Denne protokollen kan brukes til å svare på spørsmålet om og hvordan hydraulisk oppsprekking påvirker bakterier i nærliggende bekker og i forlengelsen av bekkene selv. Den største fordelen med denne teknikken er dens holistiske natur, da den tar forskeren fra prøveinnsamling hele veien gjennom dataanalyse. Å demonstrere prosedyren vil være Jeremy Chansee, bioinformatiker i laboratoriet mitt, Sydney Regal, en bachelorstudent ved Juniata College, og Gillian Leister, laboratorielederen min.
For å samle sedimentprøver for nukleinsyreutvinning, bruk hansker for å nedsenke et avkortet, sterilt 50 milliliter konisk rør i bekkevannet fra kysten. Mens røret er nedsenket, fjern hetten og bruk hetten til å øse omtrent tre milliliter sediment fra en dybde på en til tre centimeter inn i røret. Etter å ha samlet prøven, dump alle unntatt omtrent en milliliter vann ut av røret og bruk en 1000 mikroliter pipette for å legge til tre milliliter DNA / RNA konserveringsmiddel til prøven.
Virvle det kappede koniske røret i fem sekunder for å blande konserveringsmiddelet grundig og prøve og lagre prøven på is. Når du kommer tilbake til laboratoriet, lagre prøven på minus 20 grader Celsius for 16S DNA-analyse eller minus 70 grader Celsius for metatranscriptomics RNA-analyse. For filteroppsamling, fyll og tøm en hel steril en-liters flaske med stream vann tre ganger for å kondisjonere flasken før du fyller flasken en siste gang.
På en stabil overflate trekker du et fullt volum av strømvann inn i en steril luerlåssprøyte og kobler sprøyten til et sterilt og DNA / RNA-fritt 1,7 centimeter diameter polyethersulfonfilter med en 0,22 mikron porestørrelse. Skyll hele volumet av bekkevann gjennom filteret. Når hele prøvevolumet er filtrert på samme måte, trekker du ca. 20 milliliter luft inn i sprøyten og skyver luften gjennom filteret for å fjerne overflødig vann fra filteret.
Deretter bruker du en P1000 mikropipette for å legge til to milliliter DNA/RNA-konserveringsmiddel til den større åpningen av filteret mens du holder filteret horisontalt med spissen av pipetten i filterets fat for å sikre at konserveringsmiddelet kommer inn i filteret. Forsegle deretter filteret med tett innpakkede firkanter med parafinfilm rundt hver åpning og legg filteret i en steril prøvepose på is. Når filtrene returneres fra prøvetaking, må filtrene oppbevars for 16S eller for metatranskriptomisk analyse som vist.
Før du starter en prøveoverføring, rengjør arbeidsområdet med 10 % blekemiddel og 70 % etanol. For kjernesyreutvinning fra en sedimentprøve, bruk et flamme- og etanolsterilisert metallverktøy for å overføre ca. 250 milligram prøve til et mikrocentrifugerør. For kjernesyreutvinning fra en filterprøve, bruk et 70% etanol og flammesterilisert skruegrep for å bryte opp filterhuset på den sterile overflaten og fjern kjernen fra huset.
Bruk en steril skalpell til å skjære i toppen, bunnen og langs sømmen i kjernen og bruk sterile pinsett til å brette filterpapiret før du kutter det i små biter med skalpellen. Plasser deretter filterstykkene forsiktig i et mikrosenterrør uten å komme i kontakt med usteriliserte overflater. For lysis av cellene i en av typer prøver, underkast røret til en celleforstyrrer ved høy hastighet.
Etter minst fem minutter sentrifugerer du prøvene og overfører supernatanten til et nytt sterilt mikrocentrifugerør. Legg lysisbufferen til supernatanten med et en-til-en-forhold og overfør løsningen til det medfølgende filteret. Plasser filteret i et nytt mikrosenterrør og tilsett 400 mikroliter forberedelsesbuffer på røret.
Etter sentrifugering tilsettes 700 mikroliter vaskebuffer til røret og sentrifugerer filteret igjen. Etter å ha kastet gjennomstrømningen, tilsett 400 mikroliter vaskebuffer til røret for en ekstra sentrifugering og overfør filteret til et nytt sterilt mikrocentrifugerør. For å unngå DNA, behandle filteret med 50 mikroliter DNase / RNase-fritt vann i fem minutter ved romtemperatur.
I mellomtiden plasserer du et tre HRC-filter i et oppsamlingsrør og tilsetter 600 mikroliter HRC-klargjøringsløsning. Etter sentrifugering, overfør filteret til et nytt sterilt mikrosenterrør og overfør det eluterte DNA-et til filteret for sentrifugering. Gjennomstrømningen inneholder det ekstraherte DNA-et.
For å lage et DNA 16S RNA-bibliotek, bruk først det nyutpakkede DNA-produktet for 16S ribosomal RNA-forsterkning med en standard PCR-protokoll. Bland syv mikroliter av det resulterende PCR-produktet og 13 mikroliter DNase-fritt vann og last PCR-løsningen på en 2% agarose gel. Kjør deretter gelen på 90 volt i 60 til 90 minutter for å se etter en båndstørrelse på 386 basepar som bevis på en vellykket forsterkning.
For å rense DNA 16S ribosomal RNA-biblioteket, samle 10 mikrolitere av PCR-produktene som ga lyse bånd og 13 mikroliter av prøvene som ga svake bånd i et sterilt mikrosenterrør og lastet rundt 150 til 200 nanogram av hver samlet prøve inn i individuelle brønner i en ny 2%gel. Etter å ha kjørt gelen som demonstrert, eksiserer du 386 baseparbåndene fra gelen og bruker et kommersielt sett for å rense DNA-et. Deretter unngår du det rensede DNA-et med 30 mikroliter 10 millimolar Tris-hydroklorid og pakker de rensede bibliotekene i tørris før frakt for neste generasjons sekvensering.
I denne representative analysen vil alle utvinninger bortsett fra en bli kalt vellykket. Lyse bånd observert etter PCR-forsterkning indikerer suksess for 16S-protokollen. 16S-prøver bør ha minst 1000 sekvenser med minst 5000 som ideelle, mens metatranscriptsomiske prøver skal ha minst 500 000 sekvenser med minst 2 millioner som ideelle.
Sedimentprøver fra 21 ulike lokaliteter ved 13 ulike bekker for 16S og metatranscriptomics analyse er vist. Av disse 21 anleggene var 12 nedstrøms fracking aktivitet og klassifisert som hydraulisk oppsprekking positiv, og ni var enten oppstrøms for fracking aktivitet eller i et vannskille der fracking var fraværende og klassifisert som hydraulisk oppsprekking negativ. Som vurdert av PERMANOVA-analyse, tyder separasjonen som ble observert mellom de hydrauliske oppsprekkingspositive og negative dataene, at de hydrauliske oppsprekkingspositive prøvene ble påvirket av fracking.
De viktigste tilfeldige skogforutsigerne ville avsløre hvilke funksjoner som var viktigst for å differensiere prøver riktig. Hvis en takson identifiseres som viktig av den tilfeldige skogmodellen, kan dens antimikrobielle motstandsprofil i hydrauliske oppsprekkingspositive prøver sammenlignes med profilen i hydrauliske oppsprekkbare negative prøver. Hvis de er svært forskjellige, kan det tyde på at fracking væske som inneholder biocider kom inn i strømmen.
Mikrober er overalt, så forurensning er et betydelig potensielt problem med denne typen arbeid. De første trinnene for prøveoverføring er spesielt utsatt for dette. Hvis man er interessert i mikrobiell biologisk nedbrytning eller andre metabolismer, kan haglesekvensering av RNA brukes til å undersøke aktivt mikrobielt genuttrykk.
Denne teknikken tillater standardisering av molekylære teknikker for å undersøke in-situ bakterielle samfunn, samt bioinformatikkanalyser av bakterielle sekvensdata.