Name: establishing pollination requirements in japanese plum by phenological monitoring, hand pollinations, fluorescence microscopy and molecular genotyping
Uploaded: 2020-11-09T15:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishing Pollination Requirements in Japanese Plum by Phenological Monitoring, Hand Pollinations, Fluorescence Microscopy and Molecular Genotyping at JoVE

이 연구는 Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y 알리멘타리아 (RFP2015-00015-00 및 RTA2017-00003-00);에 의해 투자되었습니다. 고비에르노 데 아라곤-유럽 사회 기금, 유럽 연합 (그루포 콘솔리다 A12-17R), 그리고 준타 드 엑스트레마두라 —폰도 유럽오 데 데사롤로 지역 (FEDER), 계획 지역 드 Investigación (IB16181), 그루포 드 Investigación (AGA001, GR1819). B.I. 게레로는 멕시코의 콘세조 나시오날 드 시엔시아 이 Tecnología (CONACYT, 471839)의 펠로우십에 의해 지원되었다.

1. 현장에서 수분 수분
<ol><li>
꽃가루 추출
	<ol>
<li>BBCH 스케일25,26의스테이지 57에 따르면 꽃가루를 얻으려면 스테이지 D24에서꽃봉오리를 수집하십시오. 참고: 다른 가지각선 종보다 일본 매화에서는 꽃봉오리가 더 적게 생산되기 때문에 꽃봉오리가 더 많이 필요합니다.</li>
		<li>플라스틱 메쉬(2mm x 2mm 모공 크기)?...

본원에 설명된 방법론은 일본 매실 품종의 수분 요건을 위해 필드 또는 실험실에서 제어된 오염물질에 의한 각 품종의 자체(in) 호환성을 결정하고, 형광 현미경으로 꽃가루 튜브 성장의 후속 관찰을 요구한다. 비호환성 관계는 분자 지노티핑에 의한 S-alleles의 특성화에 의해 확립된다. 마지막으로, 수분 제의 선택은 매년 꽃에서 일치하는 그 품종을 검출하기 위해 모니터링 phenology에 의해 ?...

