Name: optimizing the growth of endothiapepsin crystals for serial crystallography experiments
Uploaded: 2021-02-04T12:30:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimizing the Growth of Endothiapepsin Crystals for Serial Crystallography Experiments at JoVE.com

Этот проект получил финансирование от исследовательской и инновационной программы Европейского Союза «Горизонт 2020» в рамках грантового соглашения No 701647 имени Марии Склодовской-Кюри. Большое спасибо за помощь и поддержку ученых на линии луча Swiss Light Source X10SA-PXII.

У авторов нет конфликтов интересов, которые необходимо раскрывать.

Представленный метод показывает, как оптимизировать кристаллизацию эндотиапепсина от крупных кристаллов (≥ наибольшего размера 100 мкм), выращенных в 96-луночных экранах с разреженной матрицей, до микрокристаллов, выращенных в центрифужных пробирках (объемом 300 мкл) партиями . Идея, лежащая в основе протокола, заключается в том, что шаги, предпринятые для оптимизации эндотиапепсина, также могут быть использованы для других белков. В конечном счете, решая задачу создания больших объемов (>100 мкл) микрокристаллов (10-20 мкм) для серийных кристаллографических экспериментов на XFEL и синхротронах.
Протокол делит задачу микрокристаллизации большого объема на три этапа: (1) оптимизация морфологии кристаллов, (2) переход к пакетированию и (3) масштабирование. На шаге 1 следует исследовать диапазон кристаллических форм, которые может создавать белок, в диффузионных пластинах пара. Целью должны быть условия, которые приводят к образованию одиночных, коробчатых кристаллов, которые дифрагируют с требуемым разрешением. На этапе 2 выбранные условия могут быть преобразованы из диффузии пара в периодическое производство. Здесь критерием оптимизации является время роста кристаллов и поиск условий, которые приводят к образованию кристаллов белка в течение 24 часов. Также может быть построена морфограмма, дающая экспериментатору представление о расположении линии растворимости и границах зон зародышеобразования. Эта морфограмма очень полезна на шаге 3 «Масштабирование». Морфограмма даст представление о том, может ли зародышеобразование само по себе увеличить Xn и снизить Xs. По мере увеличения объема эксперимента Xn и Xs могут постоянно оцениваться как ключевые критерии успеха масштабирования.
В случае с эндотиапепсином Шаг 1 обнаружил то, что потенциально было ранее неизвестной морфологией кристаллов эндотиапепсина. Эта морфология имела ту же пространственную группу, что и те, о которых сообщалось ранее, но, что важно для серийной кристаллографии, более коробчатую форму. Монокристаллы также, по-видимому, росли из одиночных точек зародышеобразования, в отличие от вееров, созданных в других условиях (рис. 4). Для выбранного условия шаг 2 уже был частично выполнен, так как рост кристаллов происходил через < 24 часа. Морфограмма показала, что как прямой, так и засеянный пакетный протокол может быть успешным при масштабировании на шаге 3. Первоначальное масштабирование в прямой партии создало условия, в результате которых получались кристаллы с диапазоном Xn и Xs 3,6 ± 1,2 x 10,6 кристаллов·мл-1 и 42 ± 4,1 мкм соответственно. Эти кристаллы, хотя и приемлемые для некоторых серийных кристаллографических экспериментов, были сочтены слишком большими. Поэтому были проведены дополнительные оптимизации. Окончательный протокол произвел кристаллы с диапазоном концентраций и размеров 3,1 x10,6 кристаллов·мл-1 и 15 ± 3,9 мкм соответственно. Это было более чем идеально для запланированных экспериментов.
Метод фокусируется на превращении «растворимых» кристаллов белка, выращенных в пластинах для диффузии пара, в периодическое производство. Причина такого фокуса заключается в том, что подавляющее большинство растворимых кристаллов белка выращивается путем диффузиипаров 26. Однако представленные концепции могут быть также применены к растворимым кристаллам белка, выращенным с использованием других методов, таких как микропартия. Эти концепции также могут быть применимы к мембранным белковым кристаллам, выращенным в LCP; так как это тоже процесс периодической кристаллизации.
Ключевым аспектом протокола является процесс преобразования условий кристаллов, выращенных в диффузионных пластинах пара, таким образом, чтобы их можно было выращивать партиями. Для этого преобразования метод использует критерий, предложенный Beale et al. (2019)26. Кристаллы, выращенные с помощью периодического процесса, даже в пластинах для диффузии пара, будут образовываться быстро (< 24 часа). Этот критерий является приближением, основанным на скорости уравновешивания капель диффузии пара, и наиболее верен для условий осаждения на основе ПЭГ. Однако условия кристаллизации будут содержать широкий спектр соединений, которые будут влиять на время равновесия. Уравновешивание условий кристаллизации на основе солей, например, высококонцентрированного хлорида аммония, может произойти через 1-2 дня. Следовательно, критерий 24 ч может быть неверным для условий, основанных на соли. Условия, основанные на соли, также могут иметь более сложные фазовые диаграммы26,30, которые могут не соответствовать архетипу, представленному в этом протоколе. Сокращение временного критерия для условий на основе соли до 12 или 6 часов может потребоваться, если масштабирование в большие объемы окажется невозможным.
Еще одним ограничением этого метода является его кажущаяся сложность. Протокол, который был использован для оптимизации микрокристаллизации эндотиапепсина, фактически относительно мало изменил исходное состояние скрининга с разреженной матрицей. Первое попадание, наблюдаемое в скрининге PACT, было 0,1 pH HEPES 7,0, 0,2 M MgCl2 и 20% (мас./об.) ПЭГ 6,000. Окончательный масштабированный кристаллизационный буфер составлял 0,1 Tris-HCl pH 7,0, 0,15 M MgCl2 и 40% (мас./об.) PEG 6,000. Также вполне возможно, что изменение буфера с HEPES на Tris-HCl и концентрацию MgCl2 мало способствовало успеху процесса. Оставив увеличение концентрации PEG 6,000 единственной оптимизацией, и это могло быть достигнуто довольно просто.
Эта оценка, однако, также слишком упрощена. Это не только не учитывает проблемы, возникающие во время удаления зубного камня (т. е . использование семян и тушение), но и тот факт, что только потому, что этот белок оказался простым, нет никакой гарантии, что следующий также окажется таковым. Шаги, рекомендованные в протоколе, были разработаны, потому что оптимизация масштабирования объемов кристаллизации белка может быть очень дорогостоящей для белка. В семи исследованиях эндотиапепсина, которые показаны, было потреблено 100 мг белка. По общему признанию, некоторые из этих шагов были предприняты, чтобы показать их последствия в свете этого протокола. Тем не менее, 100 мг белка плюс потенциально еще 50 мг белка, потребляемого во время эксперимента (таблица 1), могут быть значительными инвестициями во время или деньги.
К счастью, неясно, является ли эта масса требуемого образца повсеместно распространена во всех белках. Эндотиапепсин был хорошо растворим, и поэтому для достижения пересыщения требовалась большая концентрация белка. В других (в настоящее время находящихся в стадии оптимизации) пересыщение может быть достигнуто при 10 или даже 5 мг / мл. Такие переменные являются специфическими для белка и должны быть приняты, когда они появляются.
