Name: optimizing the growth of endothiapepsin crystals for serial crystallography experiments
Uploaded: 2021-02-04T12:30:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimizing the Growth of Endothiapepsin Crystals for Serial Crystallography Experiments at JoVE.com

Bu proje, Marie Skłodowska-Curie hibe anlaşması No 701647 kapsamında Avrupa Birliği'nin Horizon 2020 araştırma ve inovasyon programından finansman almıştır. İsviçre Işık Kaynağı ışın hattı X10SA-PXII'deki ışın çizgisi bilim adamlarının yardımı ve desteği için çok teşekkürler.

Yazarların açıklayacak çıkar çatışmaları yoktur.

Sunulan yöntem, seyrek matrisli 96 delikli eleklerde yetiştirilen büyük kristallerden (≥ 100 μm en uzun boyut) endotiyapepsinin, santrifüj tüplerinde (300 μL hacim) yetiştirilen mikro kristallere kadar kristalleşmesinin parti yoluyla nasıl optimize edileceğini göstermektedir. Protokolün arkasındaki fikir, endotiapepsini optimize etmek için atılan adımların diğer proteinler için de kullanılabileceğidir. Sonuçta, XFEL'lerde ve senkrotronlarda seri kristalografi deneyleri için büyük hacimli (>100 μL) mikro kristaller (10-20 μm) oluşturma problemine cevap vermek.
Protokol, büyük hacimli mikro-kristalizasyon görevini üç adıma ayırır: (1) Kristal morfolojisini optimize etmek, (2) Toplu işleme geçiş ve (3) Ölçeklendirme. Adım 1'de, bir proteinin oluşturabileceği kristal formlarının aralığı, buhar difüzyon plakalarında araştırılmalıdır. Gerekli çözünürlüğe kırılan tek, kutu benzeri kristallere yol açan koşullar hedef olmalıdır. Adım 2'de, seçilen koşullar daha sonra buhar difüzyonundan partiye dönüştürülebilir. Burada optimizasyon kriteri kristal büyüme süresi ve 24 saat içinde protein kristallerine yol açan koşulları bulmaktır. Deneyciye çözünürlük çizgisinin yeri ve çekirdeklenme bölgesi sınırları hakkında bir fikir veren bir morfogram da çizilebilir. Bu morfogram, Adım 3, Ölçekleme'de büyük fayda sağlar. Morfogram, çekirdeklenmenin tek başına Xn'yi artırıp artıramayacağının ve Xs'yi aşağı çekip çekemeyeceğinin bir göstergesi olacaktır. Deneyin hacmi arttıkça, Xn ve Xs , ölçekleme başarısının temel kriterleri olarak sürekli olarak değerlendirilebilir.
Endotiyapepsin durumunda, Adım 1, endotiyapepsin için potansiyel olarak daha önce bilinmeyen bir kristal morfolojisinin ne olduğunu ortaya çıkardı. Bu morfoloji, daha önce bildirilenlerle aynı uzay grubuna sahipti, ancak seri kristalografi için daha önemli olan, daha kutu benzeri bir şekle sahipti. Tek kristaller, diğer koşullardan oluşturulan fanların aksine, tek çekirdeklenme noktalarından da büyüyor gibi görünüyordu (Şekil 4). Seçilen koşul için, kristal büyümesi < 24 saatte gerçekleştiği için Adım 2 zaten kısmen tatmin olmuştu. Morfogram, Adım 3'te ölçeklendirme yaparken hem düz hem de tohumlu toplu iş protokolünün başarılı olabileceğini gösterdi. Düz partideki ilk ölçekleme, sırasıyla 3.6 ± 1.2 x 106 kristal · mL-1 ve 42 ± 4.1 μm Xn ve Xs aralığına sahip kristaller üreten bir koşul yarattı. Bu kristaller, bazı seri kristalografi deneyleri için kabul edilebilir olmasına rağmen, çok büyük kabul edildi. Böylece ek optimizasyonlar yapıldı. Son protokol, sırasıyla 3.1 x 106 kristal · mL-1 ve 15 ± 3.9 μm konsantrasyon ve boyut aralığına sahip kristaller üretti. Bu, planlanan deneyler için ideal olandan daha fazlasıydı.
Yöntem, buhar difüzyon plakalarında yetiştirilen 'çözünür' protein kristallerinin partiye dönüştürülmesine odaklanmaktadır. Bu odaklanmanın nedeni, çözünür protein kristallerinin büyük çoğunluğunun buhar difüzyonu 26 yoluyla yetiştirilmesidir. Bununla birlikte, sunulan kavramlar, mikro-batch gibi diğer yöntemler kullanılarak yetiştirilen çözünür protein kristallerine de uygulanabilir. Kavramlar, LCP'de yetiştirilen membran protein kristallerine de uygulanabilir; çünkü bu da bir toplu kristalizasyon işlemidir.
Protokolün önemli bir yönü, buhar difüzyon plakalarında yetiştirilen kristallerin koşullarını, toplu olarak yetiştirilebilecek şekilde dönüştürme işlemidir. Bu dönüşüm için yöntem, Beale et al. (2019)26 tarafından önerilen kriteri kullanır. Bir parti işlemi ile yetiştirilen kristaller, buhar difüzyon plakalarında bile, hızla oluşacaktır (< 24 saat). Bu kriter, buhar difüzyon damlası dengesinin hızına dayanan bir yaklaşımdır ve PEG bazlı çökeltici koşulları için en doğru olanıdır. Bununla birlikte, kristalleşme koşulları, dengelenme süresini etkileyecek çok çeşitli bileşikler içerecektir. Tuz bazlı kristalleşme koşullarının, örneğin yüksek konsantrasyonlu amonyum klorürün dengelenmesi, 1-2 gün içinde gerçekleşebilir. Bu nedenle, 24 saat kriteri tuz bazlı koşullar için doğru olmayabilir. Tuz bazlı koşullar ayrıca bu protokolde sunulan arketipe uymayabilecek daha karmaşık faz diyagramları 26,30'a sahip olabilir. Tuz bazlı koşullar için zaman kriterinin 12 veya 6 saate düşürülmesi, daha büyük hacimlere ölçeklendirmenin imkansız olduğu kanıtlanırsa gerekli olabilir.
Bu yöntemin bir başka sınırlaması da belirgin karmaşıklığıdır. Endotiapepsinin mikro-kristalizasyonunu optimize etmek için izlenen protokol aslında orijinal durumu seyrek matris ekranından nispeten az değiştirdi. PACT ekranında gözlenen ilk vuruş 0.1 HEPES pH 7.0, 0.2 M MgCl2 ve% 20 (w / v) PEG 6.000 idi. Son ölçekli kristalizasyon tamponu 0.1 Tris-HCl pH 7.0, 0.15 M MgCl2 ve% 40 (w / v) PEG 6.000 idi. Tampondaki HEPES'ten Tris-HCl'ye ve MgCl2 konsantrasyonuna olan değişimin prosesin başarısına çok az katkıda bulunması da çok olasıdır. PEG 6.000 konsantrasyonundaki artışı tek optimizasyon olarak bırakmak ve oldukça basit bir şekilde elde edilebilecek bir optimizasyon.
Bununla birlikte, bu değerlendirme de çok basittir. Sadece ölçeklendirme sırasında karşılaşılan sorunları (yani, tohum kullanımı ve söndürme) değil, aynı zamanda bu proteinin basit olduğu kanıtlandığı için, bir sonrakinin de kanıtlayacağının garantisi olmadığı gerçeğini de göz ardı eder. Protokolde önerilen adımlar, protein kristalleşme hacimlerinin ölçeklendirilmesini optimize etmek çok protein pahalı olabileceğinden tasarlanmıştır. Gösterilen yedi endotiyapepsin ölçekleme denemesi boyunca, 100 mg protein tüketildi. Kuşkusuz bu adımların bazıları, bu protokol ışığında sonuçlarını göstermek için gerçekleştirilmiştir. Buna rağmen, 100 mg bir protein, artı bir deney sırasında tüketilen protein için potansiyel olarak 50 mg daha fazla (Tablo 1), zaman veya para için önemli bir yatırım olabilir.
Neyse ki, gerekli numunenin bu kütlesinin tüm proteinlerde her yerde bulunduğu açık değildir. Endotiapepsin yüksek oranda çözünürdü ve bu nedenle aşırı doygunluğa ulaşmak için büyük bir protein konsantrasyonu gerektiriyordu. Diğerlerinde (şu anda optimizasyon altında), aşırı doygunluğa 10 veya hatta 5 mg / mL'de ulaşılabilir. Bu tür değişkenler proteine özgüdür ve ortaya çıktıklarında kucaklanmaları gerekir.
Yöntemin diğer sınırlamaları arasında, ekran ve plaka oluşturma için sıvı taşıma robotları ve gerektiğinde plakaları otomatik olarak görüntülemek için görüntüleyiciler gibi karmaşık ekipmanlara güvenmesi yer almaktadır. Bu ekipmanların bazılarının ihtiyacını sınırlamak için alternatif rutinler önerilmiştir, ancak protokolün onlarsız takip edilmesi daha fazla zaman alacaktır. Protokol ayrıca optimize edilmiş kristallerin kırınımını test etmeyi önerir. Bir senkrotrona düzenli erişimi olmayan kristalograflar için, bu testler zor olabilir. Her adımdaki kontroller gerekli olmayabilir, ancak bu testler bir isabet belirlendikten sonra ve ölçeklendirme öncesi ve sonrası şiddetle tavsiye edilir. Bir XFEL'deki kırınım yapmayan kristaller, ne yazık ki, nadir görülen bir olay değildir. Bu göz önüne alındığında, kristal kırınım hakkındaki varsayımlarla ilgili olarak dikkatli olmak daha iyidir.
Nihayetinde, burada sunulan bu protokol ve sonuçlar, seri kristalografi deneyleri için numune üretmekle mücadele edenlere bir rehber, fikirler ve bir örnek sunacaktır. Umarım, seri kristalografi daha da geliştirildikçe, tekniğin numune talepleri azalır, böylece bunun gibi protokollere olan ihtiyaç azalır. Bununla birlikte, bu olayda bile, burada sunulan stratejiler, proteinlerinin kristalleşme alanını keşfetmek isteyenler için hala yararlı olacaktır.

