Name: establishing pollination requirements in japanese plum by phenological monitoring, hand pollinations, fluorescence microscopy and molecular genotyping
Uploaded: 2020-11-09T15:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishing Pollination Requirements in Japanese Plum by Phenological Monitoring, Hand Pollinations, Fluorescence Microscopy and Molecular Genotyping at JoVE

Dit onderzoek werd gefinancierd door Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (RFP2015-00015-00 en RTA2017-00003-00); Gobierno de Aragón — Europees Sociaal Fonds, Europese Unie (Grupo Consolidado A12-17R) en Junta de Extremadura — Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER), Plan Regional de Investigación (IB16181), Grupo de Investigación (AGA001, GR18196). B.I. Guerrero werd ondersteund door een fellowship van Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología van Mexico (CONACYT, 471839).

1. Handbestuiving in het veld
<ol><li>
Pollenextractie
	<ol>
<li>Om stuifmeel te verkrijgen, verzamel bloemknoppen in stadium D24,volgens fase 57 op de BBCH-schaal25,26. OPMERKING: Meer bloemknoppen zijn nodig in Japanse pruimen dan in andere Prunus-soorten omdat hun helmknoppen minder stuifmeel produceren.</li>
		<li>Verwijder de helmdoeken met behulp van een plastic gaas (poriegrootte van 2 mm x 2 mm) en le...

De hierin beschreven methodologie voor bestuivingsvereisten van Japanse pruimencultivars vereist het bepalen van de zelf-(in)compatibiliteit van elke cultivar door gecontroleerde bestuivingen in het veld of het laboratorium, en de daaropvolgende observatie van pollenbuisgroei met fluorescentiemicroscopie. De incompatibiliteitsrelaties worden vastgesteld door de karakterisering van de S-allelen door moleculaire genotypering. Ten slotte wordt de selectie van bestuivers uitgevoerd door de monitoringfenologie om die...