Другие ограничения метода включают его зависимость от сложного оборудования, такого как роботы для обработки жидкостей для создания экранов и пластин, а также тепловизоры для автоматического изображения пластин, когда это необходимо. Были предложены альтернативные процедуры, чтобы ограничить потребность в некоторых из этих единиц оборудования, но без них соблюдение протокола займет больше времени. Протокол также предлагает проверить дифракцию оптимизированных кристаллов. Для кристаллографов, не имеющих регулярного доступа к синхротрону, эти тесты могут оказаться сложными. Контроль на каждом этапе может не понадобиться, но эти тесты настоятельно рекомендуются после того, как попадание было идентифицировано, а также до и после масштабирования. Недифракционные кристаллы в XFEL, к сожалению, не редкость. Учитывая это, лучше проявить осторожность в отношении предположений о дифракции кристаллов.
В конечном счете, этот протокол и результаты, представленные здесь, предложат руководство, идеи и пример для тех, кто борется с производством образцов для серийных экспериментов по кристаллографии. Будем надеяться, что по мере дальнейшего развития серийной кристаллографии требования к образцам этого метода будут снижены настолько, что потребность в подобных протоколах будет снижена. Однако даже в этом случае представленные здесь стратегии все равно будут полезны тем, кто хочет исследовать пространство кристаллизации своего белка.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Swissci 96-well 2-Drop plates</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD11-002</td>
			<td>96-well 2-drop crystallisation plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swissci 96-well 3-Drop plates</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD11-003</td>
			<td>96-well 3-drop crystallisation plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mosquito LCP liquid handling robot</td>
			<td>sptlabtech</td>
			<td>mosquito LCP</td>
			<td>Crystallisation robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClearVue Sheets</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD6-015</td>
			<td>96-well crystallization plate seals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Tube 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td>1.5 mL centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scaple</td>
			<td>Swan and Morton</td>
			<td>No. 3 scalple and No. 3 handle</td>
			<td>Scalple for cutting open plate seals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS 3 Vortex</td>
			<td>IKA</td>
			<td>3319000</td>
			<td>Vortex for mixing solution and making seed stocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well XRL Plate</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD3-11</td>
			<td>24-well hanging-drop plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube revolver/rotator</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>88881001</td>
			<td>Tube revolver for mixing solution during scaling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Research plus pipettes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>Range of manual pipettes, 0.5-10, 1-20, 10-100, 100-1000 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf pipette tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>Range of tip sizes for manual pipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suparen 600</td>
			<td>Prochem AG</td>
			<td>Suparen 600</td>
			<td>Endothiapepsin solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>241245-1KG</td>
			<td>Sodium Acetate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8382T014</td>
			<td>Tris</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670-1kg</td>
			<td>Magnesium Chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG 6,000</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>81255-1kg</td>
			<td>PEG 6,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethelyene glycol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>324558-1L</td>
			<td>Ethelyene glycol for cyro-protecting the crystals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PACT Premier HT screen</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD1-36</td>
			<td>PACT Premier 96-well crystal screen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOW CORNING high vacuum grease</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD6-02</td>
			<td>Grease for sealing 24-well plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hirschmann 22 x 22 mm glaser cover slides</td>
			<td>Hirschmann</td>
			<td>8000104</td>
			<td>Cover slides for sealing 24-well sitting drop plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal pins</td>
			<td>PSI</td>
			<td>Manufactured inhouse</td>
			<td>Thin-film supports for micro-crystals.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-1.3 mm SiLibeads Type S</td>
			<td>Faust</td>
			<td>6239547</td>
			<td>Glass beads for making mico-seed stocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macbook Pro</td>
			<td>Apple</td>
			<td>Macbook Pro</td>
			<td>Computer for performing data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCP4 software suite</td>
			<td>CCP4</td>
			<td></td>
			<td>Diffraction pattern data processing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>Microsoft Office</td>
			<td>Plotting tool for phase diagram</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hausser Scientific Bright-Line counting chamber</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>02-671-51B</td>
			<td>Tool to calculate crystal concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PACT Premier</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD1-29-ECO</td>
			<td>Sparse-matrix crystallization screen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rock Imager</td>
			<td>Formulatrix</td>
			<td>Rock Imager</td>
			<td>Temperature controlled crystal plate storage and imager</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rock MakerWeb</td>
			<td>Formulatrix</td>
			<td>Rock MakerWeb</td>
			<td>Crystal plate creation and image storage stoftware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formulator</td>
			<td>Formulatrix</td>
			<td>Formulator</td>
			<td>96-well crystal screen creation liquid handling robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica MZ16 Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica MZ16</td>
			<td>Light microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS V4.6</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LAS V4.6</td>
			<td>Software for Leica microscopes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectra/Por 3.5 kDa dialysis tubing</td>
			<td>Spectrumlabs</td>
			<td>Spectra/Por 3 Dialysis Membrane</td>
			<td>3.5 kDa dialysis membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing closures</td>
			<td>Spectrumlabs</td>
			<td>Spectra/Por 3 Duniversal Closures</td>
			<td>Clips to seal the dialysis tubing ends</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon 10 kDa centrifugal concentrator</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>Amicon Ultra-15 10 kDa centrifugal concentrator</td>
			<td>10 kDa centrifugal filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5810 R swing bucket centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810 R Centrifuge</td>
			<td>Swing bucket centrifuge</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimizing the growth of endothiapepsin crystals for serial crystallography experiments