Oda sıcaklığı (RT) makromoleküler kristalografi, yapısal biyoloji topluluğunda tekrar popülerdir. X-ışını Serbest Elektron Lazer (XFEL) ışık kaynaklarının geliştirilmesi, RT numune dağıtım yaklaşımlarının 1,2,3,4'ün geliştirilmesini teşvik etmiştir ve bu yöntemler şimdi senkrotronlar 5,6,7,8'e uygulanmıştır. RT yöntemleri sadece 9,10,11,12 pompa-prob deneysel stragetiesolasılığını açmakla kalmaz, aynı zamandaproteinler 13,14,15,16,17 içindeki alternatif konformasyonel durumları desteklediklerine dair kanıtlar da vardır.
Bununla birlikte, kriyo-yöntemlerin 1990'ların sonlarında RT yaklaşımları üzerinde çekiş kazanmasının başlıca nedeni, sıfırın altındaki kristal sıcaklıkları18 ile radyasyon hasarının yavaşlamasıydı. Kriyo-yöntemler19, tek bir protein kristalinden tam bir veri kümesinin toplanmasına izin vermeye başladı. XFEL'lerdeki ve senkrotronlardaki modern RT yöntemleri, hızlı (> 100 Hz) kristal dağıtım stratejilerinin geliştirilmesiyle tek kristalli radyasyon hasarı sorununu çözdü 1,2,3,4. Bu yöntemler, ayrı ayrı maruz kalan binlerce kristalden tam bir veri kümesinin toplanmasına izin verir. Bu nedenle bu RT dağıtım yaklaşımları, homojen mikro kristaller (> 100 μL < 50 μm kristal) içeren büyük miktarlarda çözeltilerin üretilmesini gerektirir. Bununla birlikte, kriyo-yöntemler sadece tek kristaller gerektirme eğiliminde olduğundan, bu tür mikro-kristalin bulamaçlar oluşturma yöntemleri şu anda protein kristalografi laboratuvarlarında her yerde bulunmamaktadır.
Literatürde, seri kristalografi örnekleri için mikro-kristalizasyon optimizasyon prosedürünün bölümlerinin nasıl yapılacağına dair örnekler vardır. Burada, membran ve çözünür proteinler arasında bir ayrım yapılmalıdır. Lipidik kübik faz (LCP) için monoolein (veya başka bir lipit) içinde yetiştirilen mikro-membran protein kristallerinin büyümesini optimize etmek için protokolleriyi tanımlanmıştır 20,21,22. Bununla birlikte, LCP olmayan koşullarda yetiştirilen membran proteinleri de dahil olmak üzere çözünür proteinlerin mikro-kristalizasyonu için yöntemler genellikle eksiktir. Önceki çalışmalar, mikro-kristal tarama 23,24, çekirdeklenme 24'ün arttırılması ve serbest arayüz difüzyonu 25 kullanılarak ölçeklendirme gibi sürecin belirli bölümlerine odaklanmıştır, ancak tam bir yöntem değildir.
Bununla birlikte, yakın zamanda tam bir protokol sunmaya çalışan26 yöntem tanımlanmıştır. Protein kristalografisinin birçok yönü gibi, yeni değildir. Önerilen fikirlerin çoğu Rayment (2002)27 tarafından zaten tanımlanmıştır. Yöntem, kristalograflara, buhar difüzyonu kullanılarak yetiştirilen tek bir kristalden, binlerce mikro kristali büyütmek için bir parti metodolojisine dönüşümün nasıl gerçekleştirileceğini göstermeyi amaçlamaktadır. Yöntem, ortak bir başlangıç noktası olarak buhar difüzyonuna odaklanmaktadır, çünkü tüm Protein Veri Bankası (PDB) birikimlerinin% 95'i buhar difüzyon plakalarında yetiştirilen kristallerden gelmektedir26. Bununla birlikte, buhar difüzyonu, mikro-kristalizasyon26 için ideal bir yöntem değildir, bu nedenle buhar difüzyonunu toplu kristalizasyona dönüştürmek için bir metodoloji açıklanmaktadır. Kristaller toplu olarak yetiştirilebildikten sonra, daha büyük hacimlere ölçeklendirme yolları daha pratik hale gelir. Protein kristalizasyonunun değişkenlikleri göz önüne alındığında, yazarlar bu yöntemin başarısız olmadığını vurgulayacaktır. Bununla birlikte, protokol, en azından, bir proteinin "kristalleşme alanı" hakkında bir fikir vermelidir.
Bu yöntem, protein kristalleşme faz diyagramına ve bu diyagramın anlaşılmasının mikro-kristalleşme optimizasyonu sırasında nasıl bir rehber görevi görebileceğine dayanır. Bir protein faz diyagramı genellikle sırasıyla x ve y eksenlerinde çökeltici ve protein konsantrasyonlarına sahip bir x / y grafiği olarak tasvir edilir (Şekil 1A). Saf su noktasından (sol alt köşe - Şekil 1A), çözünürlük çizgisine ulaşılana kadar hem protein hem de çökeltici konsantrasyonu artar. Çözünürlük çizgisi aşırı doygunluk noktasını işaretler (mor çizgi - Şekil 1A). Bir protein aşırı doymuş olduğunda, çözelti termodinamik olarak kararsız hale gelir ve iki faza ayrılmaya başlar: 'protein bakımından zengin' ve kararlı bir doymuş çözelti. Bu ayırma, çözünürlük çizgisinin ötesinde herhangi bir yerde meydana gelebilir ve kinetiği, proteinin özelliklerine ve çözeltinin bileşenlerine bağlıdır.
Protein ve çökeltici konsantrasyonları çok büyük olduğunda, protein kararsız bir şekilde çözeltiden ayrışacak ve amorf çökelti ile sonuçlanacaktır (pembe bölge - Şekil 1A). Bununla birlikte, çekirdeklenme bölgesinde sıralı faz ayrımı meydana gelebilir [ayrıntılı açıklama için Garcia-Ruiz (2003)28'e bakınız] ve kristal çekirdeklerin oluşma eğilimi vardır (yeşil bölge - Şekil 1A). Çekirdeklenme ve büyüme, proteini çözeltiden uzaklaştırır ve düşüşü, çözünürlük çizgisine ulaşılana kadar büyümenin devam edebileceği metastabil bölgeye taşır [ayrıntılı tartışma için McPherson ve Kuznetsov (2014)29'a bakınız]. Diyagram, kristalleşme koşullarının büyük çoğunluğu için, brüt bir aşırı basitleştirme30'dur. Bununla birlikte, bundan bağımsız olarak, diyagramın haritalanması, çözünürlük çizgisinin ve çekirdeklenmenin kinetiğinin belirlenmesine izin verdiği için diyagram mikro-kristalograflar için hala büyük bir faydaya sahiptir.
Mikro kristaller oluşturma açısından, kristalleşme sırasında optimize edilmesi gereken iki faktör, kristallerin sayısı (Xn) ve ortalama, en uzun boyutlarıdır (Xs). X n, çekirdeklenme olaylarının sayısı (n ) ile orantılı olacaktır (Eq. 1).
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61896/61896fig01v2.jpg">     Ek. 1
X s, çözünürlük çizgisinin (Ps) üzerindeki serbest protein konsantrasyonunun Xn'ye bölünmesiyle orantılıdır (Eq. 2).
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61896/61896eq02.jpg">     Ek. 2
Mükemmel bir durumda, her çekirdeklenme olayı olası bir kristal üretecek ve bu kristallerin her biri, çözeltideki mevcut proteine eşit erişime sahip olacaktır. Şekil 2 , Xn ve Xs arasındaki ilişkinin ideal bir senaryosundan grafiksel bir gösterimdir. Pratik olarak, bir kristalografın Xn ve Xs üzerinde sahip olduğu temel kontrol, çekirdeklenme miktarını etkilemek veya tohum kristallerinin eklenmesidir. Mikro-kristalograf, Xn'nin nasıl arttırılacağına karar vermelidir, böylece uygun bir kristal konsantrasyonu ve kristal boyutu oluşturulabilir.
