Name: establishing pollination requirements in japanese plum by phenological monitoring, hand pollinations, fluorescence microscopy and molecular genotyping
Uploaded: 2020-11-09T15:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishing Pollination Requirements in Japanese Plum by Phenological Monitoring, Hand Pollinations, Fluorescence Microscopy and Molecular Genotyping at JoVE

Questa ricerca è stata finanziata dall'Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (RFP2015-00015-00 e RTA2017-00003-00); Gobierno de Aragón —Fondo sociale europeo, Unione europea (Grupo Consolidado A12-17R) e Junta de Extremadura —Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER), Plan Regional de Investigación (IB16181), Grupo de Investigación (AGA001, GR18196). B.I. Guerrero è stato sostenuto da una borsa di studio del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología del Messico (CONACYT, 471839).

1. Impollinazione manuale sul campo
<ol><li>
Estrazione del polline
	<ol>
<li>Per ottenere il polline, raccogliere i boccioli di fiori allo stadio D24, secondo lo stadio 57 sulla scala BBCH25,26. NOTA: Sono necessari più boccioli di fiori nella prugna giapponese che in altre specie di Prunus perché le loro antere producono meno polline.</li>
		<li>Rimuovere le antere utilizzando una rete di plastica (dimens...

La metodologia qui descritta per i requisiti di impollinazione delle cultivar di prugne giapponesi richiede la determinazione dell'auto-(in)compatibilità di ciascuna cultivar mediante impollinazioni controllate sul campo o in laboratorio e la successiva osservazione della crescita del tubo pollinico con microscopia a fluorescenza. Le relazioni di incompatibilità sono stabilite dalla caratterizzazione degli alleli Smediante genotipizzazione molecolare. Infine, la selezione degli impollinatori viene eseguita dal...

La prugna giapponese (Prunus salicina Lindl.) è originaria della Cina1. Nel 19 ° secolo, questacoltura è stata introdotta dal Giappone negli Stati Uniti, dove è stata incrociata con altre prugne diploidi nordamericane2. Nel 20° secolo, alcuni di questi ibridi sono stati diffusi nelle regioni temperate di tutto il mondo. Al giorno d'oggi, il termine "prugna giapponese" si riferisce a una vasta gamma di ibridi interspecifici derivati da incroci tra l'originale P. salicina con fino a 15 altri diploidi Prunus spp.3,4,5.
La prugna giapponese, come altre specie della famiglia delle Rosacee, presenta l'auto-incompatibilità gametofita (GSI), che è controllata da un singolo e altamente polimorfo S-locuscontenente più alleli6. Il -locus Scontiene due geni che codificano per una ribonucleasi (S-RNasi) espressa nel pistillo, e una proteina F-box (SFB) espressa nel granello di polline7. Nella reazione di auto-incompatibilità, quando l'allele Sespresso nel granello di polline (aploide) è lo stesso di uno dei due espressi nel pistillo (diploide), la crescita del tubo pollinico attraverso lo stile viene arrestata a causa della degradazione dell'RNA del tubo pollinico da parte dell'azione della S-RNasi8. Poiché questo processo impedisce la fecondazione del gametofito femminile nell'ovulo, GSI promuove l'outcrossing tra cultivar.
Sebbene alcune cultivar di prugne giapponesi siano autocompatibili, la maggior parte delle cultivar attualmente coltivate sono auto-incompatibili e hanno bisogno di polline da donatori intercompatibili per fertilizzare i loro fiori3. Nelle specie di drupacee del genere Prunus come la mandorla9,l'albicocca10,11, 12 e la ciliegiadolce 13,i requisiti di impollinazione delle cultivar possono essere stabiliti da diversi approcci. L'auto-(in)compatibilità può essere determinata dall'autoimpollinazione dei fiori in campo e dal successivo monitoraggio dell'allegagione, o dalle autoimpollinazioni semi-in vivo in condizioni controllate in laboratorio e dall'osservazione di tubi di polline al microscopio14,15,16,17,18 . Le relazioni di incompatibilità tra cultivar possono essere determinate da impollinazioni incrociate in campo o in laboratorio utilizzando polline della cultivar potenziale impollinatrice e dall'identificazione diS-alleli di ciascuna cultivar mediante analisi PCR14,15,16,19,20,21,22 . In specie come la ciliegia dolce o la mandorla, l'auto(in)compatibilità può essere valutata anche mediante l'identificazione di particolari alleli S associati all'autocompatibilità, come S4' nella ciliegia dolce13 o Sf nella mandorla23.
Diversi programmi di allevamento di prugne dei principali paesi produttori stanno rilasciando una serie di nuove cultivar2,14,molte delle quali con requisiti di impollinazione sconosciuti. In questo lavoro, viene descritta una metodologia per la determinazione dei requisiti di impollinazione negli ibridi giapponesi di tipo prugna. L'auto-(in)compatibilità è determinata da autoimpollinazioni sia sul campo che in laboratorio, seguite da osservazioni di tubi di polline sotto la microscopia a fluorescenza. La selezione delle cultivar impollinatori combina l'identificazione dei genotipi Smediante analisi PCR con il monitoraggio del tempo di fioritura in campo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic Acid Glacial</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>131008.1611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>iNtRON Biotechnology</td>
			<td>25999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aniline blue</td>
			<td>Difco</td>
			<td>8504-88</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric Acid (H3BO4)</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>131015.1210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Nitrate 4-hydrate (Ca(NO3)2&#183;4H2O)</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>131231.1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass</td>
			<td>Deltalab</td>
			<td>D102460</td>
			<td>24 mm x 60 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Camera</td>
			<td>Imaging Developmet Systems</td>
			<td>UI-1490SE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Camera Software Suite</td>
			<td>Imaging Developmet Systems</td>
			<td>4.93.0.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Oligos</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Mix, 10 mM each</td>
			<td>ThermoSischer Scientific</td>
			<td>R0193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DreamTaq Green DNA polymerase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>EP0713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 96&#176;</td>
			<td>VWR-Chemicals</td>
			<td>83804.360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1Kb DNA Ladder (U.S. Patent No. 4.403.036) (500pb-12Kb)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15615-016</td>
			<td>Size: 250&#181;g; Conc: 1.0 &#181;g/&#181;l</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Documentation System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand Counter</td>
			<td>Tamaco</td>
			<td>TM-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Lab Software</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td>Image Analyse System for Gel Documentation System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaPhor Agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge 5415 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z605212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope with UV epiflurescence</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM2500</td>
			<td>Exciter filter BP340-390, Barrier filter LP425</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microslides</td>
			<td>Deltalab</td>
			<td>D100004</td>
			<td>26 mm x 76 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Electrophoresis System</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>14955170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minicentrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15334204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 1000 Spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes</td>
			<td>Deltalab</td>
			<td>200201</td>
			<td>55 mm x 14 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Tribasic (K3PO4&#183;1.5H2O)</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>141513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer forward &#39;Pru C2&#39;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer forward Pru T2&#39;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer reverse &#39;PCER&#39;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RedSafe Nucleic Acid Staining Solution</td>
			<td>iNtRON Biotechnology</td>
			<td>21141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saccharose</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>131621.1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium sulphite anhydrous (Na2SO3)</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>131717.1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Speedtools plant DNA extraction Kit</td>
			<td>Biotools</td>
			<td>21272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBE Buffer (10X)</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>A0972,5000PE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal Cycler T100</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer comfort</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>T1317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Autoclave Presoclave II</td>
			<td>JP Selecta</td>
			<td>4001725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>11746744</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishing pollination requirements in japanese plum by phenological monitoring, hand pollinations, fluorescence microscopy and molecular genotyping

