Name: establishing pollination requirements in japanese plum by phenological monitoring, hand pollinations, fluorescence microscopy and molecular genotyping
Uploaded: 2020-11-09T15:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishing Pollination Requirements in Japanese Plum by Phenological Monitoring, Hand Pollinations, Fluorescence Microscopy and Molecular Genotyping at JoVE

Diese Forschung wurde vom Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (RFP2015-00015-00 und RTA2017-00003-00) finanziert. Gobierno de Aragón – Europäischer Sozialfonds, Europäische Union (Grupo Consolidado A12-17R) und Junta de Extremadura – Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER), Plan Regional de Investigación (IB16181), Grupo de Investigación (AGA001, GR18196). B.I. Guerrero wurde durch ein Stipendium des Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología von Mexiko (CONACYT, 471839) unterstützt.

1. Handbestäubung im Feld
<ol><li>
Pollengewinnung
	<ol>
<li>Um Pollen zu erhalten, sammeln Sie Blütenknospen im Stadium D24gemäß Stadium 57 auf der BBCH-Skala25,26. HINWEIS: Bei japanischen Pflaumen sind mehr Blütenknospen notwendig als bei anderen Prunus-Arten, da ihre Staubbeutel weniger Pollen produzieren.</li>
		<li>Entfernen Sie die Staubbeutel mit einem Kunststoffnetz (2 mm x 2 mm Porengröße) un...

Die hierin beschriebene Methodik für den Bestäubungsbedarf japanischer Pflaumensorten erfordert die Bestimmung der Selbst-(Un-)Kompatibilität jeder Sorte durch kontrollierte Bestäubungen im Feld oder im Labor und die anschließende Beobachtung des Pollenröhrenwachstums mit Fluoreszenzmikroskopie. Die Inkompatibilitätsbeziehungen werden durch die Charakterisierung der S-Allele durch molekulare Genotypisierung hergestellt. Schließlich wird die Auswahl der Bestäuber von der Überwachungsphänologie durchgef...

