Detta protokoll kan användas för att svara på frågan om och hur hydraulisk spräckning påverkar bakterier i närliggande vattendrag och i förlängningen strömmarna själva. Den största fördelen med denna teknik är dess holistiska natur, eftersom den tar forskaren från provinsamling hela vägen genom dataanalys. Jeremy Chansee, bioinformatiker i mitt laboratorium, Sydney Regal, student vid Juniata College, och Gillian Leister, min laboratoriechef, demonstrerar proceduren.
För att samla sedimentprover för extraktion av nukleinsyra, använd handskar för att dränka ett kapat, sterilt 50 milliliter koniskt rör i strömvattnet från stranden. Medan röret är nedsänkt, ta bort locket och använd locket för att skopa cirka tre milliliter sediment från ett djup av en till tre centimeter i röret. Efter insamling av provet, dumpa alla utom cirka en milliliter vatten ur röret och använd en 1 000 mikroliterpipett för att tillsätta tre milliliter DNA/RNA-konserveringsmedel till provet.
Snurra det kapade koniska röret i fem sekunder för att noggrant blanda konserveringsmedlet och prova och lagra provet på is. När du återvänder till labbet, lagra provet på minus 20 grader Celsius för 16S DNA-analys eller minus 70 grader Celsius för metatranscriptomics RNA-analys. För filteruppsamling, fyll och töm en hel steril enlitersflaska med strömvatten tre gånger för att konditionera flaskan innan du fyller flaskan en sista gång.
Rita en hel volym strömmande vatten i en steril luerlåsspruta på en stabil yta och anslut sprutan till ett sterilt och DNA/RNA-fritt polyeterulfonfilter med en diameter på 1,7 centimeter med en porstorlek på 0,22 mikron. Spola hela volymen strömvatten genom filtret. När hela provvolymen har filtrerats på samma sätt, dra in cirka 20 milliliter luft i sprutan och tryck in luften genom filtret för att avlägsna eventuellt överskott av vatten från filtret.
Använd sedan en P1000-mikropipett för att tillsätta två milliliter DNA/RNA-konserveringsmedel till filtrets större öppning samtidigt som du håller filtret horisontellt med pipettspetsen i filtrets pipa för att säkerställa att konserveringsmedlet kommer in i filtret. Försegla sedan filtret med tätt inslagna rutor av paraffinfilm runt varje öppning och placera filtret i en steril provpåse på is. När du återvänder från provtagningen, lagra filtren för 16S eller för metatranscriptomic analys som visats.
Innan du påbörjar en provöverföring rengör du arbetsområdet med 10 % blekmedel och 70 % etanol. För nukleinsyraextraktion från ett sedimentprov, använd ett flam- och etanolsteriliserat metallverktyg för att överföra cirka 250 milligram prov till ett mikrocentrifugrör. För nukleinsyraextraktion från ett filterprov, använd en 70%etanol och flamsteriliserat lastgrepp för att bryta upp filterhöljet på den sterila ytan och ta bort kärnan från höljet.
Använd en steril skalpell för att skära upptill, nedtill och längs kärnans söm och använd sterila pincett för att vika filterpapperet innan du skär det i små bitar med skalpellen. Placera sedan försiktigt filterbitarna i ett mikrocentrifugrör utan att kontakta några osteriliserade ytor. För lys av cellerna inom någon av typerna av prov, utsätta röret för en cellstörare med hög hastighet.
Efter minst fem minuter centrifugera proverna och överför supernatanten till ett nytt sterilt mikrocentrifugrör. Tillsätt lysbufferten i supernaten vid ett 1:1-förhållande och överför lösningen till det medföljande filtret. Placera filtret i ett nytt mikrocentrifugrör och tillsätt 400 mikroliter beredningsbuffert till röret.
Tillsätt 700 mikroliter tvättbuffert till röret efter centrifugering och centrifugera filtret igen. När du har kasserat genomflödet, tillsätt 400 mikroliter tvättbuffert till röret för en extra centrifugering och överför filtret till ett nytt sterilt mikrocentrifugrör. För att eluera DNA: t, behandla filtret med 50 mikroliter DNase / RNase-fritt vatten i fem minuter vid rumstemperatur.
Under tiden placerar du ett tre HRC-filter i ett uppsamlingsrör och lägger till 600 mikroliter HRC-förberedelselösning. Efter centrifugering överför du filtret till ett nytt sterilt mikrocentrifugrör och överför det eluterade DNA:t till filtret för centrifugering. Genomflödet innehåller det extraherade DNA:t.
För att skapa ett DNA 16S RNA-bibliotek, använd först den ny extraherade DNA-produkten för 16S ribosomal RNA-förstärkning med ett standard PCR-protokoll. Blanda sju mikroliter av den resulterande PCR-produkten och 13 mikroliter DNase-fritt vatten och ladda PCR-lösningen på en 2%agarose gel. Kör sedan gelén på 90 volt i 60 till 90 minuter för att kontrollera om det finns en bandstorlek på 386 baspar som bevis på en lyckad förstärkning.
För att rena DNA 16S ribosomal RNA-biblioteket, samla 10 mikroliter av PCR-produkterna som gav ljusa band och 13 mikroliter av proverna som gav svaga band i ett sterilt mikrocentrifugrör och ladda cirka 150 till 200 nanogram av varje poolat prov i enskilda brunnar i en ny 2%gel. Efter att ha kört gelén som demonstrerat, punktskatt de 386 basparbanden från gelén och använd ett kommersiellt kit för att rena DNA. Eluera sedan det renade DNA:t med 30 mikroliter på 10 millimolar Tris-hydroklorid och packa de renade biblioteken i torris innan nästa generations sekvensering levereras.
I denna representativa analys skulle alla extraktioner utom en kallas framgångsrika. Ljusa band som observerats efter PCR-förstärkning indikerar framgång för 16S-protokollet. 16S-prover bör ha minst 1 000 sekvenser med minst 5 000 idealiska, medan metatranscriptsomiska prover bör ha minst 500 000 sekvenser med minst 2 miljoner idealiska.
Sedimentprover från 21 olika platser vid 13 olika bäckar för 16S- och metatranscriptomikanalys visas. Av dessa 21 anläggningar var 12 nedströms frackningsaktivitet och klassificerades som hydraulisk sprickbildning positiv, och nio var antingen uppströms frackningsaktivitet eller i en vattendelare där frackning var frånvarande och klassificerades som hydraulisk spräckning negativ. Enligt permanovaanalysen tyder separationen mellan de hydrauliska spräckningspositiva och negativa uppgifterna på att de hydrauliska spräckningspositiva proverna påverkades av frackning.
De viktigaste slumpmässiga skogsförutsägarna skulle avslöja vilka funktioner som var viktigast för att korrekt differentiera prover. Om en taxon identifieras som viktig enligt den slumpmässiga skogsmodellen kan dess antimikrobiella resistensprofil i hydrauliska spräckningspositiva prover jämföras med dess profil i hydrauliska spräckningsnegativa prover. Om de skiljer sig mycket kan det tyda på att frackningsvätska som innehåller biocider kom in i strömmen.
Mikrober finns överallt, så kontaminering är ett betydande potentiellt problem med denna typ av arbete. De första provöverföringsstegen är särskilt benägna att detta. Om man är intresserad av mikrobiell biologisk nedbrytning eller andra metabolismer kan hagelgevärssekvensering av RNA användas för att undersöka aktiva mikrobiella genuttryck.
Denna teknik möjliggör standardisering av molekylära tekniker för att undersöka bakteriesamhällen på plats, liksom bioinformatikanalyser av bakteriell sekvensdata.