Name: optimizing the growth of endothiapepsin crystals for serial crystallography experiments
Uploaded: 2021-02-04T12:30:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimizing the Growth of Endothiapepsin Crystals for Serial Crystallography Experiments at JoVE.com

Detta projekt har fått finansiering från Europeiska unionens forsknings- och innovationsprogram Horizon 2020 under Marie Skłodowska-Curie-bidragsavtalet No 701647. Stort tack för hjälp och stöd från strålrörsforskare vid Swiss Light Source beamline X10SA-PXII.

Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.

Metoden som presenteras visar hur man optimerar kristallisationen av endotiapepsin från stora kristaller (≥ 100 μm längsta dimensionen), odlade i glesmatris 96-brunnsskärmar, till mikrokristaller, odlade i centrifugrör (300 μL volym) via batch. Tanken bakom protokollet är att de åtgärder som vidtagits för att optimera entiapepsin även skulle kunna användas för andra proteiner. I slutändan svarar problemet med att skapa stora volymer (>100 μL) mikrokristaller (10-20 μm) för seriella kristallografiexperiment vid XFEL och synkrotroner.
Protokollet delar upp uppgiften för mikrokristallisation i stora volymer i tre steg: (1) Optimera kristallmorfologi, (2) Övergång till batch och (3) Skalning. I steg 1 bör utbudet av kristallformer som ett protein kan skapa undersökas i ångdiffusionsplattor. Förhållanden som ger upphov till enkla, lådliknande kristaller som diffrakterar till önskad upplösning bör vara målet. I steg 2 kan valda förhållanden sedan omvandlas från ångdiffusion till batch. Här är optimeringskriteriet kristalltillväxttid och att hitta förhållanden som ger upphov till proteinkristaller inom 24 h. Ett morfogram kan också plottas, vilket ger experimenten en uppfattning om placeringen av löslighetslinjen och kärnbildningszongränserna. Detta morfogram är till stor nytta i steg 3, skalning. Morfolimet kommer att ge en indikation på om kärnbildning ensam kan öka Xn och driva ner Xs. När experimentets volym ökas kan Xn och Xs kontinuerligt bedömas som de viktigaste kriterierna för skalningsframgång.
När det gäller Endothiapepsin avslöjade steg 1 vad som potentiellt var en tidigare okänd kristallmorfologi för endothiapepsin. Denna morfologi hade samma rymdgrupp som de som tidigare rapporterats men, viktigt för seriell kristallografi, en mer lådliknande form. Enstaka kristaller tycktes också växa från enstaka kärnbildningspunkter, till skillnad från fläktarna skapade från andra förhållanden (figur 4). För det valda villkoret var steg 2 redan delvis uppfyllt eftersom kristalltillväxt inträffade under < 24 timmar. Morfogrammet indikerade att både ett rakt eller seedat batchprotokoll kan lyckas vid skalning i steg 3. Initial skalning i rak sats skapade ett tillstånd som producerade kristaller med ett X-n-och X-s-intervall på 3,6 ± 1,2 x 106 kristaller ·ml-1 respektive 42 ± 4,1 μm. Dessa kristaller, även om de var acceptabla för vissa seriella kristallografiexperiment, ansågs för stora. Så ytterligare optimeringar utfördes. Det slutliga protokollet producerade kristaller med en koncentration och storleksintervall på 3,1 x 106 kristaller · ml-1 respektive 15 ± 3,9 μm. Detta var mer än idealiskt för de planerade experimenten.
Metoden fokuserar på omvandling av "lösliga" proteinkristaller odlade i ångdiffusionsplattor till batch. Anledningen till detta fokus är att de allra flesta lösliga proteinkristaller odlas via ångdiffusion26. De koncept som presenteras kan emellertid också tillämpas på lösliga proteinkristaller odlade med andra metoder, såsom mikrosats. Koncepten kan också vara tillämpliga på membranproteinkristaller odlade i LCP; eftersom detta också är en satskristallisationsprocess.
En viktig aspekt av protokollet är processen att omvandla förhållandena för kristaller odlade i ångdiffusionsplattor så att de kan odlas i sats. För denna omvandling använder metoden det kriterium som föreslagits av Beale et al. (2019) 26. Kristaller som odlas via en satsprocess, även i ångdiffusionsplattor, bildas snabbt (< 24 timmar). Detta kriterium är en approximation baserad på hastigheten för ångdiffusionsfalljämvikt och är mest sant för PEG-baserade fällningsförhållanden. Kristallisationsbetingelserna kommer emellertid att innehålla en mängd olika föreningar som kommer att påverka jämviktstiden. Jämvikten av saltbaserade kristallisationsförhållanden, t.ex. högkoncentrerad ammoniumklorid, kan ske inom 1-2 dagar. Därför kanske 24-timmarskriteriet inte är sant för saltbaserade förhållanden. Saltbaserade förhållanden kan också ha mer komplexa fasdiagram26,30 som kanske inte överensstämmer med arketypen som presenteras i detta protokoll. En minskning av tidskriteriet för saltbaserade förhållanden till 12 eller 6 timmar kan vara nödvändig om det visar sig omöjligt att skala till större volymer.
En annan begränsning av denna metod är dess uppenbara komplexitet. Protokollet som följdes för att optimera mikrokristallisationen av endothiapepsin förändrade faktiskt det ursprungliga tillståndet från glesmatrisskärmen relativt lite. Den första träffen som observerades på PACT-skärmen var 0,1 HEPES pH 7,0, 0,2 M MgCl2 och 20% (w/v) PEG 6 000. Den slutliga skalade kristallisationsbufferten var 0,1 Tris-HCl pH 7,0, 0,15 M MgCl2 och 40% (w/v) PEG 6 000. Det är också mycket möjligt att förändringen i buffert från HEPES till Tris-HCl och MgCl2-koncentration bidrog lite till processens framgång. Att lämna ökningen av PEG 6,000-koncentrationen den enda optimeringen, och en som kunde ha uppnåtts helt enkelt.
Denna bedömning är emellertid också alltför förenklad. Det diskonterar inte bara de problem som uppstår under skalning (dvs. användning av frön och släckning), utan också det faktum att bara för att detta protein visade sig vara enkelt, finns det ingen garanti för att nästa också kommer att visa sig vara. Stegen som rekommenderas i protokollet utformades eftersom optimering av skalningen av proteinkristallisationsvolymer kan vara mycket proteindyrt. Under de sju endothiapepsinskalningsförsök som visas konsumeras 100 mg protein. Visserligen utfördes några av dessa steg för att visa deras konsekvenser mot bakgrund av detta protokoll. Ändå kan 100 mg av ett protein, plus potentiellt ytterligare 50 mg för protein som konsumeras under ett experiment (tabell 1), vara en betydande investering i antingen tid eller pengar.
Lyckligtvis är det inte klart att denna massa av erforderligt prov är allestädes närvarande över alla proteiner. Endothiapepsin var mycket lösligt och krävde därför en stor proteinkoncentration för att nå övermättnad. I andra (för närvarande under optimering) kan övermättnad uppnås vid 10 eller till och med 5 mg / ml. Sådana variabler är proteinspecifika och måste omfamnas när de dyker upp.
Andra begränsningar av metoden inkluderar dess beroende av komplex utrustning som vätskehanteringsrobotar för skärm- och plattskapande och kameror för att automatiskt avbilda plattor vid behov. Alternativa rutiner har erbjudits för att begränsa behovet av vissa av dessa utrustningar, men protokollet blir mer tidskrävande att följa utan dem. Protokollet föreslår också att man testar diffraktionen av optimerade kristaller. För kristallografer utan regelbunden tillgång till en synkrotron kan dessa tester visa sig vara utmanande. Kontroller i varje steg kanske inte är nödvändiga, men dessa tester rekommenderas starkt när en träff har identifierats och före och efter skalning. Icke-diffracting kristaller vid en XFEL är tyvärr inte en ovanlig förekomst. Med tanke på detta är det bättre att fela på försiktighetssidan när det gäller antaganden om kristalldiffraktion.
I slutändan kommer detta protokoll och resultat som presenteras här att erbjuda en guide, idéer och ett exempel för dem som kämpar med att producera prover för seriella kristallografiexperiment. Förhoppningsvis, när seriell kristallografi vidareutvecklas, kommer provkraven för tekniken att minskas så att behovet av protokoll som detta kommer att minska. Men även i denna händelse kommer de strategier som presenteras här fortfarande att vara användbara för dem som vill utforska kristallisationsutrymmet för deras protein.

