Name: establishing pollination requirements in japanese plum by phenological monitoring, hand pollinations, fluorescence microscopy and molecular genotyping
Uploaded: 2020-11-09T15:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishing Pollination Requirements in Japanese Plum by Phenological Monitoring, Hand Pollinations, Fluorescence Microscopy and Molecular Genotyping at JoVE

מחקר זה מומן על ידי המכון הלאומי לחקר y Tecnología אגריה y Alimentaria (RFP2015-00015-00 ו RTA2017-00003-00); Gobierno de Aragón – הקרן החברתית האירופית, האיחוד האירופי (Grupo Consolidado A12-17R) ו חונטה דה אקסטרמדורה — פונדו אירופה דה דסארולו אזורי (FEDER), Plan Regional de Investigación (IB16181), Grupo de Investigación (AGA001, GR18196). B.I. Guerrero נתמך על ידי מלגה של Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología של מקסיקו (CONACYT, 471839).

1. האבקה ידנית בשטח
<ol><li>
מיצוי אבקה
	<ol>
<li>כדי להשיג אבקה, לאסוף ניצני פרחים בשלב D24, על פי שלב 57 בסולם BBCH25,26. הערה: יותר ניצני פרחים נחוצים בשזיף יפני מאשר במינים אחרים של פרונוס מכיוון שהאנטרים שלהם מייצרים פחות אבקה.</li>
		<li>הסר את a...

המתודולוגיה המתוארת כאן לדרישות האבקה של פולחנים שזיפים יפניים דורשת קביעת התאימות העצמית של כל כת על ידי האבקות מבוקרות בתחום או במעבדה, ותצפית לאחר מכן של צמיחת צינור אבקה עם מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. מערכות היחסים של אי-תאימות נוצרות על ידי אפיון של S-alleles על ידי genotyping מולקולרי. לב?...