Kristalleşme tekniklerinin çoğunluğu bir "geçiş dönemi" gerektirir (Şekil 1B). Örneğin, bir buhar difüzyon deneyinde, protein ve çökeltici çözeltileri karıştırıldıktan sonra, damla kuyu çözeltisi ile dengelendikçe her birinin konsantrasyonları değişecektir. Bu değişikliklerin, düşüşün yavaş yavaş kristalleşme eğiliminin artacağı çekirdeklenme bölgesine geçeceği umulmaktadır. Kristaller çekirdeklenmeye ve büyümeye başladıkça, çözeltideki protein miktarı düşmeye başlayacak ve daha fazla çekirdeklenme olasılığını azaltacaktır. Nihai çekirdeklenme miktarı protein ve duruma özgü olacak ve ayrıca çekirdeklenme bölgesine nüfuz etme derinliğine bağlı olacaktır. Bir geçiş adımı gerektiren yöntemlerin sınırlı nükleasyon bölgesi penetrasyonu göz önüne alındığında, çekirdeklenme seviyesi nihayetinde metastabil çekirdeklenme bölgesi sınırındaki çekirdeklenme oranı ile sınırlı olacaktır.
Bir mikro-kristalograf için çekirdeklenme seviyesini artırabilmenin önemi nedeniyle, bir parti kristalizasyon metodolojisine geçmek önemlidir. Parti tüm çekirdeklenme bölgesinden daha fazla yararlanabilir (Şekil 1C). Parti yöntemlerinde fikir, protein ve çökelticiyi birlikte karıştırmaktır, böylece bileşen konsantrasyonlarında herhangi bir değişikliğe gerek kalmadan aşırı doymuş bir çözelti oluşturulur. Çekirdeklenme, karıştırıldıktan hemen sonra mümkün olmalıdır. Bu nedenle parti yöntemleri, tüm çekirdeklenme bölgesine teorik olarak ulaşılmasını sağlar. Metastabil nükleasyon sınırının ötesinde nükleasyon kinetiğindeki herhangi bir artış daha sonra kullanılabilir.
Kristal çekirdeklenmenin bazal seviyesi büyük bir Xn üretmek için yeterli değilse, mikro tohumlama yöntemleri kullanılabilir. Mikro tohumlamada, önceden yetiştirilmiş kristaller, taze kristal büyümesi için bir iskele görevi görebilecek kristalin parçalardan oluşan bir bulamaç oluşturmak için parçalanır31,32. Mikro tohumlama, seri kristalografik numune hazırlamada, kristal çekirdeklenmeyi arttırmaya gerek kalmadanXn'yi arttırmanın bir yolu olarak yaygın olarak kullanılmaktadır (Şekil 1C).
Buhar difüzyonundan partiye geçiş, deneysel başlangıç noktasını aşırı doymamış veya metastabil bölgelerden çekirdeklenme bölgesine taşımak olarak bir faz diyagramı üzerinde görselleştirilebilir. Bu, protein ve / veya çökeltici konsantrasyonlarını ve / veya ikisinin damla içindeki oranını artırarak (Şekil 1D) ve hangi koşulların kristallerin hızla ortaya çıktığını gözlemleyerek (< 24 saat)26 yapılabilir. Tam buhar difüzyon damlası dengesi günler veya haftalar sürebilir33. Bu nedenle, hızla ortaya çıkan kristalleri gösteren koşulları arayarak, parti koşulları, mikro-parti34,35,36,37 gibi alternatif kristalizasyon tarama formatlarına geçmek zorunda kalmadan bulunabilir.
Çekirdeklenme bölgesi bulunduktan sonra, bir parti durumu bulunur ve bir morfogram - burada, kaba bir faz diyagramı - oluşturulabilir. Morfogram, tohumlu parti veya düz parti protokolünün kullanılıp kullanılmayacağını düşünürken büyük yarar sağlar. Xn'yi protein ve çökeltici konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak çizerek, nükleasyon kinetiğinin bir değerlendirmesi yapılabilir26. Xn , tüm çekirdeklenme bölgesinde düşük kalırsa, Xn'yi kristal büyümesini sınırlayacak kadar büyük yapmak için tohumlanmış parti gerekebilir. Bu değerlendirme, daha büyük hacimlere (> 100 μL) ölçeklendirme işleminin ilk adımıdır.
Bu yöntem, kristalizasyon laboratuvarlarının çoğunda standart buhar difüzyon kristalizasyon ekipmanı kullanılarak gerçekleştirilebilecek şekilde tasarlanmıştır. Ekipmanın mevcut olması durumunda, bu sürecin birçok bölümünü kolaylaştıracak teknikleri tanımlayan birçok çalışma da yapılmıştır. Bunlar, bunlarla sınırlı olmamak üzere, dinamik ışık saçılması (DLS) 25,27, doğrusal olmayan görüntüleme 20,24,25, toz kırınım 20,24,27 ve elektron mikroskobu 26'yı içerir [güzel bir inceleme için bkz.
Bu çalışmanın amacı, küçük hacimli (< 500 nL) buhar difüzyon kristalizasyonundan büyük hacimli (> 100 μL) parti kristalizasyonuna geçiş yönteminin görsel bir gösterimini sağlamaktır. Cryphonectria parasitica'dan endotiapepsin, bu çeviriyi göstermek için örnek bir sistem olarak kullanılmıştır. Mikro kristallerin gerekli olduğu deney türü ve numune dağıtım yöntemi, ideal Xs çıktısınıetkileyecektir 26. Milisaniye zaman çözünürlüğü41 veya gaz-dinamik sanal nozullar42 gerektiren karıştırma deneyleri için, < 5 μm'lik bir son Xs istenebilir. Bu durumda amaç, fotonla aktive edilen bir pompa-prob deneyi için ve sabit hedefli bir dağıtım yaklaşımı kullanarak yaklaşık 1.5 Å'ye kırınım yapan protein kristalleri üretmekti.
Endiyotiapepsin kullanan böyle bir seri kristalografi deneyinin örnek gereksinimlerinin bir örneğini vermek için, Tablo 1 , varsayımsal bir deneyin deneysel parametrelerini göstermektedir. Örnek bilgiler aşağıda açıklanan protokole dayanmaktadır. İsabet oranları ve veri toplama gereksinimleri hakkında bazı konservatif tahminler göz önüne alındığında, 50 mg, tüm deney için toplam numune tüketim tahminidir.
Şekil 3 , başlangıçtaki küçük hacimli buhar difüzyon kristalizasyonundan büyük ölçekli partiye kadar tüm optimizasyon sürecinin akış şemasını göstermektedir. Seri kristalografi projelerinin çoğunluğu için, bu protokol Adım 2'de başlayacaktır: hedef protein zaten kristalize edilmiş olacağından, 'partiye geçiş'. Bununla birlikte, Adım 1, bütünlük ve okuyuculara önemini hatırlatmak için dahil edilmiştir. İyi kırılan, tek, büyük bir kristale yol açan bir durum bulmak, mikro kristal optimizasyonu için en iyi başlangıç noktasıdır. Adım 2'de, bu durum daha sonra buhar difüzyonundan partiye optimize edilebilir ve çekirdeklenme ve metastabil bölgelerin bir morfogramı çizilebilir. Bu yapıldıktan sonra, toplu iş koşulunun daha büyük birimlere ölçeklendirilmesi Adım 3'te gerçekleştirilebilir. Akış şemasının sonunda, bir kristalograf endotiapepsin için tekrarlanabilir, büyük hacimli (> 100 μL), mikro-kristalizasyon, parti protokolü oluşturmuş olacaktır. Bu yöntem daha sonra ilgilendikleri özel proteine uygulanabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Swissci 96-well 2-Drop plates</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD11-002</td>