Rumstemperatur (RT) makromolekylär kristallografi är populär igen inom strukturbiologin. Utvecklingen av röntgenfrielektronlaser (XFEL) ljuskällor har stimulerat utvecklingen av RT-provleveransmetoder 1,2,3,4, och dessa metoder har nu tillämpats på synkrotroner 5,6,7,8. RT-metoder öppnar inte bara möjligheten för experimentella svågstubbar 9,10,11,12, utan det finns också ökande bevis för att de främjar alternativa konformationstillstånd inom proteinerna 13,14,15,16,17.
Den främsta anledningen till att kryometoder fick dragkraft över RT-tillvägagångssätt i slutet av 1990-talet var dock att strålningsskador bromsades av kristalltemperaturer under noll18. Kryometoder19 började möjliggöra insamling av ett komplett dataset från en enda proteinkristall. Moderna RT-metoder vid XFEL och synkrotroner löste problemet med enkristallstrålningsskador genom utveckling av snabba (> 100 Hz) kristallleveransstrategier 1,2,3,4. Dessa metoder möjliggör insamling av en komplett datauppsättning från tusentals individuellt exponerade kristaller. Dessa RT-leveransmetoder kräver därför produktion av stora mängder lösningar som innehåller homogena mikrokristaller (> 100 μL < 50 μm kristaller). Men eftersom kryometoder tenderar att endast kräva enstaka kristaller, är metoder för att skapa sådana mikrokristallina uppslamningar för närvarande inte allestädes närvarande i proteinkristallografilaboratorier.
Det finns exempel i litteraturen på hur man gör delar av mikrokristallisationsoptimeringsproceduren för seriella kristallografiprover. Här bör man skilja mellan membran och lösliga proteiner. Protokoll för att optimera tillväxten av mikromembranproteinkristaller odlade i monoolein (eller någon annan lipid), för lipidisk kubisk fas (LCP), har beskrivits väl 20,21,22. Metoder för mikrokristallisation av lösliga proteiner, inklusive membranproteiner odlade under icke-LCP-förhållanden, saknas dock i allmänhet. Tidigare studier har fokuserat på specifika delar av processen, såsom mikrokristallscreening 23,24, förbättrad kärnbildning24 och skalning med fri gränssnittsdiffusion 25, men inte en komplett metod.
En metod beskrevs docknyligen 26 som försöker erbjuda ett komplett protokoll. Liksom många aspekter av proteinkristallografi är det inte nytt. Många av de föreslagna idéerna beskrevs redan av Rayment (2002)27. Metoden syftar till att visa kristallografer hur man utför omvandlingen från en enda kristall odlad med ångdiffusion, till en batchmetodik för att odla tusentals mikrokristaller. Metoden fokuserar på ångdiffusion som en vanlig utgångspunkt, eftersom 95% av alla Protein Data Bank (PDB) depositioner kommer från kristaller odlade i ångdiffusionsplattor26. Ångdiffusion är dock inte den ideala metoden för mikrokristallisation26, så en metod beskrivs för att omvandla ångdiffusion till satskristallisation. När kristaller kan odlas i batch blir skalningsvägar till större volymer mer praktiska. Med tanke på vagarierna för proteinkristallisering skulle författarna betona att denna metod inte är felsäker. Protokollet bör dock åtminstone ge en inblick i ett proteins "kristallisationsutrymme".
Denna metod bygger på proteinkristallisationsfasdiagrammet och hur en förståelse av det diagrammet kan fungera som en guide under optimering av mikrokristallisation. Ett proteinfasdiagram avbildas vanligen som ett x/y-diagram med utfällnings- och proteinkoncentrationer på x- respektive y-axlarna (figur 1A). Från den rena vattenpunkten (nedre vänstra hörnet - figur 1A) ökar koncentrationen av både protein och fällningsmedel tills löslighetslinjen uppnås. Löslighetslinjen markerar punkten för övermättnad (lila linje - figur 1A). När ett protein övermättas blir lösningen termodynamiskt instabil och börjar separeras i två faser: "proteinrik" och en stabil mättad lösning. Denna separation kan ske var som helst bortom löslighetslinjen och dess kinetik är beroende av proteinets egenskaper och komponenterna i lösningen.
När protein- och fällningskoncentrationerna är för stora sönderdelas proteinet instabilt ur lösningen och resulterar i amorf fällning (rosa område - figur 1A). Ordnad fasseparation kan emellertid ske i kärnbildningsregionen [se Garcia-Ruiz (2003) 28 för detaljerad beskrivning] och kristallnukleanter har benägenhet att bildas (grön region - figur 1A). Kärnbildning och tillväxt tar bort protein från lösningen och flyttar droppen in i den metastabila regionen där tillväxten kan fortsätta tills löslighetslinjen nås [se McPherson and Kuznetsov (2014) 29 för detaljerad diskussion]. Diagrammet är, för de allra flesta kristallisationsförhållanden, en grov förenkling30. Oavsett detta är diagrammet fortfarande till stor nytta för mikrokristallografer, eftersom kartläggningen av diagrammet gör det möjligt att bestämma löslighetslinjen och kinetiken för kärnbildning.
När det gäller att skapa mikrokristaller är de två faktorerna under kristallisation som måste optimeras antalet kristaller (Xn) och deras medel, längsta dimension (Xs). X n kommer att vara proportionell mot antalet kärnbildningshändelser (n ) (Ekv. 1).
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61896/61896fig01v2.jpg">     1 kv.
X s är proportionell mot koncentrationen av fritt protein ovanför löslighetslinjen (Ps) dividerat med Xn (Eq. 2).
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61896/61896eq02.jpg">     Kv. 2
I en perfekt situation skulle varje kärnbildningshändelse ge en möjlig kristall och var och en av dessa kristaller skulle ha lika tillgång till det tillgängliga proteinet i lösning. Figur 2 är en grafisk representation från ett idealiskt scenario av förhållandet mellan Xn och Xs. I praktiken är den huvudsakliga kontrollen en kristallograf har över Xn och Xs genom att påverka mängden kärnbildning eller genom tillsats av frökristaller. Mikrokristallografen måste bedöma hur man ökar Xn så att en lämplig kristallkoncentration och kristallstorlek båda kan skapas.
