Denne protokol kan bruges til at besvare spørgsmålet om, hvorvidt og hvordan hydraulisk frakturering påvirker bakterier i nærliggende vandløb og i forlængelse af vandløbene selv. Den største fordel ved denne teknik er dens holistiske natur, da det tager forskeren fra prøveindsamling hele vejen gennem dataanalyse. Demonstrere proceduren vil være Jeremy Chansee, en bioinformatiker i mit laboratorium, Sydney Regal, en bachelorstuderende på Juniata College, og Gillian Leister, min laboratorium manager.
For at indsamle sedimentprøver til nukleinsyreudvinding skal du bruge handsker til at nedsænke et udjævnet, sterilt 50 milliliter konisk rør i strømvandet fra kysten. Mens røret er nedsænket, fjerne hætten og bruge hætten til scoop ca tre milliliter sediment fra en dybde på en til tre centimeter ind i røret. Efter indsamling af prøven skal du dumpe alt undtagen ca. en milliliter vand ud af røret og bruge en 1.000 mikroliterpipette til at tilføje tre milliliter DNA/RNA-konserveringsmiddel til prøven.
Hvirvle det afskallede koniske rør i fem sekunder for grundigt at blande konserveringsmidlet og prøven og opbevare prøven på is. Når du vender tilbage til laboratoriet, skal prøven opbevares ved minus 20 grader Celsius for 16S DNA-analyse eller minus 70 grader Celsius til metatranscriptomics RNA-analyse. Til filteropsamling fyldes og tømmes en hel steril en-liters flaske med strømvand tre gange for at konditionere flasken, før flasken fyldes en sidste gang.
På en stabil overflade trækkes en fuld mængde strømvand ind i en steril luerlåssprøjte og tilslut sprøjten til et sterilt og DNA/RNA-frit polyethersulfonfilter med en polyethersulfonfilter med en 0,22 mikron porestørrelse. Skyl hele mængden af strømvand gennem filteret. Når hele prøvevolumenet er filtreret på samme måde, skal ca. 20 milliliter luft ind i sprøjten skubbes ind i sprøjten og skubbe luften gennem filteret for at fjerne overskydende vand fra filteret.
Brug derefter en P1000-mikropipette til at tilføje to milliliter DNA/RNA-konserveringsmiddel til den større åbning af filteret, mens filteret holder vandret med spidsen af pipetten i filterets tønde for at sikre, at konserveringsmidlet kommer ind i filteret. Forsegl derefter filteret med tæt indpakkede firkanter af paraffinfilm omkring hver åbning og læg filteret i en steril prøvepose på is. Når du vender tilbage fra prøveudtagning, skal filtrene opbevares til 16S eller til metatranscriptomisk analyse som demonstreret.
Før du påbegynder en prøveoverførsel, skal arbejdsområdet rengøres med 10% blegemiddel og 70% ethanol. Ved udvinding af kernesyre fra en sedimentprøve skal du bruge et flamme- og ethanolsteriliseret metalværktøj til at overføre ca. 250 mg prøve til et mikrocentrifugrør. Til nukleinsyreudvinding fra en filterprøve skal du bruge et 70% ethanol- og flammesteriliseret skruegreb til at åbne filterhuset på den sterile overflade og fjerne kernen fra kabinettet.
Brug en steril skalpel til at skære i toppen, bunden og langs kernens søm og brug sterile pincet til at folde filterpapiret, før du skærer det i små stykker med skalpellen. Placer derefter forsigtigt filterstykkerne i et mikrocentrifugerør uden at kontakte ussteriliserede overflader. For lysis af cellerne i begge typer af prøve, udsætte røret til en celle disruptor ved høj hastighed.
Efter mindst fem minutter centrifugere prøverne og overføre supernatant til en ny steril mikrocentrifuge rør. Føj lysisbufferen til supernatanten i et en-til-en-forhold, og overfør opløsningen til det medfølgende filter. Placer filteret i et nyt mikrocentrifugerør, og tilsæt 400 mikroliter forberedelsesbuffer til røret.