			<td>96-well 2-drop crystallisation plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swissci 96-well 3-Drop plates</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD11-003</td>
			<td>96-well 3-drop crystallisation plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mosquito LCP liquid handling robot</td>
			<td>sptlabtech</td>
			<td>mosquito LCP</td>
			<td>Crystallisation robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClearVue Sheets</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD6-015</td>
			<td>96-well crystallization plate seals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Tube 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td>1.5 mL centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scaple</td>
			<td>Swan and Morton</td>
			<td>No. 3 scalple and No. 3 handle</td>
			<td>Scalple for cutting open plate seals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS 3 Vortex</td>
			<td>IKA</td>
			<td>3319000</td>
			<td>Vortex for mixing solution and making seed stocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well XRL Plate</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD3-11</td>
			<td>24-well hanging-drop plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube revolver/rotator</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>88881001</td>
			<td>Tube revolver for mixing solution during scaling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Research plus pipettes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>Range of manual pipettes, 0.5-10, 1-20, 10-100, 100-1000 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf pipette tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>Range of tip sizes for manual pipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suparen 600</td>
			<td>Prochem AG</td>
			<td>Suparen 600</td>
			<td>Endothiapepsin solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>241245-1KG</td>
			<td>Sodium Acetate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8382T014</td>
			<td>Tris</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670-1kg</td>
			<td>Magnesium Chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG 6,000</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>81255-1kg</td>
			<td>PEG 6,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethelyene glycol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>324558-1L</td>
			<td>Ethelyene glycol for cyro-protecting the crystals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PACT Premier HT screen</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD1-36</td>
			<td>PACT Premier 96-well crystal screen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOW CORNING high vacuum grease</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD6-02</td>
			<td>Grease for sealing 24-well plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hirschmann 22 x 22 mm glaser cover slides</td>
			<td>Hirschmann</td>
			<td>8000104</td>
			<td>Cover slides for sealing 24-well sitting drop plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal pins</td>
			<td>PSI</td>
			<td>Manufactured inhouse</td>
			<td>Thin-film supports for micro-crystals.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-1.3 mm SiLibeads Type S</td>
			<td>Faust</td>
			<td>6239547</td>
			<td>Glass beads for making mico-seed stocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macbook Pro</td>
			<td>Apple</td>
			<td>Macbook Pro</td>
			<td>Computer for performing data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCP4 software suite</td>
			<td>CCP4</td>
			<td></td>
			<td>Diffraction pattern data processing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>Microsoft Office</td>
			<td>Plotting tool for phase diagram</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hausser Scientific Bright-Line counting chamber</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>02-671-51B</td>
			<td>Tool to calculate crystal concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PACT Premier</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD1-29-ECO</td>
			<td>Sparse-matrix crystallization screen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rock Imager</td>
			<td>Formulatrix</td>
			<td>Rock Imager</td>
			<td>Temperature controlled crystal plate storage and imager</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rock MakerWeb</td>
			<td>Formulatrix</td>
			<td>Rock MakerWeb</td>
			<td>Crystal plate creation and image storage stoftware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formulator</td>
			<td>Formulatrix</td>
			<td>Formulator</td>
			<td>96-well crystal screen creation liquid handling robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica MZ16 Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica MZ16</td>
			<td>Light microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS V4.6</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LAS V4.6</td>
			<td>Software for Leica microscopes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectra/Por 3.5 kDa dialysis tubing</td>
			<td>Spectrumlabs</td>
			<td>Spectra/Por 3 Dialysis Membrane</td>
			<td>3.5 kDa dialysis membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing closures</td>
			<td>Spectrumlabs</td>
			<td>Spectra/Por 3 Duniversal Closures</td>
			<td>Clips to seal the dialysis tubing ends</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon 10 kDa centrifugal concentrator</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>Amicon Ultra-15 10 kDa centrifugal concentrator</td>
			<td>10 kDa centrifugal filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5810 R swing bucket centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810 R Centrifuge</td>
			<td>Swing bucket centrifuge</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimizing the growth of endothiapepsin crystals for serial crystallography experiments