De flesta kristallisationstekniker kräver en "övergångsperiod" (figur 1B). Till exempel, i ett ångdiffusionsexperiment, vid blandning av protein- och fällningslösningarna, kommer koncentrationerna av var och en att förändras när droppen balanserar med brunnslösningen. Man hoppas att dessa förändringar gradvis kommer att överföra droppen till kärnbildningszonen där benägenheten för kristallisation kommer att öka. När kristaller börjar kärna och växa, kommer mängden protein i lösning att börja falla, vilket minskar sannolikheten för ytterligare kärnbildning. Den ultimata mängden kärnbildning kommer att vara protein- och tillståndsspecifik, och också beroende av penetrationsdjupet i kärnbildningszonen. Med tanke på den begränsade kärnbildningszonpenetrationen av metoder som kräver ett övergångssteg, kommer kärnbildningsnivån i slutändan att begränsas till kärnbildningshastigheten vid gränsen mellan metastabil kärnbildningsregion.
På grund av vikten av att kunna förbättra kärnbildningsnivån för en mikrokristallograf är det viktigt att flytta till en satskristallisationsmetodik. Batch kan dra större nytta av hela kärnbildningsregionen (figur 1C). I batchmetoder är tanken att blanda proteinet och fällningsmedlet så att en övermättad lösning skapas utan att komponentkoncentrationerna behöver förändras. Kärnbildning bör vara möjlig omedelbart efter blandning. Batchmetoder gör det därför möjligt att teoretiskt nå hela kärnbildningszonen. Varje ökning av kärnbildningskinetiken bortom metastabil-kärnbildningsgränsen kan sedan utnyttjas.
Om den basala nivån av kristallkärnbildning inte räcker för att generera en stor Xn kan mikrosåddmetoder användas. Vid mikrosådd bryts förodlade kristaller upp för att skapa en uppslamning av kristallina fragment som kan fungera som en byggnadsställning för färsk kristalltillväxt31,32. Mikrosådd har använts i stor utsträckning vid seriell kristallografisk provberedning som ett sätt att öka Xn utan att behöva öka kristallkärnbildningen (figur 1C).
Övergången från ångdiffusion till sats kan visualiseras på ett fasdiagram som att flytta den experimentella startpunkten från antingen de icke-övermättade eller metastabila regionerna till kärnbildningszonen. Detta kan göras genom att öka protein- och/eller utfällningskoncentrationerna och/eller förhållandet mellan de två i droppen (figur 1D) och observera vilka förhållanden som ger kristaller som uppträder snabbt (< 24 timmar)26. Fullständig jämvikt för ångdiffusionsfall kan ta dagar eller veckor33. Därför, genom att leta efter förhållanden som visar snabbt framträdande kristaller, kan satsförhållanden hittas utan att behöva flytta till alternativa kristallisationsscreeningsformat som mikrosats34,35,36,37.
När kärnbildningszonen har hittats har ett satsförhållande hittats och ett morfogram - här ett grovt fasdiagram - kan skapas. Morfolimet är till stor nytta när man överväger om man ska använda ett seeded-batch eller straight batch-protokoll. Genom att plottaXn som en funktion av proteinet och fällningskoncentrationen kan en bedömning av kärnbildningskinetiken göras26. Om X n förblir låg över hela kärnbildningsområdet kan såddsats krävas för att göra Xn tillräckligt stor för att begränsa kristalltillväxten. Denna bedömning är det första steget i processen att skala till större volymer (> 100 μL).
Denna metod utformades så att den kunde utföras i de flesta kristallisationslaboratorier med hjälp av standard ångdiffusionskristallisationsutrustning. Många studier har också genomförts som beskriver tekniker för att underlätta många delar av denna process, om utrustningen finns tillgänglig. Dessa inkluderar, men är inte begränsade till, dynamisk ljusspridning (DLS) 25,27, icke-linjär avbildning 20,24,25, pulverdiffraktion 20,24,27 och elektronmikroskopi 26 [se Cheng et al. (2020) 40 för en fin recension].
Syftet med detta arbete är att ge en visuell demonstration av metoden för övergång från liten volym (< 500 nL) ångdiffusionskristallisation till stor volym (> 100 μL) satskristallisation. Endothiapepsin från Cryphonectria parasitica har använts som ett exempelsystem för att demonstrera denna översättning. Den typ av experiment och provleveransmetod som mikrokristallerna krävs för kommer att påverka den idealaX-utgången 26. Förblandningsexperiment som kräver en millisekunds tidsupplösning41 eller gasdynamiska virtuella munstycken42 kan ett slutligt X s på < 5 μm vara önskvärt. I det här fallet var målet att producera proteinkristaller som diffrakterar till cirka 1,5 Å, för ett fotonaktiverat pump-sondexperiment, och med hjälp av en fast målleveransmetod.
För att ge en illustration av provkraven för ett sådant seriellt kristallografiexperiment med användning av endothiapepsin, visar tabell 1 de experimentella parametrarna för ett hypotetiskt experiment. Provinformationen baserades på det protokoll som beskrivs nedan. Med tanke på vissa konservativa uppskattningar av träfffrekvenser och datainsamlingskrav är 50 mg den totala provförbrukningsuppskattningen för hela experimentet.
Figur 3 visar ett flödesschema över hela optimeringsprocessen från initial kristallisation av ångdiffusion i liten volym till storskalig sats. För de flesta seriella kristallografiprojekt kommer detta protokoll att börja vid steg 2: "övergång till batch", eftersom målproteinet redan har kristalliserats. Steg 1 har dock inkluderats för fullständighet och för att påminna läsarna om dess betydelse. Att hitta ett tillstånd som ger upphov till en väl diffrakterande, enkel, stor kristall är den bästa utgångspunkten för mikrokristalloptimering. I steg 2 kan detta tillstånd sedan optimeras från ångdiffusion till sats, och ett morfogram av kärnbildningen och metastabila regioner kan plottas. När detta har gjorts kan skalning av batchvillkoret till större volymer utföras i steg 3. I slutet av flödesschemat kommer en kristallograf att ha skapat ett repeterbart, stort volymprotokoll (> 100 μL), mikrokristallisation, batchprotokoll för endothiapepsin. Denna metod kan sedan tillämpas på deras speciella protein av intresse.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Swissci 96-well 2-Drop plates</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD11-002</td>
