Name: establishing pollination requirements in japanese plum by phenological monitoring, hand pollinations, fluorescence microscopy and molecular genotyping
Uploaded: 2020-11-09T15:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishing Pollination Requirements in Japanese Plum by Phenological Monitoring, Hand Pollinations, Fluorescence Microscopy and Molecular Genotyping at JoVE

Это исследование финансировалось Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (RFP2015-00015-00 и RTA2017-00003-00); Gobierno de Aragón — Европейский социальный фонд, Европейский союз (Grupo Consolidado A12-17R) и Хунта Эстремадура — Европейский фонд регионального развития (FEDER), Региональный план исследований (IB16181), Группа исследований (AGA001, GR18196). Б.И. Герреро был поддержан стипендией Национального совета по вопросам науки и технологии Мексики (CONACYT, 471839).

1. Ручное опыление в полевых условиях
<ol><li>
Извлечение пыльцы
	<ol>
<li>Для получения пыльцы собирают цветочные почки на стадии D24,согласно стадии 57 по шкале BBCH25,26. ПРИМЕЧАНИЕ: У японской сливы необходимо больше цветочных почек, чем у др...

Методология, описанная в настоящем описании для потребностей в опылении японских сортов сливы, требует определения самосовместимости каждого сорта путем контролируемого опыления в полевых условиях или лаборатории и последующего наблюдения за ростом пыльцевой трубки с помощью флуор...

