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April 4th, 2021
DOI :
April 4th, 2021
•0:05
Introduction
0:42
Sediment Sample Collection
1:40
Filter Collection
3:02
Nucleic Acid Extraction and Quantification
5:17
DNA 16S rRNA Library Creation
5:55
DNA 16S rRNA Library Purification
6:46
Results: Representative Hydraulic Fracturing Stream Microbial Molecular Signature Analyses
8:23
Conclusion
Transcript
इस प्रोटोकॉल का उपयोग इस सवाल का जवाब देने के लिए किया जा सकता है कि हाइड्रोलिक फ्रैक्चरिंग आस-पास की धाराओं में बैक्टीरिया को कैसे प्रभावित करता है और धाराओं को स्वयं विस्तार से करता है। इस तकनीक का मुख्य लाभ इसकी समग्र प्रकृति है, क्योंकि यह डेटा विश्लेषण के माध्यम से सभी तरह से नमूना संग्रह से शोधकर्ता लेता है। प्रक्रिया का प्रदर्शन जेरेमी Chansee, मेरी प्रयोगशाला में एक जैव सूचना, सिडनी रीगल, Juniata कॉलेज में एक स्नातक छात्र, और गिलियन Leister, मेरी प्रयोगशाला प्रबंधक होगा ।
न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण के लिए तलछट नमूने एकत्र करने के लिए, किनारे से धारा पानी में एक छाया, बाँझ ५० मिलीलीटर शंकु नली को जलमग्न करने के लिए दस्ताने का उपयोग करें । जबकि ट्यूब जलमग्न है, टोपी को हटा दें और ट्यूब में एक से तीन सेंटीमीटर की गहराई से तलछट के लगभग तीन मिलीलीटर स्कूप करने के लिए टोपी का उपयोग करें। नमूना एकत्र करने के बाद, ट्यूब से बाहर पानी की सभी लेकिन लगभग एक मिलीलीटर डंप और एक 1, 000 माइक्रोलीटर पिपेट का उपयोग करने के लिए डीएनए के तीन मिलीलीटर जोड़ने/
परिरक्षक और नमूना को अच्छी तरह से मिलाने और बर्फ पर नमूना स्टोर करने के लिए पांच सेकंड के लिए छाया हुआ शंकु नली को भंवर करें। प्रयोगशाला में लौटने पर, 16S डीएनए विश्लेषण के लिए शून्य से 20 डिग्री सेल्सियस या मेटाट्रांस्क्रिप्टॉमिक्स आरएनए विश्लेषण के लिए शून्य से 70 डिग्री सेल्सियस पर नमूना स्टोर करें। फिल्टर संग्रह के लिए, पूरी तरह से भरने और धारा पानी के साथ एक पूरी बाँझ एक लीटर की बोतल तीन बार बोतल एक अंतिम समय भरने से पहले बोतल शर्त खाली ।
एक स्थिर सतह पर, एक बाँझ लूयर लॉक सिरिंज में धारा पानी की एक पूरी मात्रा आकर्षित और एक बाँझ और डीएनए के लिए सिरिंज कनेक्ट/ फिल्टर के माध्यम से धारा पानी की पूरी मात्रा फ्लश। जब पूरे नमूना मात्रा को एक ही तरीके से फ़िल्टर किया गया है, तो सिरिंज में लगभग 20 मिलीलीटर हवा खींचें और फ़िल्टर से किसी भी अतिरिक्त पानी को हटाने के लिए फ़िल्टर के माध्यम से हवा को धक्का दें।
इसके बाद, फिल्टर के बड़े उद्घाटन के लिए डीएनए/आरएनए परिरक्षक के दो मिलीलीटर जोड़ने के लिए एक P1000 माइक्रोपिपेट का उपयोग करें, जबकि फिल्टर की नली में पिपेट की नोक के साथ क्षैतिज रूप से फ़िल्टर पकड़े हुए यह सुनिश्चित करने के लिए कि परिरक्षक फिल्टर में प्रवेश करता है । फिर प्रत्येक खोलने के चारों ओर पैराफिन फिल्म के कसकर लिपटे वर्गों के साथ फिल्टर सील और बर्फ पर एक बाँझ नमूना बैग में फिल्टर जगह है । नमूना से लौटने पर, 16S के लिए या मेटाट्रानस्क्रिप्ट्रोमिक विश्लेषण के लिए फ़िल्टर स्टोर करें जैसा कि प्रदर्शन किया गया था।