			<td>96-well 2-drop crystallisation plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swissci 96-well 3-Drop plates</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD11-003</td>
			<td>96-well 3-drop crystallisation plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mosquito LCP liquid handling robot</td>
			<td>sptlabtech</td>
			<td>mosquito LCP</td>
			<td>Crystallisation robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClearVue Sheets</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD6-015</td>
			<td>96-well crystallization plate seals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Tube 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td>1.5 mL centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scaple</td>
			<td>Swan and Morton</td>
			<td>No. 3 scalple and No. 3 handle</td>
			<td>Scalple for cutting open plate seals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS 3 Vortex</td>
			<td>IKA</td>
			<td>3319000</td>
			<td>Vortex for mixing solution and making seed stocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well XRL Plate</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD3-11</td>
			<td>24-well hanging-drop plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube revolver/rotator</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>88881001</td>
			<td>Tube revolver for mixing solution during scaling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Research plus pipettes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>Range of manual pipettes, 0.5-10, 1-20, 10-100, 100-1000 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf pipette tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>Range of tip sizes for manual pipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suparen 600</td>
			<td>Prochem AG</td>
			<td>Suparen 600</td>
			<td>Endothiapepsin solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>241245-1KG</td>
			<td>Sodium Acetate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8382T014</td>
			<td>Tris</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670-1kg</td>
			<td>Magnesium Chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG 6,000</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>81255-1kg</td>
			<td>PEG 6,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethelyene glycol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>324558-1L</td>
			<td>Ethelyene glycol for cyro-protecting the crystals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PACT Premier HT screen</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD1-36</td>
			<td>PACT Premier 96-well crystal screen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOW CORNING high vacuum grease</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD6-02</td>
			<td>Grease for sealing 24-well plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hirschmann 22 x 22 mm glaser cover slides</td>
			<td>Hirschmann</td>
			<td>8000104</td>
			<td>Cover slides for sealing 24-well sitting drop plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal pins</td>
			<td>PSI</td>
			<td>Manufactured inhouse</td>
			<td>Thin-film supports for micro-crystals.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-1.3 mm SiLibeads Type S</td>
			<td>Faust</td>
			<td>6239547</td>
			<td>Glass beads for making mico-seed stocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macbook Pro</td>
			<td>Apple</td>
			<td>Macbook Pro</td>
			<td>Computer for performing data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCP4 software suite</td>
			<td>CCP4</td>
			<td></td>
			<td>Diffraction pattern data processing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>Microsoft Office</td>
			<td>Plotting tool for phase diagram</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hausser Scientific Bright-Line counting chamber</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>02-671-51B</td>
			<td>Tool to calculate crystal concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PACT Premier</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD1-29-ECO</td>
			<td>Sparse-matrix crystallization screen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rock Imager</td>
			<td>Formulatrix</td>
			<td>Rock Imager</td>
			<td>Temperature controlled crystal plate storage and imager</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rock MakerWeb</td>
			<td>Formulatrix</td>
			<td>Rock MakerWeb</td>
			<td>Crystal plate creation and image storage stoftware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formulator</td>
			<td>Formulatrix</td>
			<td>Formulator</td>
			<td>96-well crystal screen creation liquid handling robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica MZ16 Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica MZ16</td>
			<td>Light microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS V4.6</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LAS V4.6</td>
			<td>Software for Leica microscopes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectra/Por 3.5 kDa dialysis tubing</td>
			<td>Spectrumlabs</td>
			<td>Spectra/Por 3 Dialysis Membrane</td>
			<td>3.5 kDa dialysis membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing closures</td>
			<td>Spectrumlabs</td>
			<td>Spectra/Por 3 Duniversal Closures</td>
			<td>Clips to seal the dialysis tubing ends</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon 10 kDa centrifugal concentrator</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>Amicon Ultra-15 10 kDa centrifugal concentrator</td>
			<td>10 kDa centrifugal filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5810 R swing bucket centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810 R Centrifuge</td>
			<td>Swing bucket centrifuge</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimizing the growth of endothiapepsin crystals for serial crystallography experiments