Японская слива (Prunus salicina Lindl.) родом из Китая1. В 19веке эта культура была завезена из Японии в США, где ее скрещивали с другими североамериканскими диплоидными сливами2. В20-м веке некоторые из этих гибридов были распространены в умеренных регионах по всему миру. В настоящее время термин «японская слива» относится к широкому кругу межвидовых гибридов, полученных из скрещива между оригинальным P. salicina с 15 другими диплоидами Prunus spp.3,4,5.
Японская слива, как и другие виды семейства Rosaceae, демонстрирует гаметофитную самонесовместимость (GSI), которая контролируется одним и высокополиморфным S-локусом, содержащим несколько аллелей6. S-локус содержит два гена, которые кодируют рибонуклеазу(S-РНКазу),экспрессируемую в пестике, и белок F-бокса (SFB), экспрессируемый в пыльцевомзерне 7. В реакции самосовместимости, когда S-аллель, экспрессируемый в пыльцевом зерне (гаплоиде), такой же, как один из двух, экспрессируемых в пестике (диплоид), рост пыльцевой трубки по всему стилю остановлен из-за деградации РНК пыльцевой трубки действием S-РНКазы8. Поскольку этот процесс препятствует оплодотворению женского гаметофита в яйцеклетке, GSI способствует ауткроссингу между сортами.
Хотя некоторые японские сорта сливы являются самосовместимыми, большинство выращиваемых в настоящее время сортов являются самонесостоятельными и нуждаются в пыльце от совместимых доноров для удобрения своих цветов3. У косточковых видов рода Prunus, таких как миндаль9,абрикос10,11,12 и черешня13,требования к опылению сортов могут быть установлены различными подходами. Самосовместимость может быть определена путем самоопыления цветов в поле и последующего мониторинга плодового заготовления, или путем полу-in vivo самоопыления в контролируемых условиях в лабораторных условиях и наблюдения пыльцевых трубок под микроскопом14,15,16,17,18 . Отношения несовместимости между сортами могут быть определены путем перекрестного опыления в полевых условиях или лаборатории с использованием пыльцы потенциального сорта опылителя, а также путем идентификации S-аллелей каждого сорта методом ПЦР-анализа14,15,16,19,20,21,22 . У таких видов, как черешня или миндаль, самосовместимость также может быть оценена путем идентификации конкретных аллелей S, связанных с самосовместимостью, таких как S4' в черешне13 или Sf в миндале23.
Несколько программ по разведению сливы из основных стран-производителей выпускают ряд новых сортов2,14,многие из которых с неизвестными требованиями к опылению. В данной работе описана методология определения требований к опылению у гибридов японского сливового типа. Самосовместимость определяется самоопылениями как в полевых условиях, так и в лаборатории с последующими наблюдениями пыльцевых трубок под флуоресцентной микроскопией. Селекция сортов опылителей сочетает в себе идентификацию S-генотипов методом ПЦР-анализа с мониторингом времени цветения в полевых условиях.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic Acid Glacial</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>131008.1611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>iNtRON Biotechnology</td>
			<td>25999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aniline blue</td>
			<td>Difco</td>
			<td>8504-88</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric Acid (H3BO4)</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>131015.1210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Nitrate 4-hydrate (Ca(NO3)2&#183;4H2O)</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>131231.1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass</td>
			<td>Deltalab</td>
			<td>D102460</td>
			<td>24 mm x 60 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Camera</td>
			<td>Imaging Developmet Systems</td>
			<td>UI-1490SE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Camera Software Suite</td>
			<td>Imaging Developmet Systems</td>
			<td>4.93.0.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Oligos</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Mix, 10 mM each</td>
			<td>ThermoSischer Scientific</td>
			<td>R0193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DreamTaq Green DNA polymerase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>EP0713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 96&#176;</td>
			<td>VWR-Chemicals</td>
			<td>83804.360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1Kb DNA Ladder (U.S. Patent No. 4.403.036) (500pb-12Kb)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15615-016</td>
			<td>Size: 250&#181;g; Conc: 1.0 &#181;g/&#181;l</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Documentation System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand Counter</td>
			<td>Tamaco</td>
			<td>TM-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Lab Software</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td>Image Analyse System for Gel Documentation System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaPhor Agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge 5415 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z605212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope with UV epiflurescence</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM2500</td>
			<td>Exciter filter BP340-390, Barrier filter LP425</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microslides</td>
			<td>Deltalab</td>
			<td>D100004</td>
			<td>26 mm x 76 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Electrophoresis System</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>14955170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minicentrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15334204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 1000 Spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes</td>
			<td>Deltalab</td>
			<td>200201</td>
			<td>55 mm x 14 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Tribasic (K3PO4&#183;1.5H2O)</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>141513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer forward &#39;Pru C2&#39;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer forward Pru T2&#39;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer reverse &#39;PCER&#39;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RedSafe Nucleic Acid Staining Solution</td>
			<td>iNtRON Biotechnology</td>
			<td>21141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saccharose</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>131621.1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium sulphite anhydrous (Na2SO3)</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>131717.1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Speedtools plant DNA extraction Kit</td>
			<td>Biotools</td>
			<td>21272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBE Buffer (10X)</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>A0972,5000PE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal Cycler T100</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer comfort</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>T1317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Autoclave Presoclave II</td>
			<td>JP Selecta</td>
			<td>4001725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>11746744</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishing pollination requirements in japanese plum by phenological monitoring, hand pollinations, fluorescence microscopy and molecular genotyping

Японские сорта сливы, обычно выращиваемые, являются межвидовыми гибридами, полученными из скрещиваний между оригинальным Prunus salicina с другими видами Prunus. Большинство гибридов демонстрируют гейметофитную самосовместимость, которая контролируется одним и высокополиморфным S-локусом, содержащим несколько аллелей. Большинство культивируемых гибридов самонесоотсоотвращны и нуждаются в пыльце от совместимого донора для удобрения своих цветов. Установление требований к опылению японской сливы становится все более важным из-за большого количества новых сортов с неизвестными требованиями к опылению. В данной работе описана методология определения требований к опылению у гибридов японского сливового типа. Самосовместимость определяется ручным опылением как в полевых условиях, так и в лаборатории с последующим мониторингом удлинения пыльцевой трубки с помощью флуоресцентной микроскопии, а также мониторингом созревания плодов в полевых условиях. Селекция сортов опылителей оценивается путем совмещения идентификации S-генотипов методом ПЦР-анализа с мониторингом времени цветения в полевых условиях. Знание требований к опылению сортов облегчает отбор сортов для проектирования новых садов и позволяет своевременно выявлять проблемы продуктивности, связанные с дефицитом опыления в установленных садах.