Le cultivar di prugne giapponesi comunemente coltivate sono ibridi interspecifici derivati da incroci tra l'originale Prunus salicina con altre specie di Prunus. La maggior parte degli ibridi presenta un'auto-incompatibilità gametofita, che è controllata da un singolo e altamente polimorfo S-locus che contiene più alleli. La maggior parte degli ibridi coltivati sono auto-incompatibili e hanno bisogno di polline da un donatore compatibile per fertilizzare i loro fiori. Stabilire i requisiti di impollinazione nella prugna giapponese sta diventando sempre più importante a causa dell'elevato numero di nuove cultivar con requisiti di impollinazione sconosciuti. In questo lavoro, viene descritta una metodologia per la determinazione dei requisiti di impollinazione negli ibridi giapponesi di tipo prugna. L'auto(in)compatibilità è determinata dall'impollinazione manuale sia sul campo che in laboratorio, seguita dal monitoraggio dell'allungamento del tubo pollinico con microscopia a fluorescenza e anche dal monitoraggio della maturazione dei frutti sul campo. La selezione delle cultivar impollinatori viene valutata combinando l'identificazione dei genotipi Smediante analisi PCR con il monitoraggio del tempo di fioritura in campo. Conoscere le esigenze di impollinazione delle cultivar facilita la selezione delle cultivar per la progettazione di nuovi frutteti e consente la diagnosi precoce dei problemi di produttività legati alla carenza di impollinazione nei frutteti consolidati.

Ogni bocciolo di fiore di prugna giapponese contiene un'infiorescenza con 1-3 fiori. Come in altre specie di drupacee, ogni fiore è composto da quattro spirali: carpello, stami, petali e sepali, che si fondono formando una coppa alla base del fiore. Le strutture floreali sono più piccole di altri frutti a nocciolo, con un pistillo corto e fragile circondato dagli stami che contengono una piccola quantità di grani di polline. A piena fioritura, i fiori di ogni infiorescenza appaiono separati su brevi gambi, mostrando i...

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Establishing Pollination Requirements in Japanese Plum by Phenological Monitoring, Hand Pollinations, Fluorescence Microscopy and Molecular Genotyping

Viene descritta una metodologia per la determinazione dei requisiti di impollinazione negli ibridi giapponesi di tipo prugna, che combina le impollinazioni sul campo e in laboratorio e le osservazioni dei tubi pollinici sotto la microscopia a fluorescenza con l'identificazione dei genotipi Smediante PCR e il monitoraggio della fioritura per la selezione degli impollinatori.

