर के साथ दो-बूंद 96 वेल प्लेट तैयार करें। एक तरल हैंडलिंग रोबोट मिश्रण का उपयोग करके, प्रत्येक कुएं में क्रिस्टलीकरण बफर के 150 नैनोलीटर के साथ ताजा डीफ्रॉस्ट किए गए एंडोथियापेप्सिन के 150 नैनोलीटर मिलाएं। प्लेट को सील करें और फ़ॉर्मूलट्रिक्स होटल के अंदर 24 घंटे के लिए क्रिस्टल को बढ़ने दें।24 घंटे के बाद, 96-अच्छी तरह से क्रिस्टलीकरण प्लेट के पांच कुओं से क्रिस्टल को तोड़ें और हटा दें। उन्हें बर्फ की बाल्टी में रखी 1.5 मिलीलीटर सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में क्रिस्टलीकरण बफर के 250 माइक्रोलीटर में रखें। सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में एक मिलीमीटर आकार के 10 से 15 ग्लास मोती जोड़ें।क्रिस्टल और मोतियों को 30 सेकंड के लिए 1000 आरपीएम पर भंवर करें, और उन्हें 30 सेकंड के लिए बर्फ पर बदलें। बीज को सीधे इस्तेमाल किया जा सकता है या माइनस 20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। मोर्फोग्राम प्रयोग करने के लिए, पीईजी 6000 की पांच से 40% सांद्रता को पीएच सात पर एक मोलर ट्रिस-एचसीएल और 0.15 मोलर मैग्नीशियम क्लोराइड के साथ दो-बूंद 96-वेल ग्रिड स्क्रीन के प्लेट कॉलम के साथ जोड़ें, आठ चरणों में 0.1 मोलर सोडियम एसीटेट में एंडोथियापेप्सिन के अनुक्रमिक कमजोर पड़ने की मरम्मत करें।फिर प्रत्येक कमजोर पड़ने के आठ माइक्रोलीटर के बाद तरल हैंडलिंग रोबोट प्लेट में दो माइक्रोलीटर बीज स्टॉक डालें। एक तरल हैंडलिंग रोबोट का उपयोग करके, एंडोथियापेप्सिन के प्रत्येक कमजोर पड़ने के 150 नैनोलीटर को स्क्रीन के एक और दो उप-कुओं में वितरित करें। सब-वेल दो से मल्टी-एस्पिरेट 50 नैनोलीटर डीफ्रॉस्ट बीज स्टॉक और 100 नैनोलीटर कुएं का घोल और दोनों को प्रोटीन समाधान में वितरित करें।क्रिस्टलीकरण बफर या क्रिस्टलीकरण बफर और बीज मिश्रण के अलावा तीन बार समाधान मिलाएं। अब प्लेट और छवि को पहले सप्ताह के लिए हर दिन शून्य, तीन, छह, 12, 18, और 24 घंटे पर और अगले चार सप्ताह तक हर हफ्ते 20 डिग्री सेल्सियस पर सील करें। 24 घंटे के बाद, एक माइक्रोस्कोप के तहत प्लेट को देखें, प्रत्येक कुएं के भीतर क्रिस्टल की संख्या का अनुमान लगाएं और क्रिस्टल के नमूने को मापें।प्रदान किए गए मोर्फोग्राम जनरेटर कार्यपत्रक में इन अनुमानों को रिकॉर्ड करें। उपयुक्त बक्से में एंडोथियापेप्सिन और पीईजी 6000 की शुरुआती सांद्रता इनपुट करें। वर्कशीट स्वचालित रूप से परिणामों को पारंपरिक चरण आरेख प्रारूप में क्रमशः एक्स और वाई अक्ष पर प्रीसिपेटेंट और प्रोटीन सांद्रता के साथ प्लॉट करेगी।अच्छी तरह से स्थितियां जो केवल उनके बीज वाली बूंदों में क्रिस्टल को जन्म देती हैं, आरेख के मेटास्टेबल क्षेत्र को इंगित करती हैं, जबकि बीज और गैर-बीज वाली बूंदों दोनों में क्रिस्टल वाली स्थितियां न्यूक्लियेशन ज़ोन का संकेत देती हैं। मोर्फोग्राम विश्लेषण से, 24 अच्छी प्लेटों में स्केलिंग के लिए सबसे आशाजनक स्थिति का चयन करें। फिर एंडोथियापेप्सिन के 100 मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर और 35% पीईजी 6000 के साथ शुरू करें।35% पीईजी 6000 के साथ पांच मिलीलीटर क्रिस्टलीकरण बफर, पीएच सात के साथ 0.1 मोलर ट्रिस-एचसीएल, और 0.15 मोलर मैग्नीशियम क्लोराइड तैयार करें। अब क्रिस्टलीकरण बफर के 0.5 मिलीलीटर को एक ग्रीज़ किए हुए 24-अच्छी तरह से लटकने वाली ड्रॉप प्लेट के तीन कुओं में रखें। ग्लास कवर स्लिप पर 15 माइक्रोलीटर क्रिस्टलीकरण समाधान के साथ 15 माइक्रोलीटर एंडोथियापेप्सिन मिलाएं।घोल को कुओं के ऊपर रखें और प्लेट को 24 घंटे के लिए छोड़ दें। 24 घंटे के बाद, एक माइक्रोस्कोप के तहत प्लेट को देखें, बूंद में क्रिस्टल की संख्या का अनुमान लगाएं, और उनके आकार को मापें। यदि क्रिस्टल गलत हैं, तो इस चरण को दोहराएं, लेकिन प्रोटीन एकाग्रता को बदलें या यदि क्रिस्टल न्यूक्लियेशन पर्याप्त नहीं है तो बीज जोड़ें।पीईजी 6000 की उच्च सांद्रता पर बीज जोड़कर 24-वेल स्केलिंग प्रयोग को दोहराएं। नए क्रिस्टलीकरण बफर के 0.5 मिलीलीटर को एक चिकनाई वाले 24-अच्छी तरह से लटकने वाली ड्रॉप प्लेट के तीन कुओं में रखें। एक ग्लास कवर स्लिप पर 15 माइक्रोलीटर एंडोथियापेप्सिन रखें और एंडोथियापेप्सिन समाधान के साथ पांच माइक्रोलीटर बीज स्टॉक और 10 माइक्रोलीटर क्रिस्टलीकरण समाधान मिलाएं।कवर पर्चियों को उल्टा करें, उन्हें कुओं पर रखें, और 24 घंटे के लिए छोड़ दें। यह देखने के लिए बूंदों को फिर से जांचें कि क्या क्रिस्टल छोटे हैं और उच्च एकाग्रता है। बूंद में क्रिस्टल की संख्या का अनुमान लगाएं और यह देखने के लिए उनके आकार को फिर से मापें कि क्या वे अब सही आकार हैं।एक बीज-बैच प्रोटोकॉल करने के लिए, 40% पीईजी 6000, सात के पीएच के साथ 0.1 मोलर ट्रिस-एचसीएल और 0.15 मोलर मैग्नीशियम क्लोराइड का क्रिस्टलीकरण बफर तैयार करें। 50 माइक्रोलीटर बीज स्टॉक और 100 माइक्रोलीटर क्रिस्टलीकरण समाधान को प्री-मिक्स करें, और 1.5 मिलीलीटर सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में प्रोटीन समाधान के साथ मिलाएं। ट्यूब को 10 सेकंड के लिए भंवर करें और इसे 20 डिग्री सेल्सियस पर रॉकर या शेकर पर रखें।हर 20 मिनट में बैच समाधान का 2.5 माइक्रोलीटर एलिकोट लें। हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके क्रिस्टल के आकार और संख्या की निगरानी करें। क्रिस्टल की संख्या की गणना करें और माइक्रोस्कोप के तहत उनके आकार को मापें।जब क्रिस्टल लगभग 15 माइक्रोन आयाम तक पहुंच जाते हैं, तो 0.5 मोलर सोडियम एसीटेट के 150 माइक्रोलीटर के साथ प्रतिक्रिया को बुझाएं, 0.5 मोलर ट्रिस-एचसीएल, 0.075 मोलर मैग्नीशियम क्लोराइड और 20% पीईजी 6000 के साथ पूरक करें। हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके क्रिस्टल के आकार और एकाग्रता को फिर से जांचें। क्रिस्टल को 20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।एंडोथियापेप्सिन मोर्फोग्राम विश्लेषण ने सुझाव दिया कि न्यूक्लियेशन प्रोटीन और प्रीसिपेटेंट सांद्रता दोनों से प्रभावित था। आरेख के मेटास्टेबल, न्यूक्लियेशन और वर्षा क्षेत्रों को अच्छी तरह से अलग किया जा सकता है। बीज के अलावा बीज के बिना बूंदों की तुलना में क्रिस्टल संख्या में काफी वृद्धि हुई।200 से 300 माइक्रोलीटर वॉल्यूम में एंडोथियापेप्सिन माइक्रो क्रिस्टलाइजेशन के विश्लेषण से क्रिस्टल न्यूक्लियेशन और समय के साथ सबसे लंबे आयाम में परिवर्तन का पता चला। पीईजी एकाग्रता को 35% तक बढ़ाने से क्रिस्टलीकरण में सुधार हुआ, जिसमें लगभग 3.6 गुना 10 से छह प्रति मिलीलीटर की अंतिम क्रिस्टल एकाग्रता और 42 माइक्रोमीटर का सबसे लंबा क्रिस्टल आयाम था। अंतिम क्रिस्टल के आकार को कम करने के लिए, एक प्रोटीन एकाग्रता में कमी का दृष्टिकोण लागू किया गया था, जिसने दुर्भाग्य से क्रिस्टल एकाग्रता को काफी कम कर दिया, और अंततः और भी बड़े क्रिस्टल का उत्पादन किया।हालांकि, पीईजी एकाग्रता को 40% तक बढ़ाने के दृष्टिकोण ने क्रिस्टल को लगभग 3.1 गुना 10 से छह प्रति मिलीलीटर और लगभग 39 माइक्रोमीटर के आकार में उत्पन्न किया। इसके अलावा, बीज जोड़ने से क्रिस्टल एकाग्रता में उल्लेखनीय वृद्धि हुई, लगभग 1.1 गुना 10 से आठ प्रति मिलीलीटर और लगभग 4.2 माइक्रोमीटर के छोटे आयाम। क्रिस्टलीकरण प्रतिक्रिया में प्रयास किए गए शमन प्रभाव ने लगभग 2.6 गुना 10 से छह प्रति मिलीलीटर और लगभग 15 माइक्रोमीटर के आकार की अंतिम क्रिस्टल एकाग्रता दी।एक्स-रे डेटा से रिज़ॉल्यूशन के खिलाफ प्लॉट किए गए सीसी हाफ ने 10 माइक्रोलीटर से 200 से 300 माइक्रोलीटर वॉल्यूम तक क्रिस्टल रिज़ॉल्यूशन में मामूली कमी दिखाई। हालांकि, क्रिस्टल अभी भी 1.5 एंगस्ट्रम तक अलग हो गया, जिसे पर्याप्त माना गया। एंडोथियापेप्सिन काम करने के लिए एक क्षमाशील प्रोटीन है।हमें उम्मीद है कि एंडोथियापेप्सिन के इस प्रोटोकॉल की कोशिश करने से अन्य प्रोटीनों के लिए उपयोगी विचार और तरीके उत्पन्न होंगे। विशेष रूप से क्रिस्टलोग्राफी के साथ, यह देखना फायदेमंद है कि केवल एक लिखित प्रोटोकॉल का पालन करने की कोशिश करने के बजाय चीजें कैसी दिखती हैं और महसूस करती हैं। यह वीडियो आपको उम्मीद है कि आपको उस तरह का कुछ एहसास देगा।