일본 매화(프룬스 살리시나 린들)는 중국1이원산지입니다. 19세기에 일본에서 미국으로 이 작물이 도입되어 다른 북미 디플로이드 자두2와교차했습니다. 20세기에, 이러한 하이브리드의 일부는 전 세계 온대 지역으로 확산되었다. 요즘에는 "일본 매실"이라는 용어는 원래 P. 살리시나 사이의 십자가에서 파생된 광범위한 상호 특이적 하이브리드를 말하며, 최대 15개의 다른 디플리드 Prunus spp.3,4,5.
일본 매화는 Rosaceae 가족의 다른 종과 마찬가지로 여러알렐을포함하는 단일 및 고다형성 S-메큐에 의해 제어되는 게임토피틱 자기 비호환성(GSI)을 전시합니다. S-메뚜기는 피스틸로 발현된 리보누클레스(S-RNase)와 꽃가루 곡물7에서발현된 F박스 단백질(SFB)을 인코딩하는 두 개의 유전자를 함유하고 있다. 자가비호환성 반응에서, 꽃가루 곡물(haploid)으로 발현된 S-allele이 피슬틸(diploid)에 발현된 두 가지 중 하나와 동일할 때, 스타일 전반에 걸친 꽃가루 관RNA의 성장은 S-RNase8의작용에 의해 꽃가루 관 RNA의 저하로 인해 체포된다. 이 과정은 배란에서 여성 게임 토피의 수정을 방지하기 때문에, GSI는 품종 사이의 횡단을 촉진.
일부 일본 매실 품종은 자기 호환이지만, 현재 재배 된 대부분의 품종은 자기 호환되지 않으며, 자신의 꽃을 수정하기 위해 호환 되는 기증자의 꽃가루가 필요합니다3. 아몬드9,살구10,11,12 및 달콤한 체리13과같은 프루누스 속의 돌 과일 종에서는 품종의 수분 요구 사항을 다른 접근법에 의해 확립 할 수 있습니다. 자가(in)호환성은 현장에서 꽃의 자가 수분및 과일 세트의 후속 모니터링에 의해 결정될 수 있으며, 또는 실험실에서 제어된 조건에서 반 생체 자체 질립및 현미경14,15,16,17,18의 꽃가루 튜브 관찰에 의해 결정될 수있다. . 품종 간의 비호환성 관계는 잠재적 인 수분화 품종의 꽃가루를 사용하여 필드 또는 실험실에서 교차 오염에 의해 결정될 수 있으며, PCR 분석에 의해 각 품종의 S-alleles의 식별에 의해 결정될 수있다14,15,16,20,21,22 . 달콤한 체리 나 아몬드와 같은 종에서, 자체 (in)호환성은 또한 아몬드23에서달콤한 체리13 또는 Sf에서 S4'로 자기 호환성에 관련된 특정 S 알레일의 식별에 의해 평가 될 수있다.
주요 생산국의 여러 매실 사육 프로그램은 알 수없는 수분 요구 사항을 가진 새로운 품종2,14의숫자를 발표하고 있습니다. 이 작품에서는 일본 매화형 하이브리드의 수분 요건 을 결정하는 방법론이 설명되어 있다. 자기(in)호환성은 분야와 실험실 모두에서 자체 오염에 의해 결정되며, 그 다음에형광 현미경 검사의 꽃가루 튜브를 관찰합니다. 수분화 품종의 선택은 현장에서 꽃 시간의 모니터링과 PCR 분석에 의한 S-유전자형의 식별을 결합합니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic Acid Glacial</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>131008.1611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>iNtRON Biotechnology</td>
			<td>25999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aniline blue</td>
			<td>Difco</td>
			<td>8504-88</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric Acid (H3BO4)</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>131015.1210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Nitrate 4-hydrate (Ca(NO3)2&#183;4H2O)</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>131231.1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass</td>
			<td>Deltalab</td>
			<td>D102460</td>
			<td>24 mm x 60 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Camera</td>
			<td>Imaging Developmet Systems</td>
			<td>UI-1490SE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Camera Software Suite</td>
			<td>Imaging Developmet Systems</td>
			<td>4.93.0.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Oligos</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Mix, 10 mM each</td>
			<td>ThermoSischer Scientific</td>
			<td>R0193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DreamTaq Green DNA polymerase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>EP0713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 96&#176;</td>
			<td>VWR-Chemicals</td>
			<td>83804.360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1Kb DNA Ladder (U.S. Patent No. 4.403.036) (500pb-12Kb)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15615-016</td>
			<td>Size: 250&#181;g; Conc: 1.0 &#181;g/&#181;l</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Documentation System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand Counter</td>
			<td>Tamaco</td>
			<td>TM-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Lab Software</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td>Image Analyse System for Gel Documentation System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaPhor Agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge 5415 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z605212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope with UV epiflurescence</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM2500</td>
			<td>Exciter filter BP340-390, Barrier filter LP425</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microslides</td>
			<td>Deltalab</td>
			<td>D100004</td>
			<td>26 mm x 76 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Electrophoresis System</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>14955170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minicentrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15334204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 1000 Spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes</td>
			<td>Deltalab</td>
			<td>200201</td>
			<td>55 mm x 14 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Tribasic (K3PO4&#183;1.5H2O)</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>141513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer forward &#39;Pru C2&#39;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer forward Pru T2&#39;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer reverse &#39;PCER&#39;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RedSafe Nucleic Acid Staining Solution</td>
			<td>iNtRON Biotechnology</td>
			<td>21141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saccharose</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>131621.1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium sulphite anhydrous (Na2SO3)</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>131717.1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Speedtools plant DNA extraction Kit</td>
			<td>Biotools</td>
			<td>21272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBE Buffer (10X)</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>A0972,5000PE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal Cycler T100</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer comfort</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>T1317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Autoclave Presoclave II</td>
			<td>JP Selecta</td>
			<td>4001725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>11746744</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishing pollination requirements in japanese plum by phenological monitoring, hand pollinations, fluorescence microscopy and molecular genotyping