नमूना हस्तांतरण शुरू करने से पहले, 10% ब्लीच और 70% इथेनॉल के साथ कार्य क्षेत्र को साफ करें। तलछट नमूने से न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण के लिए, लगभग 250 मिलीग्राम नमूने को माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करने के लिए लौ और इथेनॉल निष्फल धातु उपकरण का उपयोग करें। एक फिल्टर नमूने से न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण के लिए, बाँझ सतह पर फिल्टर आवरण को खोलने और आवरण से कोर को हटाने के लिए 70% इथेनॉल और लौ निष्फल वाइस ग्रिप का उपयोग करें।
ऊपर, नीचे और कोर की सीम के साथ टुकड़ा करने के लिए एक बाँझ स्केलपेल का उपयोग करें और स्केलपेल के साथ छोटे टुकड़ों में काटने से पहले फिल्टर पेपर को मोड़ने के लिए बाँझ चिमटी का उपयोग करें। फिर किसी भी अनस्टरलाइज्ड सतहों से संपर्क किए बिना फिल्टर के टुकड़ों को माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में सावधानी से रखें। किसी भी प्रकार के नमूने के भीतर कोशिकाओं की लाइसिस के लिए, ट्यूब को उच्च गति पर सेल बाधित करने के लिए अधीन करें।
कम से कम पांच मिनट के बाद, नमूनों को अपक्त करें और सुपरनेट को एक नई बाँझ माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। एक-से-एक अनुपात में सुपरनेट में लाइसिस बफर जोड़ें और प्रदान किए गए फ़िल्टर में समाधान स्थानांतरित करें। फिल्टर को एक नए माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में रखें और ट्यूब में तैयारी बफर के 400 माइक्रोलीटर जोड़ें।
अपकेंद्रित्र के बाद, ट्यूब में वॉश बफर के 700 माइक्रोलीटर जोड़ें और फिल्टर को फिर से अपकेंद्री करें। प्रवाह के माध्यम से त्यागने के बाद, एक अतिरिक्त अपकेंद्रित्र के लिए ट्यूब में वॉश बफर के 400 माइक्रोलीटर जोड़ें और फिल्टर को एक नई बाँझ माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। डीएनए को elute करने के लिए, कमरे के तापमान पर पांच मिनट के लिए DNase/RNase मुक्त पानी के ५० माइक्रोलीटर के साथ फिल्टर का इलाज ।
इस दौरान तीन एचआरसी फिल्टर को कलेक्शन ट्यूब में रखें और एचआरसी प्रेप सॉल्यूशन के 600 माइक्रोलीटर डालें। अपकेंद्रित्र के बाद, फ़िल्टर को एक नए बाँझ माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें और एल्यूट किए गए डीएनए को अपकेंद्रित्र के लिए फ़िल्टर में स्थानांतरित करें। प्रवाह के माध्यम से निकाले गए डीएनए होते हैं।
डीएनए 16S आरएनए लाइब्रेरी बनाने के लिए, पहले एक मानक पीसीआर प्रोटोकॉल के साथ 16S रिबोसोमल आरएनए प्रवर्धन के लिए डीएनए उत्पाद को ताजा निकाला का उपयोग करें। परिणामी पीसीआर उत्पाद के सात माइक्रोलीटर और DNase-मुक्त पानी के 13 माइक्रोलीटर मिलाएं और पीसीआर समाधान को 2% एगरेज जेल पर लोड करें। फिर एक सफल प्रवर्धन के सबूत के रूप में 386 आधार जोड़े के बैंड आकार की जांच करने के लिए 60 से 90 मिनट के लिए 90 वोल्ट पर जेल चलाएं।