Japanische Pflaume (Prunus salicina Lindl.) stammt aus China1. Im19. Jahrhundert wurde diese Ernte von Japan in die Vereinigten Staaten eingeführt, wo sie mit anderen nordamerikanischen diploiden Pflaumen gekreuzt wurde2. Im20. Jahrhundert wurden einige dieser Hybriden in gemäßigte Regionen auf der ganzen Welt verbreitet. Heutzutage bezieht sich der Begriff "japanische Pflaume" auf eine breite Palette von interspezifischen Hybriden, die aus Kreuzungen zwischen der ursprünglichen P. salicina und bis zu 15 anderen diploiden Prunus spp.3,4,5abgeleitet sind.
Die japanische Pflaume weist wie andere Arten der Rosaceae-Familie eine gametophytische Selbstinkompatibilität (GSI) auf, die von einem einzelnen und hochgradig polymorphen S-Locuskontrolliert wird, der mehrere Alleleenthält 6. Der S-Locus enthält zwei Gene, die für eine im Stempel exprimierte Ribonuklease(S-RNase)und ein im Pollenkorn exprimiertes F-Box-Protein (SFB)kodieren 7. In der Selbstinkompatibilitätsreaktion, wenn das im Pollenkorn (haploid) exprimierte S-Allel mit einem der beiden im Stempel (diploid) exprimierten ist, wird das Wachstum des Pollenrohrs über den Stil aufgrund des Abbaus der Pollenröhren-RNA durch die Wirkung der S-RNase8gestoppt. Da dieser Prozess die Befruchtung des weiblichen Gametophyten in der Eizelle verhindert, fördert GSI die Auskreuzung zwischen den Sorten.
Obwohl einige japanische Pflaumensorten selbstkompatibel sind, sind die meisten derzeit angebauten Sorten selbstinkompatibel und benötigen Pollen von interkompatiblen Spendern, um ihre Blüten zu düngen3. Bei Steinobstarten der Gattung Prunus wie Mandel9,Aprikose10,11,12 und Süßkirsche13können die Bestäubungsanforderungen von Sorten durch verschiedene Ansätze festgestellt werden. Die Selbst(in)kompatibilität kann durch Selbstbestäubung von Blüten im Feld und anschließende Überwachung des Fruchtansatzes oder durch semi-in vivo Selbstbestäubungen unter kontrollierten Bedingungen in einem Labor und die Beobachtung von Pollenröhrchen unter dem Mikroskop bestimmt werden14,15,16,17,18 . Inkompatibilitätsbeziehungen zwischen Sorten können durch Kreuzbestäubungen im Feld oder im Labor unter Verwendung von Pollen der potenziellen Bestäubersorte und durch die Identifizierung von S-Allelenjeder Sorte durch PCR-Analyse bestimmt werden14,15,16,19,20,21,22 . Bei Arten wie Süßkirsche oder Mandel kann die Selbstverträglichkeit auch durch die Identifizierung bestimmter S-Allele beurteilt werden, die mit der Selbstkompatibilität assoziiert sind, wie S4' in Süßkirsche13 oder Sf in Mandel23.
Mehrere Pflaumenzuchtprogramme aus den wichtigsten Erzeugerländern setzen eine Reihe neuer Sorten2,14frei, von denen viele unbekannte Bestäubungsanforderungen haben. In dieser Arbeit wird eine Methodik zur Bestimmung des Bestäubungsbedarfs in japanischen Pflaumen-Hybriden beschrieben. Die Selbst(in)Verträglichkeit wird durch Selbstbestäubungen sowohl im Feld als auch im Labor bestimmt, gefolgt von Beobachtungen von Pollenröhren unter der Fluoreszenzmikroskopie. Die Selektion von Bestäubersorten kombiniert die Identifizierung von S-Genotypen durch PCR-Analyse mit der Überwachung der Blütezeit im Feld.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic Acid Glacial</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>131008.1611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>iNtRON Biotechnology</td>
			<td>25999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aniline blue</td>
			<td>Difco</td>
			<td>8504-88</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric Acid (H3BO4)</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>131015.1210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Nitrate 4-hydrate (Ca(NO3)2&#183;4H2O)</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>131231.1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass</td>
			<td>Deltalab</td>
			<td>D102460</td>
			<td>24 mm x 60 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Camera</td>
			<td>Imaging Developmet Systems</td>
			<td>UI-1490SE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Camera Software Suite</td>
			<td>Imaging Developmet Systems</td>
			<td>4.93.0.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Oligos</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Mix, 10 mM each</td>
			<td>ThermoSischer Scientific</td>
			<td>R0193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DreamTaq Green DNA polymerase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>EP0713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 96&#176;</td>
			<td>VWR-Chemicals</td>
			<td>83804.360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1Kb DNA Ladder (U.S. Patent No. 4.403.036) (500pb-12Kb)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15615-016</td>
			<td>Size: 250&#181;g; Conc: 1.0 &#181;g/&#181;l</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Documentation System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand Counter</td>
			<td>Tamaco</td>
			<td>TM-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Lab Software</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td>Image Analyse System for Gel Documentation System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaPhor Agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge 5415 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z605212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope with UV epiflurescence</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM2500</td>
			<td>Exciter filter BP340-390, Barrier filter LP425</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microslides</td>
			<td>Deltalab</td>
			<td>D100004</td>
			<td>26 mm x 76 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Electrophoresis System</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>14955170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minicentrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15334204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 1000 Spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes</td>
			<td>Deltalab</td>
			<td>200201</td>
			<td>55 mm x 14 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Tribasic (K3PO4&#183;1.5H2O)</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>141513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer forward &#39;Pru C2&#39;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer forward Pru T2&#39;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer reverse &#39;PCER&#39;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RedSafe Nucleic Acid Staining Solution</td>
			<td>iNtRON Biotechnology</td>
			<td>21141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saccharose</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>131621.1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium sulphite anhydrous (Na2SO3)</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>131717.1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Speedtools plant DNA extraction Kit</td>
			<td>Biotools</td>
			<td>21272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBE Buffer (10X)</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>A0972,5000PE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal Cycler T100</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer comfort</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>T1317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Autoclave Presoclave II</td>
			<td>JP Selecta</td>
			<td>4001725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>11746744</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishing pollination requirements in japanese plum by phenological monitoring, hand pollinations, fluorescence microscopy and molecular genotyping