Burada, hem senkrotronlarda hem de XFEL'lerde seri kristalografi deneyleri için uygun büyük hacimli (> 100 μL) mikro-kristalin bulamaçların oluşturulmasını kolaylaştırmak için bir protokol sunulmaktadır. Yöntem, protein kristal faz diyagramının anlaşılmasına ve bu bilginin nasıl kullanılabileceğine dayanmaktadır. Yöntem üç aşamaya ayrılmıştır: (1) kristal morfolojisini optimize etmek, (2) partiye geçiş ve (3) ölçeklendirme. Aşama 1, küp benzeri bir morfolojide sunulan, umarım ama zorunlu olarak değil, iyi kırınımlı, tek kristaller bulmayı içerir. Aşama 2'de, Aşama 1 koşulu kristal büyüme süresi ile optimize edilir. Bu strateji, buhar difüzyonu ile yetiştirilen kristalleri partiye dönüştürebilir. Kristal büyümesi yaklaşık 24 saat içinde gerçekleştiğinde, protein ve çökeltici karışımının bir morfogramı çizilebilir ve bir ölçekleme stratejisinin temeli olarak kullanılabilir (Aşama 3). Kristaller toplu olarak yetiştirilebildiğinde, ölçekleme denenebilir ve hacim arttıkça kristal boyutu ve konsantrasyonu optimize edilebilir. Endotiapepsin bu protokol için bir gösteri proteini olarak kullanılmıştır. Sunulan kararların bazıları endotiapepsine özgüdür. Bununla birlikte, uygulanma şekillerinin, başkalarının kendi projelerine uyarlayabilecekleri bu prosedür hakkında bir düşünme biçimine ilham vereceği umulmaktadır.