일반적으로 재배되는 일본 매실 품종은 원래 프룬누스 살리시나와 다른 프룬스 종 사이의 십자가에서 파생된 상호 특이적 하이브리드입니다. 대부분의 하이브리드는 여러 개의 알렐을 포함하는 단일 및 고다형성 S-메큐에 의해 제어되는 게임토피틱 자체 비호환성을 나타낸다. 대부분의 재배 하이브리드는 자체 호환되지 않으며 꽃을 비옥하게하기 위해 호환 되는 기증자의 꽃가루가 필요합니다. 일본 매화의 수분 요건을 확립하는 것은 알려지지 않은 수분 요건을 가진 새로운 품종의 수가 많기 때문에 점점 더 중요해지고 있습니다. 이 작품에서는 일본 매화형 하이브리드의 수분 요건 을 결정하는 방법론이 설명되어 있다. 자가(in)호환성은 분야와 실험실 모두에서 수작업 오염에 의해 결정되며, 그 다음으로 형광 현미경으로 꽃가루 튜브 신장을 모니터링하고 현장에서 과일 성숙을 모니터링합니다. 수분화 품종의 선택은 PCR 분석에 의한 S-유전자형의 식별과 현장에서의 개화 시간 모니터링을 결합하여 평가된다. 품종의 수분 요구 사항을 알면 새로운 과수원 설계를 위한 품종 의 선택이 가능하고 확립된 과수원의 수분 결핍과 관련된 생산성 문제를 조기에 감지할 수 있습니다.

일본의 매화 꽃봉오리에는 1~3개의 꽃이 들어있는 꽃이 들어 있습니다. 다른 돌 과일 종에서와 마찬가지로, 각 꽃은 네 개의 소용돌이로 구성되어 있습니다 : 카펠, stamens, 꽃잎, 그리고 꽃의 기지에서 컵을 형성하는 융합되는 세팔. 꽃 구조는 다른 돌 과일보다 작으며, 소량의 꽃가루 곡물을 포함하는 stamens로 둘러싸인 짧고 깨지기 쉬운 피질이 있습니다. 만개시, 각 꽃의 꽃은 짧은 줄기에 분리 된 ?...

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Establishing Pollination Requirements in Japanese Plum by Phenological Monitoring, Hand Pollinations, Fluorescence Microscopy and Molecular Genotyping

일본 매화형 하이브리드의 수분 요건 을 결정하는 방법론이 설명되어 있는데, 이는 형광 현미경검사법에 따른 꽃가루 관의 현장 및 실험실 오염물질 및 관찰과 PCR에 의한 S-유전자형 식별 및 수분제 선택을 위한 꽃의 모니터링을 결합한 것입니다.

현상학 모니터링, 손 오염, 형광 현미경 검사법 및 분자 지노티핑에 의한 일본 매화의 수분 요구 사항 수립

The Japanese plum cultivars commonly grown are interspecific hybrids derived from crosses between the original Prunus salicina with other Prunus species. ...