Här presenteras ett protokoll för att underlätta skapandet av stora volymer (> 100 μL) mikrokristallina uppslamningar lämpliga för seriella kristallografiexperiment vid både synkrotroner och XFEL. Metoden bygger på en förståelse av proteinkristallfasdiagrammet, och hur den kunskapen kan utnyttjas. Metoden är indelad i tre steg: (1) optimering av kristallmorfologi, (2) övergång till batch och (3) skalning. Steg 1 innebär att hitta väl diffrakterande, enstaka kristaller, förhoppningsvis men inte nödvändigtvis, som presenterar i en kubliknande morfologi. I steg 2 optimeras steg 1-tillståndet av kristalltillväxttiden. Denna strategi kan omvandla kristaller som odlas genom ångdiffusion till sats. När kristalltillväxt kan ske inom cirka 24 timmar kan ett morfogram av proteinet och fällningsblandningen plottas och användas som grund för en skalningsstrategi (steg 3). När kristaller kan odlas i batch kan skalning försökas och kristallstorleken och koncentrationen optimeras när volymen ökar. Endothiapepsin har använts som demonstrationsprotein för detta protokoll. Några av de beslut som presenteras är specifika för endothiapepsin. Förhoppningen är dock att det sätt på vilket de har tillämpats kommer att inspirera till ett sätt att tänka på detta förfarande som andra kan anpassa till sina egna projekt.