Japanse pruim(Prunus salicina Lindl.) is inheems in China1. In de19e eeuw werd dit gewas vanuit Japan naar de Verenigde Staten geïntroduceerd, waar het werd gekruist met andere Noord-Amerikaanse diploïde pruimen2. In de 20e eeuw werden sommige van deze hybriden verspreid naar gematigdestreken over de hele wereld. Tegenwoordig verwijst de term "Japanse pruim" naar een breed scala aan interspecifieke hybriden afgeleid van kruisingen tussen de oorspronkelijke P. salicina met maximaal 15 andere diploïde Prunus spp.3,4,5.
Japanse pruim vertoont, net als andere soorten van de Rosaceae-familie, Gametophytic Self-Incompatibility (GSI), die wordt gecontroleerd door een enkele en zeer polymorfe S-locusmet meerdere allelen6. De S-locus bevat twee genen die coderen voor een ribonuclease (S-RNase) uitgedrukt in de stamper, en een F-box eiwit (SFB) uitgedrukt in de stuifmeelkorrel7. In de zelfincompatibiliteitsreactie, wanneer het S-alleluitgedrukt in de stuifmeelkorrel (haploïde) hetzelfde is als een van de twee uitgedrukt in de stamper (diploïde), wordt de groei van de stuifmeelbuis over de stijl gestopt als gevolg van de afbraak van het pollenbuis-RNA door de werking van de S-RNase8. Omdat dit proces bevruchting van de vrouwelijke gametofyt in de eicel voorkomt, bevordert GSI de kruising tussen cultivars.
Hoewel sommige Japanse pruimencultivars zelfcompatibel zijn, zijn de meeste cultivars die momenteel worden gekweekt zelfcompatibel en hebben ze stuifmeel van intercompatibele donoren nodig om hun bloemen te bevruchten3. In steenfruitsoorten van het geslacht Prunus zoals amandel9,abrikoos10,11,12 en zoetekers 13kunnen bestuivingsvereisten van cultivars door verschillende benaderingen worden vastgesteld. Zelf-(in)compatibiliteit kan worden bepaald door zelfbestuiving van bloemen in het veld en daaropvolgende monitoring van vruchtzetting, of door semi-in vivo zelfbestuivingen onder gecontroleerde omstandigheden in een laboratorium en de observatie van stuifmeelbuizen onder de microscoop14,15,16,17,18 . Incompatibiliteitsrelaties tussen cultivars kunnen worden bepaald door kruisbestuivingen in het veld of in het laboratorium met behulp van stuifmeel van de potentiële bestuivercultivar, en door de identificatie van S-allelen van elke cultivar door PCR-analyse14,15,16,19,20,21,22 . Bij soorten zoals zoete kers of amandel kan zelf-(in)compatibiliteit ook worden beoordeeld door de identificatie van bepaalde S-allelen geassocieerd met zelfcompatibiliteit, zoals S4' in zoetekers 13 of Sf in amandel23.
Verschillende pruimenveredelingsprogramma's uit de belangrijkste producerende landen brengen een aantal nieuwe cultivars2,14uit,waarvan vele met onbekende bestuivingsvereisten. In dit werk wordt een methodologie beschreven voor de bepaling van bestuivingsvereisten in Japanse pruim-type hybriden. Zelf-(in)compatibiliteit wordt bepaald door zelfbestuivingen in zowel het veld als het laboratorium, gevolgd door observaties van pollenbuizen onder de fluorescentiemicroscopie. Selectie van bestuivercultivars combineert de identificatie van S-genotypen door PCR-analyse met de monitoring van de bloeitijd in het veld.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic Acid Glacial</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>131008.1611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>iNtRON Biotechnology</td>
			<td>25999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aniline blue</td>
			<td>Difco</td>
			<td>8504-88</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric Acid (H3BO4)</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>131015.1210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Nitrate 4-hydrate (Ca(NO3)2&#183;4H2O)</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>131231.1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass</td>
			<td>Deltalab</td>
			<td>D102460</td>
			<td>24 mm x 60 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Camera</td>
			<td>Imaging Developmet Systems</td>
			<td>UI-1490SE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Camera Software Suite</td>
			<td>Imaging Developmet Systems</td>
			<td>4.93.0.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Oligos</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Mix, 10 mM each</td>
			<td>ThermoSischer Scientific</td>
			<td>R0193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DreamTaq Green DNA polymerase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>EP0713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 96&#176;</td>
			<td>VWR-Chemicals</td>
			<td>83804.360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1Kb DNA Ladder (U.S. Patent No. 4.403.036) (500pb-12Kb)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15615-016</td>
			<td>Size: 250&#181;g; Conc: 1.0 &#181;g/&#181;l</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Documentation System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand Counter</td>
			<td>Tamaco</td>
			<td>TM-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Lab Software</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td>Image Analyse System for Gel Documentation System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaPhor Agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge 5415 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z605212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope with UV epiflurescence</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM2500</td>
			<td>Exciter filter BP340-390, Barrier filter LP425</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microslides</td>
			<td>Deltalab</td>
			<td>D100004</td>
			<td>26 mm x 76 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Electrophoresis System</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>14955170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minicentrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15334204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 1000 Spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes</td>
			<td>Deltalab</td>
			<td>200201</td>
			<td>55 mm x 14 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Tribasic (K3PO4&#183;1.5H2O)</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>141513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer forward &#39;Pru C2&#39;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer forward Pru T2&#39;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer reverse &#39;PCER&#39;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RedSafe Nucleic Acid Staining Solution</td>
			<td>iNtRON Biotechnology</td>
			<td>21141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saccharose</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>131621.1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium sulphite anhydrous (Na2SO3)</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>131717.1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Speedtools plant DNA extraction Kit</td>
			<td>Biotools</td>
			<td>21272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBE Buffer (10X)</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>A0972,5000PE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal Cycler T100</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer comfort</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>T1317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Autoclave Presoclave II</td>
			<td>JP Selecta</td>
			<td>4001725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>11746744</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishing pollination requirements in japanese plum by phenological monitoring, hand pollinations, fluorescence microscopy and molecular genotyping

De Japanse pruimencultivars die gewoonlijk worden gekweekt, zijn interspecifieke hybriden die zijn afgeleid van kruisingen tussen de oorspronkelijke Prunus salicina met andere Prunus-soorten. De meeste hybriden vertonen gametofytische zelfincompatibiliteit, die wordt bestuurd door een enkele en zeer polymorfe S-locus die meerdere allelen bevat. De meeste gekweekte hybriden zijn zelfincompatibel en hebben stuifmeel van een compatibele donor nodig om hun bloemen te bevruchten. Het vaststellen van bestuivingseisen bij Japanse pruimen wordt steeds belangrijker door het grote aantal nieuwe cultivars met onbekende bestuivingseisen. In dit werk wordt een methodologie beschreven voor de bepaling van bestuivingsvereisten in Japanse pruim-type hybriden. Zelf-(in)compatibiliteit wordt bepaald door handbestuivingen in zowel het veld als in het laboratorium, gevolgd door het monitoren van pollenbuisverlenging met fluorescentiemicroscopie en ook het monitoren van de fruitrijping in het veld. Selectie van bestuivercultivars wordt beoordeeld door de identificatie van S-genotypen door PCR-analyse te combineren met de monitoring van de bloeitijd in het veld. Het kennen van de bestuivingsvereisten van cultivars vergemakkelijkt de selectie van cultivars voor het ontwerp van nieuwe boomgaarden en maakt de vroege detectie van productiviteitsproblemen in verband met bestuivingstekort in gevestigde boomgaarden mogelijk.

Elke Japanse pruimenbloemknop bevat een bloeiwijze met 1-3 bloemen. Net als bij andere steenvruchtensoorten bestaat elke bloem uit vier kransen: carpel, meeldraden, bloemblaadjes en kelkbladen, die zijn samengesmolten tot een beker aan de basis van de bloem. Bloemstructuren zijn kleiner dan andere steenvruchten, met een korte en fragiele stamper omringd door de meeldraden die een kleine hoeveelheid stuifmeelkorrels bevatten. Bij volle bloei lijken de bloemen van elke bloeiwijze gescheiden op korte stengels, met de witte ...

Watch this Scientific Journal Video about Establishing Pollination Requirements in Japanese Plum by Phenological Monitoring, Hand Pollinations, Fluorescence Microscopy and Molecular Genotyping at JoVE

Establishing Pollination Requirements in Japanese Plum by Phenological Monitoring, Hand Pollinations, Fluorescence Microscopy and Molecular Genotyping

Een methodologie voor de bepaling van bestuivingsvereisten in Japanse pruimentype hybriden wordt beschreven, die veld- en laboratoriumbestuivingen en waarnemingen van pollenbuizen onder de fluorescentiemicroscopie combineert met de identificatie van S-genotypen door PCR en de monitoring van de bloei voor de selectie van bestuiver.

Het vaststellen van bestuivingsvereisten in Japanse pruim door fenologische monitoring, handbestuivingen, fluorescentiemicroscopie en moleculaire genotypering

The Japanese plum cultivars commonly grown are interspecific hybrids derived from crosses between the original Prunus salicina with other Prunus species. ...