Efter centrifugering tilsættes 700 mikroliter vaskebuffer til røret og centrifugerer filteret igen. Efter at have kasseret flow-through, tilsæt 400 mikroliter af vaskebuffer til røret for en ekstra centrifugering og overfør filteret til et nyt sterilt mikrocentrifugerør. For at frigøre DNA'et skal du behandle filteret med 50 mikroliter DNase/RNasefrit vand i fem minutter ved stuetemperatur.
I mellemtiden skal du placere et tre HRC-filter i et opsamlingsrør og tilføje 600 mikroliter HRC-prep-løsning. Efter centrifugering overføres filteret til et nyt sterilt mikrocentrifugerør og det eluterede DNA overføres til filteret for centrifugering. Gennemstrømningen indeholder det udvundne DNA.
For at oprette et DNA 16S RNA-bibliotek skal du først bruge det nyudvundne DNA-produkt til 16S ribosomal RNA-forstærkning med en standard PCR-protokol. Bland syv mikroliter af det resulterende PCR-produkt og 13 mikroliter DNase-fri vand og læg PCR-opløsningen på en 2% agarosegel. Kør derefter gelen ved 90 volt i 60 til 90 minutter for at kontrollere for et båndstørrelse på 386 basepar som bevis for en vellykket forstærkning.
For at rense DNA 16S ribosomale RNA bibliotek, pool 10 mikroliter af PCR produkter, der gav lyse bånd og 13 mikroliters af de prøver, der gav svage bånd i en steril mikrocentrifuge rør og indlæse omkring 150 til 200 nanogram af hver samlet prøve i individuelle brønde af en ny 2% gel. Efter at have kørt gelen som demonstreret, punktafgifter de 386 baseparbånd fra gelen og bruger et kommercielt sæt til at rense DNA'et. Eluter derefter det rensede DNA med 30 mikroliter af 10 millimolar Tris hydrochlorid og pak de rensede biblioteker i tøris, før de sendes til næste generations sekventering.
I denne repræsentative analyse ville alle ekstraktioner undtagen én blive kaldt vellykkede. Bright bands observeret efter PCR forstærkning indikerer succes for 16S-protokollen. 16S-prøver bør have mindst 1.000 sekvenser, hvor mindst 5.000 er ideelle, mens metatranscriptsomiske prøver skal have mindst 500.000 sekvenser, hvor mindst 2 millioner er ideelle.
Sedimentprøver fra 21 forskellige steder ved 13 forskellige vandløb til 16S- og metatranscriptomics-analyse vises. Af disse 21 lokaliteter var 12 nedstrøms frackingaktivitet og klassificeret som hydraulisk fraktureringspositiv, og ni var enten opstrøms frackingaktivitet eller i et skelsættende, hvor fracking var fraværende og klassificeret som hydraulisk frakturerings negativ. Som vurderet ved PERMANOVA-analysen tyder den observerede adskillelse mellem de hydrauliske fraktureringspositive og negative data på, at de hydrauliske fraktureringspositive prøver blev påvirket af fracking.
De vigtigste tilfældige skovforudsigelser ville afsløre, hvilke funktioner der var mest afgørende for korrekt differentiering af prøver. Hvis en takson identificeres som vigtig af den tilfældige skovmodel, kan dens antimikrobielle modstandsprofil i hydrauliske fraktureringspositive prøver sammenlignes med dens profil i hydrauliske frakturerings negative prøver. Hvis de er meget forskellige, kunne det tyde på, at frackingvæske indeholdende biocider kom ind i strømmen.
Mikrober er overalt, så forurening er et betydeligt potentielt problem med denne type arbejde. De første prøveoverførselstrin er særligt tilbøjelige til dette. Hvis man er interesseret i mikrobiel bionedbrydning eller andre stofskifter, shotgun sekventering af RNA kan bruges til at undersøge aktive mikrobielle genekspression.
Denne teknik gør det muligt at standardisere molekylære teknikker til undersøgelse af in situ bakterielle samfund, samt bioinformatik analyser af bakterielle sekvens data.