Watch this Scientific Journal Video about Optimizing the Growth of Endothiapepsin Crystals for Serial Crystallography Experiments at JoVE.com

Optimizing the Growth of Endothiapepsin Crystals for Serial Crystallography Experiments

Syftet med denna artikel är att ge betraktaren en gedigen förståelse för hur man omvandlar sitt ångdiffusionsprotokoll med liten volym, för odling av stora, enkla proteinkristaller, till en mikrokristallisationsmetod för stor volym för seriell kristallografi.

Optimera tillväxten av endotiapepsinkristaller för seriella kristallografiexperiment

Here, a protocol is presented to facilitate the creation of large volumes (&#62; 100 &#181;L) of micro-crystalline slurries suitable for serial ...

Seriella kristallografiexperiment kan vara utmanande. Ett viktigt hinder i deras praktik är skapandet av mikrokristallina prover. Detta protokoll visar hur sådana prover kan skapas på ett tillförlitligt sätt.Denna metod använder endiapepsin för att ge ett ramverk för att optimera stora kristaller odlade i små volymer ångdiffusionsplattor till mikrokristallina uppslamningar med stor volym. Vi kan inte hävda att detta protokoll kommer att bli universellt framgångsrikt. Vi hoppas dock att de idéer och metoder som föreslås här ger andra en experimentell ram att använda på andra proteiner.För att börja, förbered en två-droppe 96-brunnsplatta med kristallisationsbufferten med hjälp av Formulatrix-roboten. Blanda 150 nanoliter nytinat endothiapepsin med 150 nanoliter kristallisationsbuffert i varje brunn med hjälp av en vätskehanteringsrobotblandning. Försegla plattan och låt kristallerna växa i 24 timmar inne på Formulatrix Hotel.Efter 24 timmar, bryt upp och ta bort kristallerna från fem brunnar på 96-brunnskristallisationsplattan. Placera dem i 250 mikroliter kristallisationsbuffert i ett 1,5 ml centrifugrör placerat i en ishink. Tillsätt 10 till 15 glaspärlor av en millimeterstorlek i centrifugröret.Virvla kristallerna och pärlorna vid 1000 varv / min i 30 sekunder och byt ut dem på is i 30 sekunder. Fröna kan sedan användas direkt eller lagras vid minus 20 grader Celsius. För att utföra ett morfogramexperiment, tillsätt fem till 40% koncentrationer av PEG 6000 med en molär Tris-HCl vid pH sju och 0,15 molar magnesiumklorid längs plattkolonnerna i en två-droppe 96-brunns gallerskärm Reparera en sekventiell utspädning av endiapepsin i 0,1 molar natriumacetat från 100 till 12,5 milligram per milliliter över åtta steg.Pipettera sedan åtta mikroliter av varje utspädning följt av två mikroliter frömassa i vätskehanteringsrobotplattan. Använd en vätskehanteringsrobot och fördela 150 nanoliter av varje utspädning av endotiapepsin i delbrunnarna ett och två på skärmen. Multiaspirera 50 nanoliter tinat frölager och 100 nanoliter av brunnslösningen från delbrunn två och fördela båda i proteinlösningen.Blanda lösningar tre gånger efter tillsats av kristallisationsbufferten eller kristallisationsbufferten och fröblandningen. Försegla nu plattan och bilden vid noll, tre, sex, 12, 18 och 24 timmar den första dagen varje dag under den första veckan och varje vecka under de kommande fyra veckorna vid 20 grader Celsius. Efter 24 timmar, titta på plattan under ett mikroskop, uppskatta antalet kristaller i varje brunn och mäta ett prov av kristallerna.Registrera dessa uppskattningar i det tillhandahållna kalkylbladet för morfogramgeneratorn. Ange startkoncentrationerna av endothiapepsin och PEG 6000 i lämpliga lådor. Kalkylbladet plottar automatiskt resultaten i det traditionella fasdiagramformatet med fällnings- och proteinkoncentrationerna på X- respektive Y-axeln.Brunnsförhållanden som endast ger upphov till kristaller i sina sådda droppar indikerar diagrammets MetaStable-region, medan förhållanden med kristaller i både de sådda och icke-seedade dropparna indikerar kärnbildningszonen. Från morfogramanalysen väljer du det mest lovande tillståndet för skalning till 24 brunnsplattor. Börja sedan med 100 milligram per milliliter endotiapepsin och 35% PEG 6000.Förbered fem milliliter kristallisationsbuffert med 35% PEG 6000, 0,1 molar Tris-HCl med pH sju och 0,15 molar magnesiumklorid. Placera nu 0,5 ml