Die üblicherweise angebauten japanischen Pflaumensorten sind interspezifische Hybriden, die aus Kreuzungen zwischen dem ursprünglichen Prunus salicina und anderen Prunus-Arten stammen. Die meisten Hybriden weisen eine gametophytische Selbstinkompatibilität auf, die durch einen einzelnen und hochpolymorphen S-Locus gesteuert wird, der mehrere Allele enthält. Die meisten kultivierten Hybriden sind selbstinkompatibel und benötigen Pollen von einem kompatiblen Spender, um ihre Blüten zu befruchten. Die Etablierung von Bestäubungsanforderungen in japanischen Pflaumen wird aufgrund der hohen Anzahl neuer Sorten mit unbekanntem Bestäubungsbedarf immer wichtiger. In dieser Arbeit wird eine Methodik zur Bestimmung des Bestäubungsbedarfs in japanischen Pflaumen-Hybriden beschrieben. Die Selbst(in)Verträglichkeit wird durch Handbestäubungen sowohl im Feld als auch im Labor bestimmt, gefolgt von der Überwachung der Pollenröhrenverlängerung mit Fluoreszenzmikroskopie und der Überwachung der Fruchtreifung im Feld. Die Auswahl der Bestäubersorten wird bewertet, indem die Identifizierung von S-Genotypen durch PCR-Analyse mit der Überwachung der Blütezeit im Feld kombiniert wird. Die Kenntnis der Bestäubungsanforderungen von Sorten erleichtert die Auswahl von Sorten für die Gestaltung neuer Obstgärten und ermöglicht die frühzeitige Erkennung von Produktivitätsproblemen im Zusammenhang mit Bestäubungsmangel in etablierten Obstgärten.

Jede japanische Pflaumenblütenknospe enthält einen Blütenstand mit 1–3 Blüten. Wie bei anderen Steinobstarten besteht jede Blume aus vier Wirbeln: Karpell, Staubblätter, Blütenblätter und Kelchblätter, die an der Basis der Blüte zu einer Tasse verschmolzen sind. Blütenstrukturen sind kleiner als andere Steinfrüchte, mit einem kurzen und zerbrechlichen Stempel, der von den Staubblättern umgeben ist, die eine kleine Menge Pollenkörner enthalten. Bei voller Blüte erscheinen die Blüten jedes Blütenstandes a...

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Establishing Pollination Requirements in Japanese Plum by Phenological Monitoring, Hand Pollinations, Fluorescence Microscopy and Molecular Genotyping

Es wird eine Methodik zur Bestimmung des Bestäubungsbedarfs bei japanischen Pflaumen-Hybriden beschrieben, die Feld- und Laborbestäubungen und Beobachtungen von Pollenröhren unter der Fluoreszenzmikroskopie mit der Identifizierung von S-Genotypen mittels PCR und der Überwachung der Blüte für die Auswahl von Bestäubern kombiniert.

Ermittlung der Bestäubungsanforderungen in japanischen Pflaumen durch phänologische Überwachung, Handbestäubung, Fluoreszenzmikroskopie und molekulare Genotypisierung

The Japanese plum cultivars commonly grown are interspecific hybrids derived from crosses between the original Prunus salicina with other Prunus species. ...

