3.4K Views
•
11:07 min
•
December 4th, 2021
DOI :
December 4th, 2021
•0:07
Introduction
1:13
Phenotype Microarray Experiments
3:58
Data Extraction and Analysis
5:06
Identification of Reactions and Genes Associated with New Metabolites
6:41
Model Refinement and Evaluation
8:38
Results
10:25
Conclusion
Transcript
Den fænotype mikro-array teknologi er en effektiv high-throughput metode, der funktionelt bestemmer cellulære metaboliske aktiviteter som reaktion på en bred vifte af indrejse metabolitter. Udnyttelsen i denne teknologi måles i form af cellulær respiration bestemt af mængden af farveudvikling produceret af NADH-reduktionen af et tetrazoliumbaseret redox-farvestof. I dette arbejde vil vi introducere brugen af fænotype mikro array assays i forbindelse med mikroalger ved hjælp af model arter Chlamydomonas reinhardtii.
Målet med denne undersøgelse er at etablere en pålidelig metode til at karakterisere metaboliske phenotyping af mikro-alger, der kan bruges til at udvide eksisterende alge metaboliske netværk modeller eller guide genopbygningen af nye modeller. Chlamydomonas reinhardtii stamme CC-503 kan fås fra Chlamydomonas ressourcecenter på University of Minnesota USA. Dyrk cellerne i friske Tris-acetat fosfat fedt medier til midten af log fase.
Kontroller cellerne under mikroskopet for at sikre, at de er i god form og uden forurening. Skru ned for kulturen ved 2000 G-kraft i 10 minutter. Kassér supernatanten uden at forstyrre pelleten.
Forbered friske tap medier, der indeholder 0,1% tetrazolium violet farvestof D"Tilføj forskellige antibiotika, herunder Timentin, Ampicillin, og Kanamycin til medierne for at hæmme bakterievækst. Fedt medier og dette trin bør udelades fra næringsstoffer, afhængigt af hver pladetype. Re-suspendere pellet og den friske hane medier til en endelig koncentration af 1 million celler pr milliliter.
Brug kemiske sammensatte array assay plader, såsom kulstofkilder, kvælstofkilder, fosfor, og svovl kilder plader, og peptid kvælstofkilder. Pode 100 mikroliter tilstrækkelig af selvholdige medier i hver brønd af essay plader. Sørg for at duplikere analyserne.
Det skal bemærkes, at celler på nuværende tidspunkt skal testes med gram-negativ farvning før og efter analysen for at overvåge bakteriel forurening. Sæt analysepladerne til det kemiske stofområde i mikropladelæsersystemet. Inkuber alle pladerne ved 30 grader i op til syv dage, og programmer mikropladelæsersystemet til at læse farvefarveændringen hvert 15. minut.
Da de fleste mikropladelæsere ikke giver en kilde til kontinuerligt lys under inkubation, bør algerne være i stand til at udføre heterotrofisk åndedræt. Eksporter de rå kinetiske data fra mikropladelæseren som CSV-filer, som efterfølgende vil blive brugt som input til fænotypen mikroarray softwarepakke og vores software. For at udføre fænotypen microarray dataanalyse skal du bruge OmniLog-fænotypen mikro Erik OPM-softwarepakke, der kører inden for R-softwaremiljøet.
I R studio, den grafiske brugergrænseflade til R, installere OPM-pakken og dens afhængigheder ved hjælp af kommandoerne beskrevet i manuskriptet. Gå til den mappe, der indeholder CSV-filerne for de kinetiske data, og importer dataene ved hjælp af funktionen Læs OPM. De kinetiske data kan aggregeres og diskretiseres ved hjælp af pref parameter estimering.
Ved hjælp af funktionen XY plot gør det muligt at kortlægge respiration eller vækst målinger, der skal kortlægges som en funktion af tid til analysen 96-brønd plader. Dataene kan visualiseres som et varmekort ved hjælp af funktionsniveauplottet for at give mulighed for et hurtigt sammenlignende overblik over de kinetiske data. Det næste skridt er at identificere de reaktioner og gener, der er forbundet med de nye metabolitter.
I tilfælde af tilstedeværelse af en eksisterende model for algerne kan dataanalysen fra fænotypen microarray-systemet bruges til at forfine denne model. Her præsenterer vi den rørledning, vi brugte til genom-skala metaboliske netværk raffinement for Chlamydomonas model ved hjælp af fænotype microarray data. Når en ny forbindelse testes positiv for udnyttelse, defineres forbindelsens relevante reaktionsprofiler ved hjælp af metabolisk vidensgrundlag, hvilket giver de tilhørende enzymprovisionsnumre.