Здесь представлен протокол, облегчающий создание больших объемов (> 100 мкл) микрокристаллических суспензий, пригодных для серийных кристаллографических экспериментов как на синхротронах, так и на XFEL. Метод основан на понимании фазовой диаграммы кристаллов белка и того, как эти знания могут быть использованы. Метод разделен на три этапа: (1) оптимизация морфологии кристаллов, (2) переход к пакетированию и (3) масштабирование. Стадия 1 включает в себя поиск хорошо дифрирующих монокристаллов, надеюсь, но не обязательно, представленных в виде куба. На этапе 2 условие этапа 1 оптимизируется по времени роста кристаллов. Эта стратегия может преобразовывать кристаллы, выращенные путем диффузии пара, в порцию. Как только рост кристаллов может произойти в течение примерно 24 часов, морфограмма смеси белка и осадителя может быть построена и использована в качестве основы для стратегии масштабирования (стадия 3). Когда кристаллы можно выращивать партиями, можно попробовать масштабирование, а размер и концентрацию кристаллов оптимизировать по мере увеличения объема. Эндотиапепсин использовался в качестве демонстрационного белка для этого протокола. Некоторые из представленных решений специфичны для эндотиапепсина. Тем не менее, есть надежда, что то, как они были применены, вдохновит на размышления об этой процедуре, которую другие смогут адаптировать к своим собственным проектам.

Watch this Scientific Journal Video about Optimizing the Growth of Endothiapepsin Crystals for Serial Crystallography Experiments at JoVE.com

Optimizing the Growth of Endothiapepsin Crystals for Serial Crystallography Experiments

Цель этой статьи - дать зрителю четкое представление о том, как преобразовать их протокол диффузии пара небольшого объема для выращивания крупных монокристаллов белка в метод периодической микрокристаллизации большого объема для серийной кристаллографии.

Оптимизация роста кристаллов эндотиапепсина для серийных кристаллографических экспериментов

Here, a protocol is presented to facilitate the creation of large volumes (&#62; 100 &#181;L) of micro-crystalline slurries suitable for serial ...

Серийные эксперименты по кристаллографии могут быть сложными. Ключевым препятствием в их практике является создание микрокристаллических образцов. Этот протокол показывает, как можно надежно создавать такие образцы.Этот метод использует эндотиапепсин для создания основы для оптимизации крупных кристаллов, выращенных в пластинах для диффузии пара малого объема, в микрокристаллические суспензии большого объема. Мы не можем утверждать, что этот протокол будет повсеместно успешным. Тем не менее, мы надеемся, что идеи и методы, предложенные здесь, дадут другим экспериментальную основу для использования на других белках.Для начала подготовьте планшет с двумя каплями 96 лунок с кристаллизационным буфером с помощью робота Formulatrix. Используя смесь робота для обработки жидкостей, смешайте 150 нанолитров свежеразмороженного эндотиапепсина со 150 нанолитрами кристаллизационного буфера в каждой лунке. Запечатайте пластину и дайте кристаллам расти в течение 24 часов внутри отеля Formulatrix.Через 24 часа разбейте и удалите кристаллы из пяти лунок 96-луночной кристаллизационной пластины. Поместите их в 250 микролитров кристаллизационного буфера в центрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра, помещенную в ведро со льдом. Добавьте от 10 до 15 стеклянных шариков размером в один миллиметр в пробирку центрифуги.Вращайте кристаллы и бусины со скоростью 1000 об/мин в течение 30 секунд и заменяйте их на льду в течение 30 секунд. Затем семена можно сразу использовать или хранить при температуре минус 20 градусов по Цельсию. Чтобы провести эксперимент с морфограммой, добавьте от пяти до 40% концентраций ПЭГ 6000 с одним молярным трис-HCl при рН семь и 0,15 моляра хлорида магния вдоль колонок пластин двухкапельного 96-луночного сетчатого экрана. Восстановите последовательное разведение эндотиапепсина в 0,1 молярном ацетате натрия от 100 до 12,5 миллиграммов на миллилитр в течение восьми шагов.Затем пипеткой насыпьте восемь микролитров каждого разбавления, а затем два микролитра семенного материала в тарелку робота для обработки жидкости. Используя робота для обработки жидкостей, распределите 150 нанолитров каждого разбавления эндотиапепсина в первую и вторую подлунки экрана. Мультиаспирируйте 50 нанолитров размороженного семенного материала и 100 нанолитров луночного раствора из второй лунки и распределите оба в белковый раствор.Смешайте растворы три раза после добавления кристаллизационного буфера или кристаллизационного буфера и смеси семян. Теперь запечатайте пластину и изображение в ноль, три, шесть, 12, 18 и 24 часа первого дня каждый день в течение первой недели и каждую неделю в течение следующих четырех недель при температуре 20 градусов по Цельсию. Через 24 часа посмотрите на пластину под микроскопом, оцените количество кристаллов в каждой лунке и измерьте образец кристаллов.Запишите эти оценки в предоставленный лист генератора морфограмм. Введите начальные концентрации эндотиапепсина и ПЭГ 6000 в соответствующие поля. Рабочий лист автоматически отобразит результаты в традиционном формате фазовой диаграммы с осадителем и концентрацией белка по осям X и Y соответственно.Условия колодца, которые дают начало кристаллам только в их засеянных каплях, указывают на метастабильную область диаграммы, тогда как условия с кристаллами как в засеянных, так и в незасеянных каплях указывают на зону зародышеобразования. На основе анализа морфограммы выберите наиболее перспективное условие для масштабирования на 24 скважины. Затем начните со 100 миллиграммов на миллилитр эндотиапепсина и 35% ПЭГ 6000.Приготовьте пять миллилитров кристаллизационного буфера с 35% ПЭГ 6000, 0,1 молярного трис-HCl с рН семь и 0,15 молярного хлорида магния. Теперь поместите 0,5 миллилитра кристаллизационного буфера в три лунки смазанной маслом 24-луночной подвесной пластины. Смешайте 15 микролитров эндотиапепсина с 15 микролитрами кристаллизационного раствора на стеклянном покровном стекле.Поместите раствор над лунками и оставьте тарелку на 24 часа. Через 24 часа посмотрите на пластину под микроскопом, оцените количество кристаллов в капле и измерьте их размер. Если кристаллы неверны, повторите этот шаг, но измените концентрацию белка или добавьте семена, если зарождение кристаллов недостаточно высокое.Повторите эксперимент с 24-луночным масштабированием, добавив семена с более высокой концентрацией PEG 6000. Поместите 0,5 миллилитра нового кристаллизационного буфера в три лунки смазанной маслом 24-луночной подвесной пластины. Поместите 15 микролитров эндотиапепсина на стеклянное стекло и смешайте пять микролитров семенного материала и 10 микролитров кристаллизационного раствора с раствором эндотиапепсина.Переверните покровные листы, поместите их над лунками и оставьте на 24 часа. Перепроверьте капли, чтобы убедиться, что кристаллы меньше и имеют ли они более высокую концентрацию. Оцените количество кристаллов в капле и снова измерьте их размер, чтобы увидеть, имеют ли они теперь правильный размер.Для выполнения протокола затравки приготовьте кристаллизационный буфер из 40% PEG 6000, 0,1 молярного Tris-HCl с pH семь и 0,15 молярного хлорида магния. Предварительно смешайте 50 микролитров семенного материала и 100 микролитров кристаллизационного раствора и смешайте с белковым раствором в пробирке центрифуги объемом 1,5 миллилитра. Покрутите трубку в течение 10 секунд и поместите ее на коромысло или шейкер при температуре 20 градусов по Цельсию.Принимайте аликвоту 2,5 микролитра порционного раствора каждые 20 минут. Следите за размером и количеством кристаллов с помощью гемоцитометра. Подсчитайте количество кристаллов и измерьте их размер под микроскопом.Когда кристаллы достигнут размера около 15 микрон, погасите реакцию 150 микролитрами 0,5 молярного ацетата натрия, дополненного 0,5 молярным трис-HCl, 0,075 молярным хлоридом магния и 20% PEG 6000. Повторно проверьте размер и концентрацию кристаллов с помощью гемоцитометра. Храните кристаллы при температуре 20 градусов Цельсия.Анализ морфограммы эндотиапепсина показал, что на зарождение влияют как концентрации белка, так и осадителя. Области MetaStable, зародышеобразования и осаждения на диаграмме можно хорошо различить. Добавление семян значительно увеличивало количество кристаллов по сравнению с каплями без семян.Анализ микрокристаллизации эндотиапепсина в объемах от 200 до 300 микролитров выявил изменения в зародышеобразовании кристаллов и самое длинное измерение с течением времени. Увеличение концентрации ПЭГ до 35% заметно улучшило кристаллизацию, с конечной концентрацией кристаллов примерно в 3,6 раза от 10 до шести на миллилитр и самым длинным размером кристалла 42 микрометра. Чтобы уменьшить размер конечных кристаллов, был применен подход к снижению концентрации белка, который, к сожалению, значительно снизил концентрацию кристаллов и в конечном итоге привел к еще более крупным кристаллам.Однако подход к увеличению концентрации ПЭГ до 40% дал кристаллы примерно в 3,1 раза от 10 до шести на миллилитр и размером примерно 39 микрометров. Кроме того, добавление семян привело к значительному увеличению концентрации кристаллов, примерно в 1,1 раза от 10 до восьми на миллилитр и меньшим размерам примерно на 4,2 микрометра. Эффект закалки, предпринятый в реакции кристаллизации, дал конечную концентрацию кристаллов примерно в 2,6 раза от 10 до шести на миллилитр и размер примерно 15 микрометров.CC, наполовину построенный против разрешения рентгеновских данных, показал небольшое снижение разрешения кристаллов с 10 микролитров до 200-300 микролитровых объемов. Тем не менее, кристалл все еще дифрагировал до 1,5 angstrum, что считалось достаточным. Эндотиапепсин — это щадящий белок для работы.Мы надеемся, что испытание этого протокола эндотиапепсина приведет к полезным идеям и методам для других белков. В частности, в кристаллографии полезно видеть, как все выглядит и ощущается, а не пытаться следовать только письменному протоколу. Мы надеемся, что это видео даст вам представление об этом.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography

Подготовка и поставка белка микрокристаллов в липидной кубической фазе для последовательного фемтосекундного кристаллографии

Membrane proteins (MPs) are essential components of cellular membranes and primary drug targets. Rational drug design relies on precise structural ...

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

Автоматизированная Акустическая дозирования для серийного разведения пептидные агонисты в Potency Определение Assays

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

Микрокристаллизация кристаллов белков и<em&gt; Разное</em&gt; Дифракция

The advent of high-quality microfocus beamlines at many synchrotron facilities has permitted the routine analysis of crystals smaller than 10 &#181;m in ...

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Растущий белок кристаллы с отдельных измерений с помощью автоматизированных кристаллизации, в сочетании с в Situ Динамическое рассеяние света

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

Характеристика гликопротеины с складке иммуноглобулина рентгеноструктурного анализа и биофизических методов

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

Универсальный выборочный держатель для макромолекулярной рентгеновской кристаллографии с минимальным рассеянием фона

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

Рентгеновская кристаллография для изучения олигомерского государства Переход Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

The M42 aminopeptidases form functionally active complexes made of 12 subunits. Their assembly process appears to be regulated by their metal ion ...

Derivatization of Protein Crystals with I3C using Random Microseed Matrix Screening

Вывод белковых кристаллов с I3C с помощью случайного скрининга матрицы микросея

Protein structure elucidation using X-ray crystallography requires both high quality diffracting crystals and computational solution of the diffraction ...

Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip

Кристаллизация и структурное определение фермента: Субстратный комплекс по серийной кристаллографии в универсальном микрофлюидной чипе

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We ...

Workflow and Tools for Crystallographic Fragment Screening at the Helmholtz-Zentrum Berlin

Рабочий процесс и инструменты для скрининга кристаллографических фрагментов в Берлинском центре Гельмгольца

Fragment screening is a technique that helps to identify promising starting points for ligand design. Given that crystals of the target protein are ...