Bu protokol, hidrolik kırılmanın yakındaki akışlardaki bakterileri etkileyip etkilemediği ve akışların kendilerinin nasıl etkilediği sorusunu yanıtlamak için kullanılabilir. Bu tekniğin temel avantajı, araştırmacıyı veri analizi yoluyla örnek toplamadan aldığı için bütünsel doğasıdır. Prosedürü gösterenler laboratuvarımda biyoinformatik uzmanı olan Jeremy Chansee, Juniata Koleji'nde lisans öğrencisi sydney Regal ve laboratuvar müdürüm Gillian Leister olacak.
Nükleik asit ekstraksiyonu için tortu örnekleri toplamak için, kıyıdan dere suyuna kapaklı, steril 50 mililitre konik bir tüp batırmak için eldiven kullanın. Tüp suya batırılırken, kapağı çıkarın ve kapağı bir ila üç santimetre derinlikten tüpe yaklaşık üç mililitre tortu kepçe etmek için kullanın. Numuneyi topladıktan sonra, yaklaşık bir mililitre su hariç hepsini tüpten atın ve numuneye üç mililitre DNA / RNA koruyucu eklemek için 1.000 mikrolitre pipet kullanın.
Koruyucuyu iyice karıştırmak ve numune almak ve numuneyi buzda saklamak için kapaklı konik tüpü beş saniye döndürün. Laboratuvara döndükten sonra, örneği 16S DNA analizi için eksi 20 santigrat derecede veya metatranscriptomics RNA analizi için eksi 70 santigrat derecede saklayın. Filtre toplama için, şişeyi son bir kez doldurmadan önce şişeyi şartlandırmak için tüm steril bir litrelik şişeyi üç kez dere suyuyla doldurun ve boşaltın.
Kararlı bir yüzeyde, steril bir luer kilit şırıngasına tam hacimli bir dere suyu çekin ve şırıngayı steril ve DNA / RNA içermeyen 1,7 santimetre çapında 0,22 mikron gözenek boyutuna sahip poliethersülfon filtresine bağlayın. Dere suyunun tüm hacmini filtreden boşaltın. Numune hacminin tamamı aynı şekilde filtrelendiğinde, şırınna yaklaşık 20 mililitre hava çekin ve filtreden fazla suyu çıkarmak için havayı filtreden geçirin.
Daha sonra, koruyucunun filtreye girdiğinden emin olmak için filtrenin namlusunda pipet ucuyla yatay olarak tutarken filtrenin daha büyük açıklığı için iki mililitre DNA / RNA koruyucu eklemek için bir P1000 mikropipette kullanın. Daha sonra filtreyi her açıklığın etrafına sıkıca sarılmış parafin filmi kareleriyle kapatın ve filtreyi buz üzerinde steril bir numune torbasına yerleştirin. Örneklemeden döndükten sonra, filtreleri gösterildiği gibi 16S veya metatranscriptomik analiz için saklayın.
Örnek transfere başlamadan önce çalışma alanını %10 çamaşır suyu ve %70 etanol ile temizleyin. Bir tortu örneğinden nükleik asit ekstraksiyonu için, yaklaşık 250 miligram numuneyi bir mikrosantrifüj tüpüne aktarmak için bir alev ve etanol sterilize metal aracı kullanın. Bir filtre örneğinden nükleik asit ekstraksiyonu için, steril yüzeydeki filtre kasasını kırmak ve çekirdeği kasadan çıkarmak için% 70 etanol ve alev sterilize edilmiş bir mengene kavraması kullanın.
Çekirdeğin üst, alt ve dikişi boyunca dilimleme yapmak için steril bir neşter kullanın ve neşterle küçük parçalara ayırmadan önce filtre kağıdını katlamak için steril cımbız kullanın. Daha sonra filtre parçalarını sterilize edilmemiş yüzeylere temas etmeden dikkatlice bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin. Her iki örnek türündeki hücrelerin lizisi için, tüpü yüksek hızda bir hücre bozucuya tabi edin.
En az beş dakika sonra, numuneleri santrifüjleyin ve süpernatantı yeni bir steril mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Bire bir oranında süpernatanta lizis arabelleği ekleyin ve çözümü sağlanan filtreye aktarın. Filtreyi yeni bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin ve tüpe 400 mikrolitre hazırlık tamponu ekleyin.