kristallisationsbuffert i tre brunnar på en smord 24-brunns hängande droppplatta. Blanda 15 mikroliter endothiapepsin med 15 mikroliter kristallisationslösning på en glaslockslip.Placera lösningen över brunnarna och lämna plattan i 24 timmar. Efter 24 timmar, titta på plattan under ett mikroskop, uppskatta antalet kristaller i droppen och mäta deras storlek. Om kristallerna är felaktiga, upprepa detta steg, men ändra proteinkoncentrationen eller tillsätt frön om kristallkärnbildningen inte är tillräckligt hög.Upprepa skalningsexperimentet med 24 brunnar genom att tillsätta frön i en högre koncentration av PEG 6000. Placera 0,5 ml av den nya kristallisationsbufferten i tre brunnar på en smord 24-brunns hängande droppplatta. Placera 15 mikroliter endothiapepsin på en glaslockslip och blanda fem mikroliter fröstam och 10 mikroliter kristallisationslösning med endothiapepsinlösningen.Invertera locket glider, placera dem över brunnarna och låt stå i 24 timmar. Kontrollera dropparna igen för att se om kristallerna är mindre och har en högre koncentration. Uppskatta antalet kristaller i droppen och mät deras storlek igen för att se om de nu har rätt storlek.För att utföra ett fröat batchprotokoll, förbered kristallisationsbufferten på 40% PEG 6000, 0,1 molar Tris-HCl med ett pH av sju och 0,15 molar magnesiumklorid. Förblanda 50 mikroliter fröstam och 100 mikroliter kristallisationslösning och blanda med proteinlösning i 1,5 ml centrifugrör. Vortex röret i 10 sekunder och placera det på en vippa eller shaker vid 20 grader Celsius.Ta en alikvot på 2,5 mikroliter av satslösningen var 20:e minut. Övervaka kristallernas storlek och antal med hjälp av en hemocytometer. Räkna antalet kristaller och mäta deras storlek under mikroskopet.När kristallerna har nått cirka 15 mikrondimension, släck reaktionen med 150 mikroliter 0,5 molar natriumacetat kompletterat med 0,5 molar Tris-HCl, 0,075 molar magnesiumklorid och 20% PEG 6000. Kontrollera kristallstorleken och koncentrationen igen med hemocytometern. Förvara kristallerna vid 20 grader Celsius.Endothiapepsin morphogram-analysen föreslog att kärnbildning påverkades av både protein- och fällningskoncentrationer. MetaStable-, kärnbildnings- och nederbördsregionerna i diagrammet kan särskiljas snyggt. Tillsatsen av frön ökade kristallantalet avsevärt jämfört med droppar utan frön.Analys av endothiapepsin-mikrokristallisationen i 200 till 300 mikrolitervolymer avslöjade förändringarna i kristallkärnbildning och den längsta dimensionen över tiden. Att öka PEG-koncentrationen till 35% förbättrade kristallisationen markant, med en slutlig kristallkoncentration på cirka 3,6 gånger 10 till sex per milliliter och den längsta kristalldimensionen på 42 mikrometer. För att minska storleken på de slutliga kristallerna tillämpades en proteinkoncentrationsreduktionsmetod, vilket tyvärr minskade kristallkoncentrationen avsevärt och slutligen producerade ännu större kristaller.Tillvägagångssättet att öka PEG-koncentrationen till 40% gav emellertid kristaller cirka 3,1 gånger 10 till sex per milliliter och en storlek på cirka 39 mikrometer. Vidare ledde tillsats av frön till en signifikant ökning av kristallkoncentrationen, cirka 1,1 gånger 10 till åtta per milliliter och mindre dimensioner på cirka 4,2 mikrometer. Den släckningseffekt som försöktes i kristallisationsreaktionen gav en slutlig kristallkoncentration på cirka 2,6 gånger 10 till sex per milliliter och en storlek på cirka 15 mikrometer.CC-halvan plottad mot upplösningen från röntgendata visade en liten minskning av kristallupplösningen från 10 mikroliter till 200 till 300 mikrolitervolymer. Kristallen diffrakterade dock fortfarande till 1,5 angstrum, vilket ansågs tillräckligt. Endothiapepsin är ett förlåtande protein att arbeta med.Vi hoppas att prova detta protokoll av endothiapepsin kommer att generera användbara idéer och metoder för andra proteiner. Särskilt med kristallografi är det fördelaktigt att se hur saker ser ut och känns snarare än att bara försöka följa ett skriftligt protokoll. Den här videon kommer förhoppningsvis att ge dig en del av den känslan.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography

Beredning och leverans av protein mikrokristaller i lipida kubiska fasen för Serial Femtosecond Kristallografi

Membrane proteins (MPs) are essential components of cellular membranes and primary drug targets. Rational drug design relies on precise structural ...

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

Automatiserad Acoustic Utlämning för serieutspädning av peptidagonister i Styrka Fastställande Analyser

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

Mikrokristallografi av proteinkristaller och<em&gt; I Cellulo</em&gt; Diffraktion

The advent of high-quality microfocus beamlines at many synchrotron facilities has permitted the routine analysis of crystals smaller than 10 &#181;m in ...

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Växande proteinkristaller med olika dimensioner med automatiserad kristallisering tillsammans med In Situ det dynamiska ljusspridning

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

Karakterisering av glykoproteiner med immunglobulin luckan av röntgenkristallografi och biofysiska tekniker

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

En allt-i-ett-provhållare för makro molekyl ära röntgenkristallografi med minimal bakgrunds spridning

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

X-Ray Kristallografi att studera oligomeric staten Övergång av Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

The M42 aminopeptidases form functionally active complexes made of 12 subunits. Their assembly process appears to be regulated by their metal ion ...

Derivatization of Protein Crystals with I3C using Random Microseed Matrix Screening

Derivatisering av Protein kristaller med I3C med hjälp av Random Microseed Matrix Screening

Protein structure elucidation using X-ray crystallography requires both high quality diffracting crystals and computational solution of the diffraction ...

Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip

Kristallisering och strukturell bestämning av ett enzym:Substratkomplex genom seriell kristallografi i ett mångsidigt mikrofluidiskt chip

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We ...

Workflow and Tools for Crystallographic Fragment Screening at the Helmholtz-Zentrum Berlin

Arbetsflöde och verktyg för kristallografisk fragmentscreening på Helmholtz-Zentrum Berlin

Fragment screening is a technique that helps to identify promising starting points for ligand design. Given that crystals of the target protein are ...