This protocol is becoming increasingly important due to the high number of new self-incompatible Japanese plum cultivars with unknown pollination requirements. The main advantage of this technique is that it allows for the determination of the pollination requirements of cultivars by combining two complimentary approaches in field and laboratory conditions. This approach can also be applied to determine pollination requirements and other self-incompatible fruit tree species like apricot or sweet cherry.For pollen extraction, collect flower buds at balloon stage according to stage 57 on the BBCH scale. Remove the anthers using a plastic mesh and place them on paper at room temperature for 24 hours until anther dehiscence. Sieve the pollen grains through a fine mesh and conserve them in a 10 millimeter glass tube with a cap at four degrees Celsius until use.When 10 to 20%of the flowers are open, select and label several branches, leaving 1, 000 to 1, 500 flowers per pollination treatment. On the next day, when more flowers are open, pollinate each flower using a paintbrush with pollen from the same cultivar for self-pollination and pollen from other cultivars as cross-pollination control. Pollinate every day until all flowers are open.Record weekly counts of flowers and developing fruits from anthesis to harvest to characterize the fruit drop pattern and quantify the final fruit set in each pollination treatment. Collect 50 to 100 flowers at balloon stage according to stage 57 on the BBCH scale. Emasculate 30 flowers per treatment in the laboratory for self and cross-pollination.Make a fresh cut on the base of each flower pedicle under water and place it on a piece of wet florist foam. Use one piece of foam for each pollination treatment. After 24 hours, hand pollinate each pistil with the pollen collected previously using a fine paintbrush.Pollinate one set of pistils with pollen from the same cultivar and the other set with pollen from another compatible cultivar as control. Fix these pollinated pistils in a fixative solution of ethanol and acetic acid for at least 24 hours at four degrees Celsius. Spread the pollen of each cultivar previously used as a pollen donor in the pollinations in two Petri dishes and incubate them at 25 degrees Celsius for 24 hours.To observe the pollen grains, add two to three drops of aniline blue solution to each Petri dish and observe them under a UV epifluorescence microscope after five minutes. Count viable and non-viable pollen grains in the three fields per Petri dish with each field containing about 100 to 200 pollen grains in two Petri dishes for each cultivar. To observe the pollen tubes, squash softened pistils in a drop of 1%aniline blue solution under a cover glass on a slide.Observe the pollen tube growth along the style under a microscope with UV epifluorescence using exciter filter BP340-390 and barrier filter LP425. Collect three to four young leaves from each cultivar in the field and extract DNA from the leaves. Set up a master mix for each pair of primers in 1.5 milliliter micro tubes.Add all reagents and mix thoroughly. Aliquot 16 microliters of this master mix into each 200 microliter PCR tube containing four microliters of DNA template or control. Mix them gently, close the caps and centrifuge at 2, 000 times G for 30 seconds.Place the tube in the thermocycler and run the PCR program as mentioned in the text manuscript. For estimating the fragment size by gel electrophoresis, load the first and last wells with two microliters of the DNA ladder and three microliters of the PCR product in the other wells. Close the chamber and run the gel at 100 volts for 30 minutes.Observe the gel under UV light using a gel imaging system. Use the DNA ladder to estimate the size of the amplified fragments and compare it with the positive and negative controls. Monitor the phenology of different trees of each cultivar over different years of flowering.Establish the length of the flowering period from the first to the last open flowers. Full bloom is considered when at least 50%of flowers are at stage F according to stage 65 on the BBCH. The pattern of fruit drop of hand pollinated flowers after emasculation or supplementary pollination showed that most flowers dropped two to three weeks after pollination, but 4%of self-pollinated flowers remained in the tree, indicating that this cultivar is self-compatible.Viable pollen grains showed a pollen tube longer than its length after 24 hours in the culture medium and non-viable pollen grains did not germinate. During pollination, pollen grains were transferred to the stigma. Each germinating pollen grain produced a pollen tube, which grew through the pistil structures.In self-incompatible cultivars, the pollen tube stopped growing in the upper third of the style. However, in self-compatible cultivars, the pollen tube could grow through the style, reach the ovary and fertilize an ovule. PCR analysis was carried out using primers from the conserved regions of sRNAs of sweet cherry and Japanese plum, making it possible to determine the size of S-alleles in each cultivar.The length of the flowering period for a total of four years was calculated. Flowering in orchard conditions allowed the determination of which cultivars are coincident at flowering time each year. When attempting this protocol, make sure to use a higher number of flowers of Japanese plum for hand pollinations since the percentage of fruit set is very low compared to other Prunus species.It is not possible to determine self-incompatibility by molecular approaches. Further work of S-allele sequencing is required to assess if some S-alleles are associated with self-compatibility. The combination of field and laboratory approaches has resulted in valuable information for the design of new commercial orchards and can be used in other fruit tree species.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP)

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP

광 변환 한 후 형광 붕괴를 사용하여 생활 Zebrafish의 태아의 단백질 안정성을 측정 (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological ...

연구

발생학

Primary Endodermal Epithelial Cell Culture from the Yolk Sac Membrane of Japanese Quail Embryos

일본 메추라기 배아의 노 른 골목 막에서 차 내배엽 상피 세포 배양

We established an endodermal epithelial cell culture model (EEC) for studying the function of certain enzymes and proteins in mediating nutrient ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

해부 현미경을 사용하여 시간 경과 영상과 Zebrafish의 신장 개발의 분석 광학 단면에 대한 장착

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

이미지 Zebrafish의 눈 개발에 가벼운 시트 형광 현미경을 사용하여

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

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라이트 시트 기반의 형광 생활의 현미경 또는 고정 및 스테인드<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; 배아

The red flour beetle Tribolium castaneum has become an important insect model organism in developmental genetics and evolutionary developmental biology. ...

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We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

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Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

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