Det første skridt er at søge Kegg og MetaCyc at identificere enzym provision numre, ECs, for reaktioner ved hjælp af metaboliseret fundet fra den kemiske sammensatte arrays. Dernæst bruger vi de identificerede EF-numre som søgegrundlag i flere tilgængelige algeanmærkningsressourcer, såsom fælles genominstitut, JGI, Phytozome og peer reviewed publikationer. Reaktionerne og metabolitterne føjes til den COBRA-baserede Chlamydomonas reinhardtii metaboliske netværksmodel, iRC1080, for at udvide og forfine modellen.
Hvis der ikke findes genetiske beviser til støtte for EF-nummeret, kan der udføres en profilbaseret søgning som NCBI Position-Specific Iterative, NCBI PSI-BLAST for at identificere kandidatgener, der er forbundet med reaktionen. Resultaterne evalueres derefter manuelt. De, der passerer dette QC-trin med E-værdier, der er mindre end 0,05 for relevans for søge-EF-numrene, føjes derefter til metrikmodellen.
Det sidste trin i denne protokol er at forfine modellen, evaluere og sammenligne modellerne. Brug den nyeste COBRA værktøjskasse version 3.0 og MATLAB platformen til at udføre trinene til model raffinement. Når du har installeret Cobra-værktøjskassen, kan du downloade iRC1080-modellen.
Så i MATLAB er den første ting at gøre at navigere til den mappe, der indeholder referencemodellen, iRC1080. Tilføj de identificerede reaktioner med deres tilknyttede gener til den metaboliske model, såsom iRC1080, ved hjælp af Cobra værktøjskasse funktioner. Tilføj reaktion og ændre gen forening.
Gå til den mappe, der indeholder iRC1080-modellen, og udfør kommandoerne for at indlæse modellen. Omdøb det og tilføj en ny reaktion og dens tilhørende gen. I nogle tilfælde, hvor metabolit ikke produceres intracellulært, men er taget fra mediet, transportreaktioner for de nye metabolitter skal føjes til modellen ved hjælp af add / exchange reaktion funktion til at input eller output metabolit i ekstracellulære medium.
Test adfærden af det nye resultat og model, for eksempel iBD1106, ved at udføre flux balance analyse, FBA, ved hjælp af funktionen optimere CB model under lyse og mørke forhold for maksimering af biomasse som objektet funktion. FBA-løsningen udsender blandt andet tre vektorer reaktionsfluxerne, metabolitskyggepriserne og reaktionen reducerede omkostningerne. Her gives et eksempel, hvor iRC1080-modellen sammenlignes med dens raffinerede version, iBD1106, ved at opnå de skyggepriser, der repræsenterer biomassens objektive funktions følsomhed over for ændringer og metabolitter, der er angivet i hver model.
Her viser vi respiration XY plots og niveau plots af kulstof kilder og kvælstof kilder assay plader til blank og CC-503 i blågrøn farve og lilla, henholdsvis. Inden for hver brønd repræsenterer respirationskurver farvekonvertering ved reduktion som funktion af tiden. Den fremhævede top i panel A repræsenterer påvisning af acetat som den eneste kulstofkilde fra denne plade, hvilket er i overensstemmelse med Chlamydomonas litteratur.
Sammenligningen af antallet af metabolitter identificeret ved hjælp af tre forskellige metoder, iRC1080, som er den velkuraterede Chlamydomonas metaboliske model, gaskromatografi tid flyvning GC-TOF, og fænotypen microarray essay viser, at kun seks metabolit overlapning mellem de tre sæt, mens 149 var almindelige mellem iRC1080 og fænotypen microarray assay sæt. Dette viser, at mens hver teknologi har en styrke i retning af metabolisk profilering forskning, fænotypen microarray assay sæt kan være en væsentlig kilde til nye metaboliske oplysninger. De indhentede oplysninger blev brugt til at udvide og forfine den metaboliske netværksmodel iRC1080.
Her sammenligner vi indholdet af iRC1080-modellen og den udvidede model iBD1106, herunder antallet af reaktioner, antallet af metabolitter og antallet af gener. Vi viser, at vores model raffinering tilføjet over 254 reaktioner på det nye resulterede netværk. Disse reaktioner er klassificeret i aminosyrer, dipeptider, tripeptider og transportreaktioner.
De nyligt identificerede metabolitter blev brugt til metabolisk netværksudvidelse og raffinement af den eksisterende Chlamydomonas reinhardtii metaboliske model. Den fænotype microarray assays kan bruges til at karakterisere metaboliske fænotyper af eksisterende og nyligt isolerede stammer. Derudover kan den protokol, vi brugte i forbindelse med mikroalger, guide til raffinement af metaboliske modeller af andre arter.
Denne protokol viser brugen af en fænotype microarray (PM) teknologi platform til at definere metaboliske krav til Chlamydomonas reinhardtii, en grøn mikroalger, og forfine en eksisterende metabolisk netværk model.
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved