Name: establishing pollination requirements in japanese plum by phenological monitoring, hand pollinations, fluorescence microscopy and molecular genotyping
Uploaded: 2020-11-09T15:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishing Pollination Requirements in Japanese Plum by Phenological Monitoring, Hand Pollinations, Fluorescence Microscopy and Molecular Genotyping at JoVE

Bu araştırma Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (RFP2015-00015-00 ve RTA2017-00003-00) tarafından finanse edildi; Gobierno de Aragón—Avrupa Sosyal Fonu, Avrupa Birliği (Grupo Consolidado A12-17R) ve Junta de Extremadura —Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER), Plan Regional de Investigación (IB16181), Grupo de Investigación (AGA001, GR18196). B.I. Guerrero, México'lu Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología'nın (CONACYT, 471839) bir bursu ile desteklendi.

1. Alanda el tozlaşması
<ol><li>
Polen ekstraksiyonu
	<ol>
<li>Polen elde etmek için, D24aşamasında çiçek tomurcukları toplayın BBCHölçeğinde57. NOT: Japon erikinde diğer Prunus türlerine göre daha fazla çiçek tomurcukları gereklidir, çünkü anterleri daha az polen üretir.</li>
		<li>Anterleri plastik bir ağ (2 mm x 2 mm gözenek boyutu) kullanarak çıkarın ve anter dehiscence olana ka...

Japon erik kültivatörlerinin tozlaşma gereksinimleri için burada açıklanan metodoloji, her bir kültivarın sahadaki veya laboratuvarda kontrollü tozlaşmalarla kendi kendine (in) uyumluluğunun belirlenmesini ve daha sonra polen tüpü büyümesinin floresan mikroskopi ile gözlemlenmesini gerektirir. Uyumsuzluk ilişkileri, S-alellerinin moleküler genotipleme ile karakterize edilmesiyle kurulur. Son olarak, pollinizerlerin seçimi, her yıl çiçekle çakışan kültivarları tespit etmek için izleme ...