Watch this Scientific Journal Video about Optimizing the Growth of Endothiapepsin Crystals for Serial Crystallography Experiments at JoVE.com

Optimizing the Growth of Endothiapepsin Crystals for Serial Crystallography Experiments

Bu makalenin amacı, izleyiciye, büyük, tek protein kristallerini büyütmek için küçük hacimli, buhar-difüzyon protokollerini seri kristalografi için büyük hacimli bir toplu mikro-kristalizasyon yöntemine nasıl dönüştürecekleri konusunda sağlam bir anlayış kazandırmaktır.

Seri Kristalografi Deneyleri için Endotiapepsin Kristallerinin Büyümesini Optimize Etme

Here, a protocol is presented to facilitate the creation of large volumes (&#62; 100 &#181;L) of micro-crystalline slurries suitable for serial ...

Seri kristalografi deneyleri zor olabilir. Uygulamalarındaki önemli bir engel, mikrokristalin numunelerin oluşturulmasıdır. Bu protokol, bu tür örneklerin nasıl güvenilir bir şekilde oluşturulabileceğini gösterir.Bu yöntem, küçük hacimli buhar difüzyon plakalarında yetiştirilen büyük kristalleri büyük hacimli mikrokristalin bulamaçlara optimize etmek için bir çerçeve sağlamak için endotiapepsin kullanır. Bu protokolün evrensel olarak başarılı olacağını iddia edemeyiz. Bununla birlikte, burada önerilen fikir ve yöntemlerin başkalarına diğer proteinler üzerinde kullanmak için deneysel bir çerçeve sunmasını umuyoruz.Başlamak için, Formulatrix robotunu kullanarak kristalizasyon tamponu ile iki damla 96 kuyu plakası hazırlayın. Bir sıvı taşıma robotu karışımı kullanarak, 150 nanolitre taze çözülmüş endotiyapepsin, her bir kuyucukta 150 nanolitre kristalizasyon tamponu ile karıştırın. Plakayı kapatın ve kristallerin Formulatrix Hotel'de 24 saat boyunca büyümesine izin verin.24 saat sonra, kristalleri parçalayın ve 96 delikli kristalizasyon plakasının beş kuyucuğundan çıkarın. Bunları bir buz kovasına yerleştirilmiş 1,5 mililitrelik bir santrifüj tüpünde kristalizasyon tamponunun 250 mikrolitresine yerleştirin. Santrifüj tüpüne bir milimetre boyutunda 10 ila 15 cam boncuk ekleyin.Kristalleri ve boncukları 1000 RPM'de 30 saniye boyunca vorteks edin ve 30 saniye boyunca buz üzerinde değiştirin. Tohumlar daha sonra hemen kullanılabilir veya eksi 20 santigrat derecede saklanabilir. Bir morfogram deneyi gerçekleştirmek için, pH yedide bir molar Tris-HCl ile% beş ila% 40 PEG 6000 konsantrasyonları ve iki damla 96 delikli bir ızgara ekranının plaka sütunları boyunca 0.1 molar sodyum asetat içinde 0.1 molar sodyum asetat içinde endotiapepsinin sıralı seyreltilmesini sekiz adımda mililitre başına 100 ila 12.5 miligram arasında onarın.Daha sonra her seyreltmenin sekiz mikrolitresini pipetleyin ve ardından iki mikrolitre tohum stoğunu sıvı taşıma robot plakasına yerleştirin. Bir sıvı taşıma robotu kullanarak, endotiapepsinin her seyreltilmesinden 150 nanolitresini ekranın bir ve iki alt kuyucuğuna dağıtın. 50 nanolitre defrosted tohum stoğunu ve 100 nanolitre kuyu çözeltisini iki kuyu altından çoklu aspire edin ve her ikisini de protein çözeltisine dağıtın.Kristalleşme tamponu veya kristalizasyon tamponu ve tohum karışımı eklendikten sonra çözeltileri üç kez karıştırın. Şimdi plakayı ve görüntüyü ilk haftanın her günü sıfır, üç, altı, 12, 18 ve 24 saatinde ve sonraki dört hafta boyunca her hafta 20 santigrat derecede kapatın. 24 saat sonra, mikroskop altında plakaya bakın, her bir kuyucuktaki kristal sayısını tahmin edin ve kristallerin bir örneğini ölçün.Bu tahminleri sağlanan morfogram oluşturucu çalışma sayfasına kaydedin. Endotiapepsin ve PEG 6000'in başlangıç konsantrasyonlarını uygun kutulara girin. Çalışma sayfası, sonuçları sırasıyla X ve Y eksenindeki çökeltici ve protein konsantrasyonları ile geleneksel faz diyagramı biçiminde otomatik olarak çizecektir.Sadece tohumlanmış damlalarında kristallere yol açan iyi koşullar, diyagramın MetaStable bölgesini gösterirken, hem tohumlanmış hem de tohumlanmamış damlalarda kristalleri olan koşullar çekirdeklenme bölgesini gösterir. Morfogram analizinden, 24 kuyucuk plakasına ölçeklendirmek için en umut verici koşulu seçin. Daha sonra mililitre endotiapepsin başına 100 miligram ve% 35 PEG 6000 ile başlayın.% 35 PEG 6000, pH yedi ile 0.1 molar Tris-HCl ve 0.15 molar magnezyum klorür ile beş mililitre kristalizasyon tamponu hazırlayın. Şimdi kristalizasyon tamponunun 0,5 mililitresini yağlanmış 24 delikli asılı bir damla plakasının üç kuyucuğuna yerleştirin. Bir cam kapak kayması üzerinde 15 mikrolitre endotiapepsin ile 15 mikrolitre kristalizasyon çözeltisi ile karıştırın.