This protocol is becoming increasingly important due to the high number of new self-incompatible Japanese plum cultivars with unknown pollination requirements. The main advantage of this technique is that it allows for the determination of the pollination requirements of cultivars by combining two complimentary approaches in field and laboratory conditions. This approach can also be applied to determine pollination requirements and other self-incompatible fruit tree species like apricot or sweet cherry.For pollen extraction, collect flower buds at balloon stage according to stage 57 on the BBCH scale. Remove the anthers using a plastic mesh and place them on paper at room temperature for 24 hours until anther dehiscence. Sieve the pollen grains through a fine mesh and conserve them in a 10 millimeter glass tube with a cap at four degrees Celsius until use.When 10 to 20%of the flowers are open, select and label several branches, leaving 1, 000 to 1, 500 flowers per pollination treatment. On the next day, when more flowers are open, pollinate each flower using a paintbrush with pollen from the same cultivar for self-pollination and pollen from other cultivars as cross-pollination control. Pollinate every day until all flowers are open.Record weekly counts of flowers and developing fruits from anthesis to harvest to characterize the fruit drop pattern and quantify the final fruit set in each pollination treatment. Collect 50 to 100 flowers at balloon stage according to stage 57 on the BBCH scale. Emasculate 30 flowers per treatment in the laboratory for self and cross-pollination.Make a fresh cut on the base of each flower pedicle under water and place it on a piece of wet florist foam. Use one piece of foam for each pollination treatment. After 24 hours, hand pollinate each pistil with the pollen collected previously using a fine paintbrush.Pollinate one set of pistils with pollen from the same cultivar and the other set with pollen from another compatible cultivar as control. Fix these pollinated pistils in a fixative solution of ethanol and acetic acid for at least 24 hours at four degrees Celsius. Spread the pollen of each cultivar previously used as a pollen donor in the pollinations in two Petri dishes and incubate them at 25 degrees Celsius for 24 hours.To observe the pollen grains, add two to three drops of aniline blue solution to each Petri dish and observe them under a UV epifluorescence microscope after five minutes. Count viable and non-viable pollen grains in the three fields per Petri dish with each field containing about 100 to 200 pollen grains in two Petri dishes for each cultivar. To observe the pollen tubes, squash softened pistils in a drop of 1%aniline blue solution under a cover glass on a slide.Observe the pollen tube growth along the style under a microscope with UV epifluorescence using exciter filter BP340-390 and barrier filter LP425. Collect three to four young leaves from each cultivar in the field and extract DNA from the leaves. Set up a master mix for each pair of primers in 1.5 milliliter micro tubes.Add all reagents and mix thoroughly. Aliquot 16 microliters of this master mix into each 200 microliter PCR tube containing four microliters of DNA template or control. Mix them gently, close the caps and centrifuge at 2, 000 times G for 30 seconds.Place the tube in the thermocycler and run the PCR program as mentioned in the text manuscript. For estimating the fragment size by gel electrophoresis, load the first and last wells with two microliters of the DNA ladder and three microliters of the PCR product in the other wells. Close the chamber and run the gel at 100 volts for 30 minutes.Observe the gel under UV light using a gel imaging system. Use the DNA ladder to estimate the size of the amplified fragments and compare it with the positive and negative controls. Monitor the phenology of different trees of each cultivar over different years of flowering.Establish the length of the flowering period from the first to the last open flowers. Full bloom is considered when at least 50%of flowers are at stage F according to stage 65 on the BBCH. The pattern of fruit drop of hand pollinated flowers after emasculation or supplementary pollination showed that most flowers dropped two to three weeks after pollination, but 4%of self-pollinated flowers remained in the tree, indicating that this cultivar is self-compatible.Viable pollen grains showed a pollen tube longer than its length after 24 hours in the culture medium and non-viable pollen grains did not germinate. During pollination, pollen grains were transferred to the stigma. Each germinating pollen grain produced a pollen tube, which grew through the pistil structures.In self-incompatible cultivars, the pollen tube stopped growing in the upper third of the style. However, in self-compatible cultivars, the pollen tube could grow through the style, reach the ovary and fertilize an ovule. PCR analysis was carried out using primers from the conserved regions of sRNAs of sweet cherry and Japanese plum, making it possible to determine the size of S-alleles in each cultivar.The length of the flowering period for a total of four years was calculated. Flowering in orchard conditions allowed the determination of which cultivars are coincident at flowering time each year. When attempting this protocol, make sure to use a higher number of flowers of Japanese plum for hand pollinations since the percentage of fruit set is very low compared to other Prunus species.It is not possible to determine self-incompatibility by molecular approaches. Further work of S-allele sequencing is required to assess if some S-alleles are associated with self-compatibility. The combination of field and laboratory approaches has resulted in valuable information for the design of new commercial orchards and can be used in other fruit tree species.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP)

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP

Meten Eiwit Stabiliteit in Living zebravis embryo&#39;s met behulp van fluorescentie Decay Na Photoconversion (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological ...

Primary Endodermal Epithelial Cell Culture from the Yolk Sac Membrane of Japanese Quail Embryos

Primaire endodermale epitheelcellen Cultuur van de dooierzak membraan van de Japanse kwartel embryo

We established an endodermal epithelial cell culture model (EEC) for studying the function of certain enzymes and proteins in mediating nutrient ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

Analyse van de zebravis Kidney Development met Time-lapse Imaging Met behulp van een dissectie microscoop Uitgerust voor Optische-Sectie

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

Met behulp van Light Sheet fluorescentiemicroscopie met Afbeelding zebravis Eye Development

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

Light-Sheet gebaseerd fluorescentiemicroscopie van de levens- of gefixeerd en gekleurd<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; Embryo&#39;s

The red flour beetle Tribolium castaneum has become an important insect model organism in developmental genetics and evolutionary developmental biology. ...

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

Oereenstemming super resolutie en elektronenmicroscopie op te lossen eiwit lokalisatie in Zebrafish Retina

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissectie en immunefluorescentie kleuring van Mushroom lichaam en fotoreceptor neuronen in de hersenen van de volwassen Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Single-Cell Quantification of Protein Degradation Rates by Time-Lapse Fluorescence Microscopy in Adherent Cell Culture

Eencellige kwantificering van eiwit afbraak tarieven door Time-Lapse fluorescentie microscopie in aanhangend celkweek

Proteins are in a dynamic state of synthesis and degradation and their half-lives can be adjusted under various circumstances. However, most commonly used ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Cel aggregatie testen om te evalueren van de Binding van de Drosophila inkeping met Trans-liganden en haar remming door Cis-liganden

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...