Japon eriği (Prunus salicina Lindl.)Çin'eözgüdür 1 . 19. yüzyılda, bu ürün Japonya'dan Amerika Birleşik Devletleri'ne tanıtıldı ve burada diğer Kuzey Amerika diploid erikleri2ile kesişen . 20. yüzyılda, bu melezlerin bazıları dünyadakiılıman bölgelere yayıldı. Günümüzde, "Japon eriği" terimi, orijinal P. salicina arasındaki haçlardan elde edilen ve 15 adede kadar diğer diploid Prunus spp. 3 ,4,5ile türetilen çok çeşitli spesifik melezleri ifade eder.
Japon eriği, Rosaceae ailesinin diğer türleri gibi, birden fazla alel içeren tek ve son derece polimorfik S-locus tarafından kontrol edilen Gametophytic Self-Incompatibility (GSI) sergiler6. S-locus, pistilde ifade edilen bir ribononikleaz(S-RNase)ve polen tanesinde ifade edilen bir F kutusu proteinini (SFB) kodlayan iki gen içerir7. Kendi kendine uyumsuzluk reaksiyonunda, polen tanesinde (haploid) ifade edilen S-alele pistil (diploid) ile ifade edilen ikiden biriyle aynı olduğunda, polen tüpünün stil boyunca büyümesi, polen tüpü RNA'nın S-RNase8'inetkisiyle bozulması nedeniyle tutuklanır. Bu işlem ovuledeki kadın gametofitin döllenmesini önlediğinden, GSI kültivarlar arasındaki çıkıntları teşvik eder.
Bazı Japon erik kültivarları kendi kendine uyumlu olsa da, şu anda yetiştirilen çoğu kültivar kendi kendine uyumsuzdur ve çiçeklerini döllemek için inter-uyumlu donörlerden polen gerekir3. Badem9 , kayısı 10 ,11,12ve tatlı kiraz13 gibi Prunu cinsi taş meyve türlerinde, kültivarların tozlaşma gereksinimleri farklı yaklaşımlarla oluşturulabilir. Kendi kendine (in) uyumluluk, alandaki çiçeklerin kendi kendine tozlaşması ve daha sonra meyve setinin izlenmesi veya bir laboratuvarda kontrollü koşullarda yarı in vivo kendi kendine tozlaşma ve polen tüplerinin mikroskop altında gözlemlenmesi ile belirlenebilir14,15,16,17,18 . Kültivarlar arasındaki uyumsuzluk ilişkileri, potansiyel pollinizer kültivarının polenleri kullanılarak alandaki veya laboratuvarda çapraz tozlaşmalar ve her bir kültivarın S-allellerinin PCR analizi ile tanımlanması ile belirlenebilir14, 15,16,19,20,21,22 . Tatlı kiraz veya badem gibi türlerde, kendi kendine (in) uyumluluk, tatlı kiraz 13'te S 4' veya badem23'te Sf olarak, kendi kendine uyumlulukla ilişkili belirli Salellerinin tanımlanmasıyla da değerlendirilebilir.
Ana üretim ülkelerinden birkaç erik yetiştirme programı, birçoğu bilinmeyen tozlaşma gereksinimlerine sahip bir dizi yeni kültivar2,14. Bu çalışmada, Japon erik tipi melezlerde tozlaşma gereksinimlerinin belirlenmesi için bir metodoloji açıklanmıştır. Kendi kendine(in) uyumluluk, hem alandaki hem de laboratuvardaki kendi kendine tozlaşmalar ve ardından floresan mikroskopisi altındaki polen tüplerinin gözlemleri ile belirlenir. Pollinizer kültivarlarının seçimi, PCRanalizi ile S -genotiplerinin tanımlanmasını alandaki çiçekli zamanın izlenmesi ile birleştirir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic Acid Glacial</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>131008.1611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>iNtRON Biotechnology</td>
			<td>25999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aniline blue</td>
			<td>Difco</td>
			<td>8504-88</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric Acid (H3BO4)</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>131015.1210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Nitrate 4-hydrate (Ca(NO3)2&#183;4H2O)</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>131231.1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass</td>
			<td>Deltalab</td>
			<td>D102460</td>
			<td>24 mm x 60 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Camera</td>
			<td>Imaging Developmet Systems</td>
			<td>UI-1490SE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Camera Software Suite</td>
			<td>Imaging Developmet Systems</td>
			<td>4.93.0.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Oligos</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Mix, 10 mM each</td>
			<td>ThermoSischer Scientific</td>
			<td>R0193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DreamTaq Green DNA polymerase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>EP0713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 96&#176;</td>
			<td>VWR-Chemicals</td>
			<td>83804.360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1Kb DNA Ladder (U.S. Patent No. 4.403.036) (500pb-12Kb)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15615-016</td>
			<td>Size: 250&#181;g; Conc: 1.0 &#181;g/&#181;l</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Documentation System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand Counter</td>
			<td>Tamaco</td>
			<td>TM-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Lab Software</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td>Image Analyse System for Gel Documentation System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaPhor Agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge 5415 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z605212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope with UV epiflurescence</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM2500</td>
			<td>Exciter filter BP340-390, Barrier filter LP425</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microslides</td>
			<td>Deltalab</td>
			<td>D100004</td>
			<td>26 mm x 76 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Electrophoresis System</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>14955170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minicentrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15334204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 1000 Spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes</td>
			<td>Deltalab</td>
			<td>200201</td>
			<td>55 mm x 14 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Tribasic (K3PO4&#183;1.5H2O)</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>141513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer forward &#39;Pru C2&#39;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer forward Pru T2&#39;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer reverse &#39;PCER&#39;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RedSafe Nucleic Acid Staining Solution</td>
			<td>iNtRON Biotechnology</td>
			<td>21141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saccharose</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>131621.1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium sulphite anhydrous (Na2SO3)</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>131717.1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Speedtools plant DNA extraction Kit</td>
			<td>Biotools</td>
			<td>21272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBE Buffer (10X)</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>A0972,5000PE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal Cycler T100</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer comfort</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>T1317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Autoclave Presoclave II</td>
			<td>JP Selecta</td>
			<td>4001725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>11746744</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishing pollination requirements in japanese plum by phenological monitoring, hand pollinations, fluorescence microscopy and molecular genotyping

Yaygın olarak yetiştirilen Japon erik kültivatları, orijinal Prunus salicina ile diğer Prunus türleri arasındaki haçlardan elde edilen spesifik melezlerdir. Çoğu melez, birden fazla alel içeren tek ve son derece polimorfik S-locus tarafından kontrol edilen gametofitik kendi kendine uyumsuzluk sergiler. Ekili melezlerin çoğu kendi kendine uyumsuzdur ve çiçeklerini döllemek için uyumlu bir donörden polene ihtiyaç duyarlar. Japon eriği tozlaşma gereksinimlerinin belirlenmesi, bilinmeyen tozlaşma gereksinimlerine sahip yeni kültivarların yüksek sayısı nedeniyle giderek daha önemli hale gelmektedir. Bu çalışmada, Japon erik tipi melezlerde tozlaşma gereksinimlerinin belirlenmesi için bir metodoloji açıklanmıştır. Kendi kendine(in) uyumluluk, hem sahada hem de laboratuvarda el tozlaşmaları ile belirlenir, ardından floresan mikroskopi ile polen tüpü uzaması ve ayrıca alandaki meyve olgunlaşması izlenir. Pollinizer kültivarlarının seçimi, PCRanalizi ile S -genotiplerinin tanımlanması ile alandaki çiçekli zamanın izlenmesi ile birleştirilerek değerlendirilir. Kültivarların tozlaşma gereksinimlerini bilmek, yeni meyve bahçelerinin tasarımı için kültivarların seçimini kolaylaştırır ve kurulan meyve bahçelerinde tozlaşma eksikliği ile ilgili verimlilik sorunlarının erken tespitini sağlar.

Her Japon erik çiçeği tomurcukları 1-3 çiçekli bir çiçek salkım içerir. Diğer taş meyve türlerinde olduğu gibi, her çiçek dört whorls oluşur: çiçeğin tabanında bir fincan oluşturan kaynaşmış karpel, stamens, yaprakları ve sepals. Çiçek yapıları diğer taş meyvelerden daha küçüktür, az miktarda polen tanesi içeren stamenlerle çevrili kısa ve kırılgan bir pistil vardır. Tam çiçeklenmede, her çiçeklenmenin çiçekleri kısa saplarda ayrılır ve beyaz yaprakların anesteziden ö...

Watch this Scientific Journal Video about Establishing Pollination Requirements in Japanese Plum by Phenological Monitoring, Hand Pollinations, Fluorescence Microscopy and Molecular Genotyping at JoVE

Establishing Pollination Requirements in Japanese Plum by Phenological Monitoring, Hand Pollinations, Fluorescence Microscopy and Molecular Genotyping

Japon erik tipi melezlerde tozlaşma gereksinimlerinin belirlenmesi için bir metodoloji, floresan mikroskopisi altındaki polen tüplerinin alan ve laboratuvar tozlaşmalarını ve gözlemlerini, S-genotiplerinin PCR tarafından tanımlanması ve tozlayıcıların seçimi için çiçeklenmenin izlenmesi ile birleştiren bir metodoloji açıklanmaktadır.

Fenolojik İzleme, El Tozlaşmaları, Floresan Mikroskopisi ve Moleküler Genotipleme ile Japon Eriğinde Tozlaşma Gereksinimlerinin Oluşturulması

The Japanese plum cultivars commonly grown are interspecific hybrids derived from crosses between the original Prunus salicina with other Prunus species. ...

This protocol is becoming increasingly important due to the high number of new self-incompatible Japanese plum cultivars with unknown pollination requirements. The main advantage of this technique is that it allows for the determination of the pollination requirements of cultivars by combining two complimentary approaches in field and laboratory conditions. This approach can also be applied to determine pollination requirements and other self-incompatible fruit tree species like apricot or sweet cherry.For pollen extraction, collect flower buds at balloon stage according to stage 57 on the BBCH scale. Remove the anthers using a plastic mesh and place them on paper at room temperature for 24 hours until anther dehiscence. Sieve the pollen grains through a fine mesh and conserve them in a 10 millimeter glass tube with a cap at four degrees Celsius until use.When 10 to 20%of the flowers are open, select and label several branches, leaving 1, 000 to 1, 500 flowers per pollination treatment. On the next day, when more flowers are open, pollinate each flower using a paintbrush with pollen from the same cultivar for self-pollination and pollen from other cultivars as cross-pollination control. Pollinate every day until all flowers are open.Record weekly counts of flowers and developing fruits from anthesis to harvest to characterize the fruit drop pattern and quantify the final fruit set in each pollination treatment. Collect 50 to 100 flowers at balloon stage according to stage 57 on the BBCH scale. Emasculate 30 flowers per treatment in the laboratory for self and cross-pollination.Make a fresh cut on the base of each flower pedicle under water and place it on a piece of wet florist foam. Use one piece of foam for each pollination treatment. After 24 hours, hand pollinate each pistil with the pollen collected previously using a fine paintbrush.Pollinate one set of pistils with pollen from the same cultivar and the other set with pollen from another compatible cultivar as control. Fix these pollinated pistils in a fixative solution of ethanol and acetic acid for at least 24 hours at four degrees Celsius. Spread the pollen of each cultivar previously used as a pollen donor in the pollinations in two Petri dishes and incubate them at 25 degrees Celsius for 24 hours.To observe the pollen grains, add two to three drops of aniline blue solution to each Petri dish and observe them under a UV epifluorescence microscope after five minutes. Count viable and non-viable pollen grains in the three fields per Petri dish with each field containing about 100 to 200 pollen grains in two Petri dishes for each cultivar. To observe the pollen tubes, squash softened pistils in a drop of 1%aniline blue solution under a cover glass on a slide.Observe the pollen tube growth along the style under a microscope with UV epifluorescence using exciter filter BP340-390 and barrier filter LP425. Collect three to four young leaves from each cultivar in the field and extract DNA from the leaves. Set up a master mix for each pair of primers in 1.5 milliliter micro tubes.Add all reagents and mix thoroughly. Aliquot 16 microliters of this master mix into each 200 microliter PCR tube containing four microliters of DNA template or control. Mix them gently, close the caps and centrifuge at 2, 000 times G for 30 seconds.Place the tube in the thermocycler and run the PCR program as mentioned in the text manuscript. For estimating the fragment size by gel electrophoresis, load the first and last wells with two microliters of the DNA ladder and three microliters of the PCR product in the other wells. Close the chamber and run the gel at 100 volts for 30 minutes.Observe the gel under UV light using a gel imaging system. Use the DNA ladder to estimate the size of the amplified fragments and compare it with the positive and negative controls. Monitor the phenology of different trees of each cultivar over different years of flowering.Establish the length of the flowering period from the first to the last open flowers. Full bloom is considered when at least 50%of flowers are at stage F according to stage 65 on the BBCH. The pattern of fruit drop of hand pollinated flowers after emasculation or supplementary pollination showed that most flowers dropped two to three weeks after pollination, but 4%of self-pollinated flowers remained in the tree, indicating that this cultivar is self-compatible.Viable pollen grains showed a pollen tube longer than its length after 24 hours in the culture medium and non-viable pollen grains did not germinate. During pollination, pollen grains were transferred to the stigma. Each germinating pollen grain produced a pollen tube, which grew through the pistil structures.In self-incompatible cultivars, the pollen tube stopped growing in the upper third of the style. However, in self-compatible cultivars, the pollen tube could grow through the style, reach the ovary and fertilize an ovule. PCR analysis was carried out using primers from the conserved regions of sRNAs of sweet cherry and Japanese plum, making it possible to determine the size of S-alleles in each cultivar.The length of the flowering period for a total of four years was calculated. Flowering in orchard conditions allowed the determination of which cultivars are coincident at flowering time each year. When attempting this protocol, make sure to use a higher number of flowers of Japanese plum for hand pollinations since the percentage of fruit set is very low compared to other Prunus species.It is not possible to determine self-incompatibility by molecular approaches. Further work of S-allele sequencing is required to assess if some S-alleles are associated with self-compatibility. The combination of field and laboratory approaches has resulted in valuable information for the design of new commercial orchards and can be used in other fruit tree species.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP)

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP

Fotoçevrim sonra Floresans Bozunma kullanarak Oturma balığı Embriyolar protein stabilitesi ölçümü (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological ...

Primary Endodermal Epithelial Cell Culture from the Yolk Sac Membrane of Japanese Quail Embryos

Japon Bıldırcın Embriyolar Yolk Sac Membran Primary Endodermal Epitel Hücre Kültürü

We established an endodermal epithelial cell culture model (EEC) for studying the function of certain enzymes and proteins in mediating nutrient ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

diseksiyon mikroskobu kullanılarak Time-lapse Görüntüleme ile Zebra balığı Böbrek Kalkınma Analizi Optik Kesit için donatılmış

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

Görüntü Zebra balığı Göz Geliştirme Işık Sac floresan mikroskobu kullanarak

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

Işık Levha tabanlı Floresan Yaşayanlar Mikroskopi veya Sabit ve Lekeli<em&gt; Tribullum castaneum</em&gt; Embriyolar

The red flour beetle Tribolium castaneum has become an important insect model organism in developmental genetics and evolutionary developmental biology. ...

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

Bağdaşık süper çözünürlük ve elektron mikroskobu Zebra balığı Retina Protein yerelleşme gidermek için

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Diseksiyon ve mantar vücut immünfloresan boyama ve yetişkin Drosophila melanogaster beynindeki nöronlar Photoreceptor

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Single-Cell Quantification of Protein Degradation Rates by Time-Lapse Fluorescence Microscopy in Adherent Cell Culture

Tek hücreli miktar Protein yıkımı oranları hızlandırılmış Floresans mikroskobu yapisan hücre kültüründe tarafından

Proteins are in a dynamic state of synthesis and degradation and their half-lives can be adjusted under various circumstances. However, most commonly used ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Hücre toplama Trans Drosophila çentikle bağlama değerlendirmek için deneyleri-ligandlar ve onun inhibisyon CIStarafından-ligandlar

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...