डीएनए 16S रिबोसोमल आरएनए लाइब्रेरी को शुद्ध करने के लिए, पीसीआर उत्पादों के पूल 10 माइक्रोलीटर जो उज्ज्वल बैंड और नमूनों के 13 माइक्रोलीटर मिले जो एक बाँझ माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में बेहोश बैंड मिले और प्रत्येक पूल किए गए नमूने के लगभग 150 से 200 नैनोग्राम को एक नए 2% जेल के व्यक्तिगत कुओं में लोड करते हैं। जेल चलाने के बाद के रूप में प्रदर्शन किया, जेल से ३८६ आधार जोड़ी बैंड आबकारी और डीएनए शुद्ध करने के लिए एक वाणिज्यिक किट का उपयोग करें । फिर 10 मिलीमोलर ट्रिस हाइड्रोक्लोराइड के 30 माइक्रोलीटर के साथ शुद्ध डीएनए को एल्यूट करें और अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के लिए शिपिंग से पहले सूखी बर्फ में शुद्ध पुस्तकालयों को पैक करें।
इस प्रतिनिधि विश्लेषण में, एक को छोड़कर सभी निष्कर्षों को सफल करार दिया जाएगा। पीसीआर प्रवर्धन के बाद मनाए गए उज्ज्वल बैंड 16S प्रोटोकॉल के लिए सफलता का संकेत देते हैं। 16S नमूनों में कम से कम 5, 000 आदर्श होने के साथ न्यूनतम 1, 000 दृश्य होने चाहिए, जबकि मेटाट्रानस्क्रिप्टोमिक नमूनों में कम से कम 2 मिलियन आदर्श होने के साथ न्यूनतम 500, 000 दृश्य होने चाहिए।
16S और मेटाट्रांस्क्रिप्टोमिक्स विश्लेषण के लिए 13 विभिन्न धाराओं में 21 विभिन्न साइटों से तलछट नमूने दिखाए जाते हैं। उन 21 साइटों में से, 12 फ्रैकिंग गतिविधि के बहाव थे और हाइड्रोलिक फ्रैक्चरिंग पॉजिटिव के रूप में वर्गीकृत थे, और नौ या तो फ्रैकिंग गतिविधि के ऊपर थे या एक वाटरशेड में थे जिसमें फ्रैकिंग अनुपस्थित था और हाइड्रोलिक फ्रैक्चरिंग नकारात्मक के रूप में वर्गीकृत किया गया था । जैसा कि PERMANOVA विश्लेषण द्वारा मूल्यांकन किया गया है, हाइड्रोलिक फ्रैक्चरिंग सकारात्मक और नकारात्मक आंकड़ों के बीच मनाया गया अलगाव से पता चलता है कि हाइड्रोलिक फ्रैक्चरिंग सकारात्मक नमूनों को फ्रैकिंग से प्रभावित किया गया था।
सबसे महत्वपूर्ण यादृच्छिक वन भविष्यवक्ताओं को पता चलता है कि नमूनों को सही ढंग से अलग करने के लिए कौन सी विशेषताएं सबसे आवश्यक थीं। यदि यादृच्छिक वन मॉडल द्वारा एक टैक्सन की पहचान महत्वपूर्ण के रूप में की जाती है, तो हाइड्रोलिक फ्रैक्चरिंग पॉजिटिव नमूनों में इसकी रोगाणुरोधी प्रतिरोध प्रोफ़ाइल की तुलना हाइड्रोलिक फ्रैक्चरिंग नकारात्मक नमूनों में इसके प्रोफाइल से की जा सकती है। यदि वे बहुत अलग हैं, तो यह सुझाव दे सकता है कि बायोसाइड युक्त फ्रैकिंग तरल पदार्थ धारा में प्रवेश कर गया।
रोगाणुओं हर जगह हैं, तो संदूषण काम के इस प्रकार के साथ एक महत्वपूर्ण संभावित मुद्दा है । प्रारंभिक नमूना हस्तांतरण कदम विशेष रूप से इस के लिए प्रवण हैं। यदि कोई माइक्रोबियल बायोडिग्रेडेशन या अन्य मेटाबॉलिज्म में रुचि रखता है, तो आरएनए के शॉटगन अनुक्रमण का उपयोग सक्रिय माइक्रोबियल जीन अभिव्यक्ति की जांच करने के लिए किया जा सकता है।
यह तकनीक इन-सीटू बैक्टीरियल समुदायों की जांच के लिए आणविक तकनीकों के मानकीकरण के साथ-साथ बैक्टीरियल अनुक्रम डेटा के बायोइन्फॉर्मेटिक्स विश्लेषण की अनुमति देती है।
यहां, हम उनके पानी और तलछट माइक्रोबियल समुदायों का विश्लेषण करके आसपास की धाराओं पर हाइड्रोलिक फ्रैक्चरिंग के प्रभावों की जांच करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।
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