Stabilire i requisiti di impollinazione nella prugna giapponese mediante monitoraggio fenologico, impollinazione manuale, microscopia a fluorescenza e genotipizzazione molecolare

The Japanese plum cultivars commonly grown are interspecific hybrids derived from crosses between the original Prunus salicina with other Prunus species. ...

This protocol is becoming increasingly important due to the high number of new self-incompatible Japanese plum cultivars with unknown pollination requirements. The main advantage of this technique is that it allows for the determination of the pollination requirements of cultivars by combining two complimentary approaches in field and laboratory conditions. This approach can also be applied to determine pollination requirements and other self-incompatible fruit tree species like apricot or sweet cherry.For pollen extraction, collect flower buds at balloon stage according to stage 57 on the BBCH scale. Remove the anthers using a plastic mesh and place them on paper at room temperature for 24 hours until anther dehiscence. Sieve the pollen grains through a fine mesh and conserve them in a 10 millimeter glass tube with a cap at four degrees Celsius until use.When 10 to 20%of the flowers are open, select and label several branches, leaving 1, 000 to 1, 500 flowers per pollination treatment. On the next day, when more flowers are open, pollinate each flower using a paintbrush with pollen from the same cultivar for self-pollination and pollen from other cultivars as cross-pollination control. Pollinate every day until all flowers are open.Record weekly counts of flowers and developing fruits from anthesis to harvest to characterize the fruit drop pattern and quantify the final fruit set in each pollination treatment. Collect 50 to 100 flowers at balloon stage according to stage 57 on the BBCH scale. Emasculate 30 flowers per treatment in the laboratory for self and cross-pollination.Make a fresh cut on the base of each flower pedicle under water and place it on a piece of wet florist foam. Use one piece of foam for each pollination treatment. After 24 hours, hand pollinate each pistil with the pollen collected previously using a fine paintbrush.Pollinate one set of pistils with pollen from the same cultivar and the other set with pollen from another compatible cultivar as control. Fix these pollinated pistils in a fixative solution of ethanol and acetic acid for at least 24 hours at four degrees Celsius. Spread the pollen of each cultivar previously used as a pollen donor in the pollinations in two Petri dishes and incubate them at 25 degrees Celsius for 24 hours.To observe the pollen grains, add two to three drops of aniline blue solution to each Petri dish and observe them under a UV epifluorescence microscope after five minutes. Count viable and non-viable pollen grains in the three fields per Petri dish with each field containing about 100 to 200 pollen grains in two Petri dishes for each cultivar. To observe the pollen tubes, squash softened pistils in a drop of 1%aniline blue solution under a cover glass on a slide.Observe the pollen tube growth along the style under a microscope with UV epifluorescence using exciter filter BP340-390 and barrier filter LP425. Collect three to four young leaves from each cultivar in the field and extract DNA from the leaves. Set up a master mix for each pair of primers in 1.5 milliliter micro tubes.Add all reagents and mix thoroughly. Aliquot 16 microliters of this master mix into each 200 microliter PCR tube containing four microliters of DNA template or control. Mix them gently, close the caps and centrifuge at 2, 000 times G for 30 seconds.Place the tube in the thermocycler and run the PCR program as mentioned in the text manuscript. For estimating the fragment size by gel electrophoresis, load the first and last wells with two microliters of the DNA ladder and three microliters of the PCR product in the other wells. Close the chamber and run the gel at 100 volts for 30 minutes.Observe the gel under UV light using a gel imaging system. Use the DNA ladder to estimate the size of the amplified fragments and compare it with the positive and negative controls. Monitor the phenology of different trees of each cultivar over different years of flowering.Establish the length of the flowering period from the first to the last open flowers. Full bloom is considered when at least 50%of flowers are at stage F according to stage 65 on the BBCH. The pattern of fruit drop of hand pollinated flowers after emasculation or supplementary pollination showed that most flowers dropped two to three weeks after pollination, but 4%of self-pollinated flowers remained in the tree, indicating that this cultivar is self-compatible.Viable pollen grains showed a pollen tube longer than its length after 24 hours in the culture medium and non-viable pollen grains did not germinate. During pollination, pollen grains were transferred to the stigma. Each germinating pollen grain produced a pollen tube, which grew through the pistil structures.In self-incompatible cultivars, the pollen tube stopped growing in the upper third of the style. However, in self-compatible cultivars, the pollen tube could grow through the style, reach the ovary and fertilize an ovule. PCR analysis was carried out using primers from the conserved regions of sRNAs of sweet cherry and Japanese plum, making it possible to determine the size of S-alleles in each cultivar.The length of the flowering period for a total of four years was calculated. Flowering in orchard conditions allowed the determination of which cultivars are coincident at flowering time each year. When attempting this protocol, make sure to use a higher number of flowers of Japanese plum for hand pollinations since the percentage of fruit set is very low compared to other Prunus species.It is not possible to determine self-incompatibility by molecular approaches. Further work of S-allele sequencing is required to assess if some S-alleles are associated with self-compatibility. The combination of field and laboratory approaches has resulted in valuable information for the design of new commercial orchards and can be used in other fruit tree species.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP)

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