Каждая бутон цветка японской сливы содержит соцветие с 1–3 цветками. Как и у других видов косточковых фруктов, каждый цветок состоит из четырех мутовок: карпеля, тычинок, лепестков и чашелистиков, которые срослись, образуя чашечку у основания цветка. Цветочные структуры меньше, чем друг?...

Watch this Scientific Journal Video about Establishing Pollination Requirements in Japanese Plum by Phenological Monitoring, Hand Pollinations, Fluorescence Microscopy and Molecular Genotyping at JoVE

Establishing Pollination Requirements in Japanese Plum by Phenological Monitoring, Hand Pollinations, Fluorescence Microscopy and Molecular Genotyping

Описана методика определения потребностей в опылении у гибридов японского сливового типа, сочетающая полевые и лабораторные опыления и наблюдения пыльцевых пробирок под флуоресцентной микроскопией с идентификацией S-генотипов методом ПЦР и мониторингом цветения для селекции опылителей.

Установление требований к опылению японской сливы с помощью фенологического мониторинга, ручного опыления, флуоресцентной микроскопии и молекулярного генотипирования

The Japanese plum cultivars commonly grown are interspecific hybrids derived from crosses between the original Prunus salicina with other Prunus species. ...

This protocol is becoming increasingly important due to the high number of new self-incompatible Japanese plum cultivars with unknown pollination requirements. The main advantage of this technique is that it allows for the determination of the pollination requirements of cultivars by combining two complimentary approaches in field and laboratory conditions. This approach can also be applied to determine pollination requirements and other self-incompatible fruit tree species like apricot or sweet cherry.For pollen extraction, collect flower buds at balloon stage according to stage 57 on the BBCH scale. Remove the anthers using a plastic mesh and place them on paper at room temperature for 24 hours until anther dehiscence. Sieve the pollen grains through a fine mesh and conserve them in a 10 millimeter glass tube with a cap at four degrees Celsius until use.When 10 to 20%of the flowers are open, select and label several branches, leaving 1, 000 to 1, 500 flowers per pollination treatment. On the next day, when more flowers are open, pollinate each flower using a paintbrush with pollen from the same cultivar for self-pollination and pollen from other cultivars as cross-pollination control. Pollinate every day until all flowers are open.Record weekly counts of flowers and developing fruits from anthesis to harvest to characterize the fruit drop pattern and quantify the final fruit set in each pollination treatment. Collect 50 to 100 flowers at balloon stage according to stage 57 on the BBCH scale. Emasculate 30 flowers per treatment in the laboratory for self and cross-pollination.Make a fresh cut on the base of each flower pedicle under water and place it on a piece of wet florist foam. Use one piece of foam for each pollination treatment. After 24 hours, hand pollinate each pistil with the pollen collected previously using a fine paintbrush.Pollinate one set of pistils with pollen from the same cultivar and the other set with pollen from another compatible cultivar as control. Fix these pollinated pistils in a fixative solution of ethanol and acetic acid for at least 24 hours at four degrees Celsius. Spread the pollen of each cultivar previously used as a pollen donor in the pollinations in two Petri dishes and incubate them at 25 degrees Celsius for 24 hours.To observe the pollen grains, add two to three drops of aniline blue solution to each Petri dish and observe them under a UV epifluorescence microscope after five minutes. Count viable and non-viable pollen grains in the three fields per Petri dish with each field containing about 100 to 200 pollen grains in two Petri dishes for each cultivar. To observe the pollen tubes, squash softened pistils in a drop of 1%aniline blue solution under a cover glass on a slide.Observe the pollen tube growth along the style under a microscope with UV epifluorescence using exciter filter BP340-390 and barrier filter LP425. Collect three to four young leaves from each cultivar in the field and extract DNA from the leaves. Set up a master mix for each pair of primers in 1.5 milliliter micro tubes.Add all reagents and mix thoroughly. Aliquot 16 microliters of this master mix into each 200 microliter PCR tube containing four microliters of DNA template or control. Mix them gently, close the caps and centrifuge at 2, 000 times G for 30 seconds.Place the tube in the thermocycler and run the PCR program as mentioned in the text manuscript. For estimating the fragment size by gel electrophoresis, load the first and last wells with two microliters of the DNA ladder and three microliters of the PCR product in the other wells. Close the chamber and run the gel at 100 volts for 30 minutes.Observe the gel under UV light using a gel imaging system. Use the DNA ladder to estimate the size of the amplified fragments and compare it with the positive and negative controls. Monitor the phenology of different trees of each cultivar over different years of flowering.Establish the length of the flowering period from the first to the last open flowers. Full bloom is considered when at least 50%of flowers are at stage F according to stage 65 on the BBCH. The pattern of fruit drop of hand pollinated flowers after emasculation or supplementary pollination showed that most flowers dropped two to three weeks after pollination, but 4%of self-pollinated flowers remained in the tree, indicating that this cultivar is self-compatible.Viable pollen grains showed a pollen tube longer than its length after 24 hours in the culture medium and non-viable pollen grains did not germinate. During pollination, pollen grains were transferred to the stigma. Each germinating pollen grain produced a pollen tube, which grew through the pistil structures.In self-incompatible cultivars, the pollen tube stopped growing in the upper third of the style. However, in self-compatible cultivars, the pollen tube could grow through the style, reach the ovary and fertilize an ovule. PCR analysis was carried out using primers from the conserved regions of sRNAs of sweet cherry and Japanese plum, making it possible to determine the size of S-alleles in each cultivar.The length of the flowering period for a total of four years was calculated. Flowering in orchard conditions allowed the determination of which cultivars are coincident at flowering time each year. When attempting this protocol, make sure to use a higher number of flowers of Japanese plum for hand pollinations since the percentage of fruit set is very low compared to other Prunus species.It is not possible to determine self-incompatibility by molecular approaches. Further work of S-allele sequencing is required to assess if some S-alleles are associated with self-compatibility. The combination of field and laboratory approaches has resulted in valuable information for the design of new commercial orchards and can be used in other fruit tree species.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP)