שזיף יפני(פרונוס סליצילינה לינדל) הוא יליד סין1. במאה ה -19, יבול זה הוצג מיפן לארצות הברית, שם הוא היה שזור עם שזיפים דיפלואידים אחרים בצפון אמריקה2. במאהה-20, חלק מההיברידים האלה התפשטו לאזורים ממוזגים ברחבי העולם. כיום, המונח "שזיף יפני" מתייחס למגוון רחב של היברידיות בין-מיניות שמקורן בצלבים בין P. salicina המקורי עם עד 15 פרונוס דיפלואידים אחרים עמ'3,4,5.
שזיף יפני, כמו מינים אחרים של משפחת Rosaceae, מציג Gametophytic עצמית אי תאימות (GSI), אשר נשלט על ידי אחד מאוד polymorphic S- לוקוס המכיל אללים מרובים6. ה- S-לוקוסמכיל שני גנים המקודדים ריבונוקלאז(S-RNase)המתבטא בפסטיל, וחלבון F-box (SFB) המתבטא בגרגר האבקה7. בתגובת אי הכשירות העצמית, כאשר S-allele לידי ביטוי גרגר האבקה (הפלואיד) זהה לאחד מהשניים המבוטאים ב pistil (diploid), הצמיחה של צינור האבקה על פני הסגנון נעצר עקב השפלה של צינור האבקה RNA על ידי הפעולה של S-RNase8. מאז תהליך זה מונע הפריה של gametophyte הנשי בovule, GSI מקדם את outcrossing בין cultivars.
למרות שחלק מכת השזיפים היפנית תואמת את עצמה, רוב הפולחנים הגדלים כיום אינם תואמים את עצמם, והם זקוקים לאבקה מתורמים בין-תואמים כדי להפרות את הפרחים שלהם3. במיני פרי אבן מסוג פרונוס כגוןשקדים 9, משמש10,11,12 ודובדבן מתוק13, דרישות האבקה של cultivars ניתן לקבוע על ידי גישות שונות. תאימות עצמית (in) יכולה להיקבע על ידי האבקה עצמית של פרחים בשטח וניטור לאחר מכן של ערכת פירות, או על ידי האבקה עצמית של חצי ויוו בתנאים מבוקרים במעבדה ותצפית של צינורות אבקה מתחת למיקרוסקופ14,15,16,17,18 . יחסי אי התאמה בין cultivars ניתן לקבוע על ידי האבקות צולבות בתחום או במעבדה באמצעות אבקה של cultivar מאביקים פוטנציאליים, ועל ידי זיהוי S-alleles של כל cultivar על ידי ניתוח PCR14,15,16,19,20,21,22 . במינים כגון דובדבן מתוק או שקדים, התאימות העצמית (in)ניתן להעריך גם על ידי זיהוי של אלס S מסוים הקשורים לתאימות עצמית, כמו S4' בדובדבן מתוק13 או Sf בשקדים23.
מספר תוכניות גידול שזיפים מהמדינות המייצרות העיקריות משחררות מספר cultivarsחדשים 2,14, רבים מהם עם דרישות האבקה לא ידועות. בעבודה זו, מתודולוגיה לקביעת דרישות האבקה בהיברידיות מסוג שזיף יפני מתוארת. תאימות עצמית נקבעת על ידי האבקה עצמית הן בתחום והן במעבדה, ואחריהן תצפיות של צינורות אבקה תחת מיקרוסקופיית הפלואורסצנטיות. מבחר של cultivars מאביקים משלב את הזיהוי של S-genotypes על ידי ניתוח PCR עם ניטור של זמן פריחה בתחום.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic Acid Glacial</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>131008.1611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>iNtRON Biotechnology</td>
			<td>25999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aniline blue</td>
			<td>Difco</td>
			<td>8504-88</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric Acid (H3BO4)</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>131015.1210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Nitrate 4-hydrate (Ca(NO3)2&#183;4H2O)</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>131231.1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass</td>
			<td>Deltalab</td>
			<td>D102460</td>
			<td>24 mm x 60 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Camera</td>
			<td>Imaging Developmet Systems</td>
			<td>UI-1490SE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Camera Software Suite</td>
			<td>Imaging Developmet Systems</td>
			<td>4.93.0.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Oligos</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Mix, 10 mM each</td>
			<td>ThermoSischer Scientific</td>
			<td>R0193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DreamTaq Green DNA polymerase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>EP0713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 96&#176;</td>
			<td>VWR-Chemicals</td>
			<td>83804.360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1Kb DNA Ladder (U.S. Patent No. 4.403.036) (500pb-12Kb)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15615-016</td>
			<td>Size: 250&#181;g; Conc: 1.0 &#181;g/&#181;l</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Documentation System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand Counter</td>
			<td>Tamaco</td>
			<td>TM-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Lab Software</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td>Image Analyse System for Gel Documentation System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaPhor Agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge 5415 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z605212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope with UV epiflurescence</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM2500</td>
			<td>Exciter filter BP340-390, Barrier filter LP425</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microslides</td>
			<td>Deltalab</td>
			<td>D100004</td>
			<td>26 mm x 76 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Electrophoresis System</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>14955170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minicentrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15334204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 1000 Spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes</td>
			<td>Deltalab</td>
			<td>200201</td>
			<td>55 mm x 14 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Tribasic (K3PO4&#183;1.5H2O)</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>141513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer forward &#39;Pru C2&#39;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer forward Pru T2&#39;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer reverse &#39;PCER&#39;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RedSafe Nucleic Acid Staining Solution</td>
			<td>iNtRON Biotechnology</td>
			<td>21141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saccharose</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>131621.1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium sulphite anhydrous (Na2SO3)</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>131717.1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Speedtools plant DNA extraction Kit</td>
			<td>Biotools</td>
			<td>21272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBE Buffer (10X)</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>A0972,5000PE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal Cycler T100</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer comfort</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>T1317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Autoclave Presoclave II</td>
			<td>JP Selecta</td>
			<td>4001725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>11746744</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishing pollination requirements in japanese plum by phenological monitoring, hand pollinations, fluorescence microscopy and molecular genotyping

פולחן השזיפים היפני שגודל בדרך כלל הוא בני כלאיים בין-מיניים שמקורם בצלבים בין סליצ'ינה פרונוס המקורית לבין מינים אחרים של פרונוס. רוב ההיברידים מפגינים אי-תאימות עצמית משחקטופיטית, הנשלטת על ידי S-לוקוס יחיד ופולימורפי מאוד המכיל אללים מרובים. רוב ההיברידים המעובדים אינם תואמים את עצמם וצריכים אבקה מתורם תואם כדי להפרות את הפרחים שלהם. קביעת דרישות האבקה בשזיף היפני הופכת חשובה יותר ויותר בשל המספר הגבוה של cultivars חדשים עם דרישות האבקה לא ידועות. בעבודה זו, מתודולוגיה לקביעת דרישות האבקה בהיברידיות מסוג שזיף יפני מתוארת. התאימות העצמית נקבעת על ידי האבקות ידניות הן בתחום והן במעבדה, ולאחר מכן ניטור התארכות צינור האבקה באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, וגם ניטור התבגרות פירות בתחום. מבחר של cultivars מאביקים מוערך על ידי שילוב זיהוי של S-genotypes על ידי ניתוח PCR עם ניטור של זמן פריחה בתחום. הכרת דרישות ההאבקה של cultivars מקלה על בחירת cultivars לעיצוב פרדסים חדשים ומאפשרת גילוי מוקדם של בעיות פרודוקטיביות הקשורות עם חוסר האבקה בפרדסים מבוססים.