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography

तैयारी और सीरियल गुजरने क्रि लिए lipídic घन चरण में प्रोटीन microcrystals की डिलिवरी

Membrane proteins (MPs) are essential components of cellular membranes and primary drug targets. Rational drug design relies on precise structural ...

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

स्वचालित ध्वनिक शक्ति निर्धारण assays में पेप्टाइड agonists के धारावाहिक कमजोर पड़ने के लिए वितरण

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

प्रोटीन क्रिस्टल की माइक्रोक्रिस्ट्रॉलोग्राफ़ी और<em&gt; सेलुलो में</em&gt; विवर्तन

The advent of high-quality microfocus beamlines at many synchrotron facilities has permitted the routine analysis of crystals smaller than 10 &#181;m in ...

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

अलग आयामों के साथ बढ़ती प्रोटीन क्रिस्टल का उपयोग कर स्वचालित क्रिस्टलीकरण में सीटू गतिशील प्रकाश बिखरने के साथ युग्मित

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

एक्स-रे क्रि और भौतिक तकनीकों द्वारा Immunoglobulin गुना के साथ नच का लक्षण वर्णन

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

न्यूनतम पृष्ठभूमि स्कैटिंग के साथ मैक्रोआण्विक एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी के लिए एक ऑल-इन-वन नमूना धारक

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

थर्मोटोगा मारिटिमा M42 अमीनोपेप्टिडेस TmPep1050 के ओलिगोमेरिक राज्य संक्रमण का अध्ययन करने के लिए एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी

The M42 aminopeptidases form functionally active complexes made of 12 subunits. Their assembly process appears to be regulated by their metal ion ...

Derivatization of Protein Crystals with I3C using Random Microseed Matrix Screening

रैंडम माइक्रोसीेड मैट्रिक्स स्क्रीनिंग का उपयोग करके I3C के साथ प्रोटीन क्रिस्टल का व्युत्पन्न

Protein structure elucidation using X-ray crystallography requires both high quality diffracting crystals and computational solution of the diffraction ...

Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip

एक एंजाइम का क्रिस्टलीकरण और संरचनात्मक निर्धारण: एक बहुमुखी माइक्रोफ्लुइडिक चिप में सीरियल क्रिस्टलोग्राफी द्वारा सब्सट्रेट कॉम्प्लेक्स

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We ...

Workflow and Tools for Crystallographic Fragment Screening at the Helmholtz-Zentrum Berlin

हेल्महोल्ट्ज़-ज़ेंड्रम बर्लिन में क्रिस्टलीय टुकड़ा स्क्रीनिंग के लिए कार्यप्रवाह और उपकरण

Fragment screening is a technique that helps to identify promising starting points for ligand design. Given that crystals of the target protein are ...