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP

Измерение белка стабильности в жизни у эмбрионов данио рерио с помощью флуоресцентной упадок после фотопреобразования (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological ...

Primary Endodermal Epithelial Cell Culture from the Yolk Sac Membrane of Japanese Quail Embryos

Первичный энтодермальная эпителиальной клетки культуры из желтка мембраны японского перепела Эмбрионы

We established an endodermal epithelial cell culture model (EEC) for studying the function of certain enzymes and proteins in mediating nutrient ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

Анализ развития данио почки с течением времени покадровой визуализации Использование рассекает микроскопа, оборудованного для оптического секционирования

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

Использование Light Sheet флуоресцентной микроскопии для изображения развития данио глаз

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

Легкий лист на основе флуоресцентной микроскопии живых или фиксированных и окрашенных<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; Эмбрионы

The red flour beetle Tribolium castaneum has become an important insect model organism in developmental genetics and evolutionary developmental biology. ...

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

Корреляционные суперразрешением и электронной микроскопии решить локализация белка в Zebrafish сетчатки

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Рассечение и Immunofluorescent окрашивание гриб тело и фоторецепторных нейронов в мозге взрослого Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Single-Cell Quantification of Protein Degradation Rates by Time-Lapse Fluorescence Microscopy in Adherent Cell Culture

Количественная оценка одноклеточных темпы деградации белка с покадровой флуоресцентной микроскопии в культуре адэрентных клеток

Proteins are in a dynamic state of synthesis and degradation and their half-lives can be adjusted under various circumstances. However, most commonly used ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Сотовый агрегации анализов для оценки привязки дрозофилы паз с транс-лигандов и его ингибирование СНГ-лигандами

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...