Çözeltiyi kuyucukların üzerine yerleştirin ve plakayı 24 saat bekletin. 24 saat sonra, mikroskop altında plakaya bakın, damladaki kristal sayısını tahmin edin ve boyutlarını ölçün. Kristaller yanlışsa, bu adımı tekrarlayın, ancak protein konsantrasyonunu değiştirin veya kristal çekirdeklenmesi yeterince yüksek değilse tohum ekleyin.Daha yüksek bir PEG 6000 konsantrasyonunda tohum ekleyerek 24 kuyucuklu ölçeklendirme deneyini tekrarlayın. Yeni kristalizasyon tamponunun 0,5 mililitresini, yağlanmış 24 delikli asılı bir damla plakasının üç kuyucuğuna yerleştirin. Bir cam kapak fişine 15 mikrolitre endotiapepsin yerleştirin ve beş mikrolitre tohum stoğu ve 10 mikrolitre kristalleşme çözeltisini endotiapepsin çözeltisi ile karıştırın.Kapak fişlerini ters çevirin, kuyucukların üzerine yerleştirin ve 24 saat bekletin. Kristallerin daha küçük olup olmadığını ve daha yüksek bir konsantrasyona sahip olup olmadığını görmek için damlaları tekrar kontrol edin. Düşüşteki kristallerin sayısını tahmin edin ve şimdi doğru boyutta olup olmadıklarını görmek için boyutlarını tekrar ölçün.Tohumlu parti protokolünü gerçekleştirmek için,% 40 PEG 6000, pH değeri yedi olan 0.1 molar Tris-HCl ve 0.15 molar magnezyum klorür kristalizasyon tamponunu hazırlayın. 50 mikrolitre tohum stoğu ve 100 mikrolitre kristalizasyon çözeltisini önceden karıştırın ve 1.5 mililitre santrifüj tüpünde protein çözeltisi ile karıştırın. Tüpü 10 saniye boyunca vorteks edin ve 20 santigrat derecede bir rocker veya çalkalayıcıya yerleştirin.Her 20 dakikada bir 2,5 mikrolitrelik bir toplu çözelti aliquot alın. Bir hemositometre kullanarak kristallerin boyutunu ve sayısını izleyin. Kristallerin sayısını sayın ve mikroskop altında boyutlarını ölçün.Kristaller yaklaşık 15 mikron boyuta ulaştığında, reaksiyonu 0.5 molar Tris-HCl, 0.075 molar magnezyum klorür ve% 20 PEG 6000 ile desteklenmiş 150 mikrolitre 0.5 molar sodyum asetat ile söndürün. Hemositometreyi kullanarak kristal boyutunu ve konsantrasyonunu tekrar kontrol edin. Kristalleri 20 santigrat derecede saklayın.Endotiyapepsin morfogram analizi, nükleasyonun hem protein hem de çökeltici konsantrasyonlarından etkilendiğini göstermiştir. Diyagramın MetaStable, çekirdeklenme ve yağış bölgeleri güzel bir şekilde ayırt edilebilir. Tohumların eklenmesi, tohumsuz damlalara kıyasla kristal sayısını önemli ölçüde arttırdı.200 ila 300 mikrolitre hacimdeki endotiapepsin mikro kristalizasyonunun analizi, kristal çekirdeklenmesindeki değişiklikleri ve zaman içindeki en uzun boyutu ortaya koymuştur. PEG konsantrasyonunun% 35'e çıkarılması, mililitre başına altıya yaklaşık 3.6 kat 10 ila altı arasında bir nihai kristal konsantrasyonu ve 42 mikrometrelik en uzun kristal boyutu ile kristalleşmeyi belirgin şekilde iyileştirdi. Son kristallerin boyutunu azaltmak için, maalesef kristal konsantrasyonunu önemli ölçüde azaltan ve sonuçta daha büyük kristaller üreten bir protein konsantrasyonu azaltma yaklaşımı uygulandı.Bununla birlikte, PEG konsantrasyonunu% 40'a çıkarma yaklaşımı, mililitre başına altıya yaklaşık 3.1 kat 10 ila 10 arasında kristaller ve yaklaşık 39 mikrometrelik bir boyut elde etti. Ayrıca, tohumların eklenmesi, kristal konsantrasyonunda, mililitre başına sekize yaklaşık 1.1 kat 10 ve yaklaşık 4.2 mikrometrelik daha küçük boyutlarda önemli bir artışa yol açtı. Kristalleşme reaksiyonunda denenen söndürme etkisi, mililitre başına altıya yaklaşık 2.6 kat 10 ila 10 arasında bir nihai kristal konsantrasyonu ve yaklaşık 15 mikrometrelik bir boyut verdi.X-ışını verilerinden elde edilen çözünürlüğe karşı çizilen CC yarısı, kristal çözünürlüğünde 10 mikrolitreden 200 ila 300 mikrolitre hacimlere hafif bir düşüş gösterdi. Bununla birlikte, kristal hala yeterli görülen 1.5 angstrum'a kırıldı. Endotiapepsin, çalışmak için affedici bir proteindir.Bu endotiapepsin protokolünü denemenin diğer proteinler için yararlı fikirler ve yöntemler üreteceğini umuyoruz. Özellikle kristalografide, sadece yazılı bir protokolü takip etmeye çalışmak yerine, şeylerin nasıl göründüğünü ve hissettiğini görmek faydalıdır. Bu video umarım size bu hissin bir kısmını verecektir.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography

Hazırlık ve Seri Femtosecond Kristalografi için lipidik Cubic Faz Protein mikro kristallerinin teslimi

Membrane proteins (MPs) are essential components of cellular membranes and primary drug targets. Rational drug design relies on precise structural ...

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

Etkili belirlenmesi tahlillerinde Peptit Agonistlerinin seri Seyreltme için Dağıtım Otomatik Akustik

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

Protein Kristallerinin Mikrokristalografisi ve<em&gt; Selülozda</emKırınım

The advent of high-quality microfocus beamlines at many synchrotron facilities has permitted the routine analysis of crystals smaller than 10 &#181;m in ...

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Situ dinamik ışık saçılma ile birleştiğinde kristalizasyon büyüyen Protein kristalleri kullanarak farklı boyutları ile otomatik

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

X-ışını kristalografisi ve biyofiziksel teknikleri immünglobulin katlanmış glikoproteinlerin karakterizasyonu

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

Minimal arka plan saçılma ile Macromoleküler X-ışını Kristalografi için bir hepsi bir arada örnek tutucu

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

X-Ray Kristalografi Thermotoga maritima M42 Aminopeptidaz TmPep1050 Oligomerik Devlet Geçiş Çalışma

The M42 aminopeptidases form functionally active complexes made of 12 subunits. Their assembly process appears to be regulated by their metal ion ...

Derivatization of Protein Crystals with I3C using Random Microseed Matrix Screening

Rastgele Mikrotohum Matris Taraması Ile Protein Kristallerinin I3C ile Türevleştirilmesi

Protein structure elucidation using X-ray crystallography requires both high quality diffracting crystals and computational solution of the diffraction ...

Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip

Çok Yönlü Bir Mikroakışkan Çipte Seri Kristalografi ile Bir Enzim:Substrat Kompleksinin Kristalizasyonu ve Yapısal Belirlenmesi

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We ...

Workflow and Tools for Crystallographic Fragment Screening at the Helmholtz-Zentrum Berlin

Helmholtz-Zentrum Berlin'de Kristalografik Parça Taraması için İş Akışı ve Araçlar

Fragment screening is a technique that helps to identify promising starting points for ligand design. Given that crystals of the target protein are ...