This protocol is becoming increasingly important due to the high number of new self-incompatible Japanese plum cultivars with unknown pollination requirements. The main advantage of this technique is that it allows for the determination of the pollination requirements of cultivars by combining two complimentary approaches in field and laboratory conditions. This approach can also be applied to determine pollination requirements and other self-incompatible fruit tree species like apricot or sweet cherry.For pollen extraction, collect flower buds at balloon stage according to stage 57 on the BBCH scale. Remove the anthers using a plastic mesh and place them on paper at room temperature for 24 hours until anther dehiscence. Sieve the pollen grains through a fine mesh and conserve them in a 10 millimeter glass tube with a cap at four degrees Celsius until use.When 10 to 20%of the flowers are open, select and label several branches, leaving 1, 000 to 1, 500 flowers per pollination treatment. On the next day, when more flowers are open, pollinate each flower using a paintbrush with pollen from the same cultivar for self-pollination and pollen from other cultivars as cross-pollination control. Pollinate every day until all flowers are open.Record weekly counts of flowers and developing fruits from anthesis to harvest to characterize the fruit drop pattern and quantify the final fruit set in each pollination treatment. Collect 50 to 100 flowers at balloon stage according to stage 57 on the BBCH scale. Emasculate 30 flowers per treatment in the laboratory for self and cross-pollination.Make a fresh cut on the base of each flower pedicle under water and place it on a piece of wet florist foam. Use one piece of foam for each pollination treatment. After 24 hours, hand pollinate each pistil with the pollen collected previously using a fine paintbrush.Pollinate one set of pistils with pollen from the same cultivar and the other set with pollen from another compatible cultivar as control. Fix these pollinated pistils in a fixative solution of ethanol and acetic acid for at least 24 hours at four degrees Celsius. Spread the pollen of each cultivar previously used as a pollen donor in the pollinations in two Petri dishes and incubate them at 25 degrees Celsius for 24 hours.To observe the pollen grains, add two to three drops of aniline blue solution to each Petri dish and observe them under a UV epifluorescence microscope after five minutes. Count viable and non-viable pollen grains in the three fields per Petri dish with each field containing about 100 to 200 pollen grains in two Petri dishes for each cultivar. To observe the pollen tubes, squash softened pistils in a drop of 1%aniline blue solution under a cover glass on a slide.Observe the pollen tube growth along the style under a microscope with UV epifluorescence using exciter filter BP340-390 and barrier filter LP425. Collect three to four young leaves from each cultivar in the field and extract DNA from the leaves. Set up a master mix for each pair of primers in 1.5 milliliter micro tubes.Add all reagents and mix thoroughly. Aliquot 16 microliters of this master mix into each 200 microliter PCR tube containing four microliters of DNA template or control. Mix them gently, close the caps and centrifuge at 2, 000 times G for 30 seconds.Place the tube in the thermocycler and run the PCR program as mentioned in the text manuscript. For estimating the fragment size by gel electrophoresis, load the first and last wells with two microliters of the DNA ladder and three microliters of the PCR product in the other wells. Close the chamber and run the gel at 100 volts for 30 minutes.Observe the gel under UV light using a gel imaging system. Use the DNA ladder to estimate the size of the amplified fragments and compare it with the positive and negative controls. Monitor the phenology of different trees of each cultivar over different years of flowering.Establish the length of the flowering period from the first to the last open flowers. Full bloom is considered when at least 50%of flowers are at stage F according to stage 65 on the BBCH. The pattern of fruit drop of hand pollinated flowers after emasculation or supplementary pollination showed that most flowers dropped two to three weeks after pollination, but 4%of self-pollinated flowers remained in the tree, indicating that this cultivar is self-compatible.Viable pollen grains showed a pollen tube longer than its length after 24 hours in the culture medium and non-viable pollen grains did not germinate. During pollination, pollen grains were transferred to the stigma. Each germinating pollen grain produced a pollen tube, which grew through the pistil structures.In self-incompatible cultivars, the pollen tube stopped growing in the upper third of the style. However, in self-compatible cultivars, the pollen tube could grow through the style, reach the ovary and fertilize an ovule. PCR analysis was carried out using primers from the conserved regions of sRNAs of sweet cherry and Japanese plum, making it possible to determine the size of S-alleles in each cultivar.The length of the flowering period for a total of four years was calculated. Flowering in orchard conditions allowed the determination of which cultivars are coincident at flowering time each year. When attempting this protocol, make sure to use a higher number of flowers of Japanese plum for hand pollinations since the percentage of fruit set is very low compared to other Prunus species.It is not possible to determine self-incompatibility by molecular approaches. Further work of S-allele sequencing is required to assess if some S-alleles are associated with self-compatibility. The combination of field and laboratory approaches has resulted in valuable information for the design of new commercial orchards and can be used in other fruit tree species.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP)

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Mess Protein Stabilität in Wohnzebrafischembryonen unter Einsatz von Fluoreszenz Decay Nach Photokonversion (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Primary Endodermal Epithelial Cell Culture from the Yolk Sac Membrane of Japanese Quail Embryos

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We established an endodermal epithelial cell culture model (EEC) for studying the function of certain enzymes and proteins in mediating nutrient ...

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Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

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Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

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Lichtblatt-basierte Fluoreszenzmikroskopie lebender oder fixiert und gefärbt<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; Embry

The red flour beetle Tribolium castaneum has become an important insect model organism in developmental genetics and evolutionary developmental biology. ...

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Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

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Single-Cell Quantification of Protein Degradation Rates by Time-Lapse Fluorescence Microscopy in Adherent Cell Culture

Einzellige Quantifizierung der Protein-Abbauraten von Time-Lapse Fluoreszenzmikroskopie in adhärente Zellkultur

Proteins are in a dynamic state of synthesis and degradation and their half-lives can be adjusted under various circumstances. However, most commonly used ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

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Handy-Aggregation-Assays, die Bindung der Drosophila Kerbe mit Transzu bewerten-Liganden und ihre Hemmung von Cis-Liganden

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...