Santrifüjlemeden sonra, tüpe 700 mikrolitre yıkama tamponu ekleyin ve filtreyi tekrar santrifüjleyin. Akıştan geçtikten sonra, ek bir santrifüjleme için tüpe 400 mikrolitre yıkama tamponu ekleyin ve filtreyi yeni bir steril mikrosantrifüj tüpüne aktarın. DNA'yı boşaltmak için, filtreyi oda sıcaklığında beş dakika boyunca 50 mikrolitre DNase/ RNase içermeyen su ile tedavi edin.
Bu arada, bir toplama tüpüne üç HRC filtresi yerleştirin ve 600 mikrolitre HRC hazırlık çözeltisi ekleyin. Santrifüjlemeden sonra, filtreyi yeni bir steril mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve eluted DNA'yı santrifüjleme için filtreye aktarın. Akışta çıkarılan DNA var.
Bir DNA 16S RNA kütüphanesi oluşturmak için, önce standart bir PCR protokolü ile 16S ribozomal RNA amplifikasyonu için yeni çıkarılan DNA ürününü kullanın. Elde eden PCR ürününün yedi mikrolitresini ve 13 mikrolitre DNase içermeyen suyu karıştırın ve PCR çözeltisini% 2 agarose jel üzerine yükleyin. Daha sonra başarılı bir amplifikasyonun kanıtı olarak 386 baz çiftlik bir bant boyutunu kontrol etmek için jeli 60 ila 90 dakika boyunca 90 voltta çalıştırın.
DNA 16S ribozomal RNA kütüphanesini arındırmak için, steril bir mikrosantrifüj tüpünde soluk bantlar veren ve her havuzlanmış numunenin yaklaşık 150 ila 200 nanogramını yeni bir% 2 jelin bireysel kuyularına yükleyen numunelerin parlak bantlarını ve 13 mikrolitresini veren PCR ürünlerinin 10 mikrolitresini havuzlayın. Jeli gösterildiği gibi çalıştırdıktan sonra, 386 baz çifti bantlarını jelden çıkarmak ve DNA'yı arındırmak için ticari bir kit kullanın. Daha sonra saflaştırılmış DNA'yı 10 milimolar Tris hidroklorürden oluşan 30 mikrolitre ile ayıklayın ve arıtılmış kütüphaneleri yeni nesil sıralama için sevk etmeden önce kuru buzda paketleyin.
Bu temsili analizde, biri hariç tüm ekstraksiyonlar başarılı olarak adlandırılacaktır. PCR amplifikasyonu sonrasında gözlenen parlak bantlar 16S protokolü için başarıyı gösterir. 16S örnekleri en az 1.000 diziye sahip olmalı ve en az 5.000 idealken, metatranscriptsomic örnekler en az 500.000 diziye sahip olmalı ve en az 2 milyon ideal olmalıdır.
16S için 13 farklı akışta 21 farklı bölgeden tortu örnekleri ve metatranscriptomics analizi gösterilmiştir. Bu 21 bölgeden 12'si kırma faaliyetinin aşağı yönündeydi ve hidrolik kırılma pozitif olarak sınıflandırıldı ve dokuzu ya çatlama aktivitesinin yukarı akışında ya da fracking'in olmadığı ve hidrolik kırılma negatif olarak sınıflandırıldığı bir su havzasındaydı. PERMANOVA analizi ile değerlendirildiği gibi, hidrolik kırılma pozitif ve negatif veriler arasında gözlenen ayrım, hidrolik kırılma pozitif numunelerin kırılmadan etkilendiğini göstermektedir.
En önemli rastgele orman tahmincileri, örnekleri doğru bir şekilde ayırt etmek için hangi özelliklerin en gerekli olduğunu ortaya çıkarır. Bir takson rastgele orman modeli tarafından önemli olarak tanımlanırsa, hidrolik kırılma pozitif numunelerdeki antimikrobiyal direnç profili, hidrolik kırılma negatif numunelerdeki profiliyle karşılaştırılabilir. Eğer büyük ölçüde farklılık gösterirlerse, bu biyosit içeren fracking sıvısının dereye girdiğini gösterebilir.
Mikroplar her yerdedir, bu nedenle kontaminasyon bu tür işlerle ilgili önemli bir potansiyel sorundur. İlk örnek aktarım adımları özellikle buna eğilimlidir. Biri mikrobiyal biyobozunurluk veya diğer metabolizmalarla ilgileniyorsa, aktif mikrobiyal gen ekspresyonunu araştırmak için RNA'nın av tüfeği dizilimi kullanılabilir.
Bu teknik, yerinde bakteri topluluklarının araştırılması için moleküler tekniklerin standartlaştırılmasına ve bakteri dizi verilerinin biyoinformatik analizlerine olanak tanır.