כל ניצן פרח שזיף יפני מכיל תפרחת עם 1-3 פרחים. כמו במיני פרי אבן אחרים, כל פרח מורכב מארבעה פרחים: קרפל, פסלנים, עלי כותרת וספלים, אשר מותכים ויוצרים בבסיס הפרח. מבני הפרחים קטנים יותר מפירות אבן אחרים, עם פסטיל קצר ושברירי מוקף אבקנים המכילים כמות קטנה של גרגרי אבקה. בפריחה מלאה, הפרחים של כל ת?...

Watch this Scientific Journal Video about Establishing Pollination Requirements in Japanese Plum by Phenological Monitoring, Hand Pollinations, Fluorescence Microscopy and Molecular Genotyping at JoVE

Establishing Pollination Requirements in Japanese Plum by Phenological Monitoring, Hand Pollinations, Fluorescence Microscopy and Molecular Genotyping

מתודולוגיה לקביעת דרישות האבקה בהיברידיות מסוג שזיף יפני מתוארת, המשלבת האבקות שדה ומעבדות ותצפיות של צינורות אבקה תחת מיקרוסקופיית פלואורסצנטיות עם זיהוי של S-genotypes על ידי PCR וניטור הפריחה לבחירת מאביקים.

קביעת דרישות האבקה בשזיף היפני על ידי ניטור פנולוגי, האבקות ביד, מיקרוסקופיה פלואורסצנטית וגנוטיפינג מולקולרי

The Japanese plum cultivars commonly grown are interspecific hybrids derived from crosses between the original Prunus salicina with other Prunus species. ...

This protocol is becoming increasingly important due to the high number of new self-incompatible Japanese plum cultivars with unknown pollination requirements. The main advantage of this technique is that it allows for the determination of the pollination requirements of cultivars by combining two complimentary approaches in field and laboratory conditions. This approach can also be applied to determine pollination requirements and other self-incompatible fruit tree species like apricot or sweet cherry.For pollen extraction, collect flower buds at balloon stage according to stage 57 on the BBCH scale. Remove the anthers using a plastic mesh and place them on paper at room temperature for 24 hours until anther dehiscence. Sieve the pollen grains through a fine mesh and conserve them in a 10 millimeter glass tube with a cap at four degrees Celsius until use.When 10 to 20%of the flowers are open, select and label several branches, leaving 1, 000 to 1, 500 flowers per pollination treatment. On the next day, when more flowers are open, pollinate each flower using a paintbrush with pollen from the same cultivar for self-pollination and pollen from other cultivars as cross-pollination control. Pollinate every day until all flowers are open.Record weekly counts of flowers and developing fruits from anthesis to harvest to characterize the fruit drop pattern and quantify the final fruit set in each pollination treatment. Collect 50 to 100 flowers at balloon stage according to stage 57 on the BBCH scale. Emasculate 30 flowers per treatment in the laboratory for self and cross-pollination.Make a fresh cut on the base of each flower pedicle under water and place it on a piece of wet florist foam. Use one piece of foam for each pollination treatment. After 24 hours, hand pollinate each pistil with the pollen collected previously using a fine paintbrush.Pollinate one set of pistils with pollen from the same cultivar and the other set with pollen from another compatible cultivar as control. Fix these pollinated pistils in a fixative solution of ethanol and acetic acid for at least 24 hours at four degrees Celsius. Spread the pollen of each cultivar previously used as a pollen donor in the pollinations in two Petri dishes and incubate them at 25 degrees Celsius for 24 hours.To observe the pollen grains, add two to three drops of aniline blue solution to each Petri dish and observe them under a UV epifluorescence microscope after five minutes. Count viable and non-viable pollen grains in the three fields per Petri dish with each field containing about 100 to 200 pollen grains in two Petri dishes for each cultivar. To observe the pollen tubes, squash softened pistils in a drop of 1%aniline blue solution under a cover glass on a slide.Observe the pollen tube growth along the style under a microscope with UV epifluorescence using exciter filter BP340-390 and barrier filter LP425. Collect three to four young leaves from each cultivar in the field and extract DNA from the leaves. Set up a master mix for each pair of primers in 1.5 milliliter micro tubes.Add all reagents and mix thoroughly. Aliquot 16 microliters of this master mix into each 200 microliter PCR tube containing four microliters of DNA template or control. Mix them gently, close the caps and centrifuge at 2, 000 times G for 30 seconds.Place the tube in the thermocycler and run the PCR program as mentioned in the text manuscript. For estimating the fragment size by gel electrophoresis, load the first and last wells with two microliters of the DNA ladder and three microliters of the PCR product in the other wells. Close the chamber and run the gel at 100 volts for 30 minutes.Observe the gel under UV light using a gel imaging system. Use the DNA ladder to estimate the size of the amplified fragments and compare it with the positive and negative controls. Monitor the phenology of different trees of each cultivar over different years of flowering.Establish the length of the flowering period from the first to the last open flowers. Full bloom is considered when at least 50%of flowers are at stage F according to stage 65 on the BBCH. The pattern of fruit drop of hand pollinated flowers after emasculation or supplementary pollination showed that most flowers dropped two to three weeks after pollination, but 4%of self-pollinated flowers remained in the tree, indicating that this cultivar is self-compatible.Viable pollen grains showed a pollen tube longer than its length after 24 hours in the culture medium and non-viable pollen grains did not germinate. During pollination, pollen grains were transferred to the stigma. Each germinating pollen grain produced a pollen tube, which grew through the pistil structures.In self-incompatible cultivars, the pollen tube stopped growing in the upper third of the style. However, in self-compatible cultivars, the pollen tube could grow through the style, reach the ovary and fertilize an ovule. PCR analysis was carried out using primers from the conserved regions of sRNAs of sweet cherry and Japanese plum, making it possible to determine the size of S-alleles in each cultivar.The length of the flowering period for a total of four years was calculated. Flowering in orchard conditions allowed the determination of which cultivars are coincident at flowering time each year. When attempting this protocol, make sure to use a higher number of flowers of Japanese plum for hand pollinations since the percentage of fruit set is very low compared to other Prunus species.It is not possible to determine self-incompatibility by molecular approaches. Further work of S-allele sequencing is required to assess if some S-alleles are associated with self-compatibility. The combination of field and laboratory approaches has resulted in valuable information for the design of new commercial orchards and can be used in other fruit tree species.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP)

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP

מדידת יציבות חלבון בחיים עוברי דג הזברה שימוש הקרינה רדיואקטיבית לאחר photoconversion (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological ...

Primary Endodermal Epithelial Cell Culture from the Yolk Sac Membrane of Japanese Quail Embryos

הראשי Endodermal אפיתל תרבית תאים מן קרום צק החלמון של עוברים יפניים שליו

We established an endodermal epithelial cell culture model (EEC) for studying the function of certain enzymes and proteins in mediating nutrient ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

ניתוח של פיתוח כליה דג הזברה עם זמן לשגות הדמיה באמצעות מיקרוסקופ לנתח מצויד עבור חתך אופטי

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי גיליון אור פיתוח תמונה דג הזברה העין

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

גיליון מבוסס אור מיקרוסקופ פלואורסצנטי של חיים או קבוע מוכתמת<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; עובר

The red flour beetle Tribolium castaneum has become an important insect model organism in developmental genetics and evolutionary developmental biology. ...

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

רזולוציה סופר correlative ואלקטרון לפתרון חלבון לוקליזציה ברשתית דג זברה

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

ניתוח Immunofluorescent מכתים של פטריות הגוף והנפש ומה קולט אור נוירונים במוח למבוגרים דרוזופילה melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Single-Cell Quantification of Protein Degradation Rates by Time-Lapse Fluorescence Microscopy in Adherent Cell Culture

תא בודד כימות של חלבון השפלה המחירים על-ידי קרינה פלואורסצנטית זמן לשגות מיקרוסקופ בתרבות תא חסיד

Proteins are in a dynamic state of synthesis and degradation and their half-lives can be adjusted under various circumstances. However, most commonly used ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

תא מבחני צבירה כדי להעריך את הכריכה של החריץ דרוזופילה עם טרנס-ליגנדים וניגוד שלה על ידי חבר העמים-ליגנדים

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...