표현형 마이크로어레이 기술은 다양한 항목 대사산물에 대응하여 세포 대사 활동을 기능적으로 결정하는 효과적인 고처리량 방법입니다. 본 기술의 활용도는 테트라졸륨 계 레독스 염료의 NADH 감소에 의해 생성된 색 개발의 양에 의해 결정되는 세포 호흡의 형태로 측정된다. 이 작품에서는 모델 종 클라미도모나스 레인하르트티이를 사용하여 미세 조류의 맥락에서 표현형 마이크로 어레이 어레이 의 사용을 소개합니다.
이 연구의 목적은 기존의 조류 대사 네트워크 모델을 확장하거나 새로운 모델의 재건을 안내하는 데 사용할 수있는 미세 조류의 대사 phenotyping을 특성화하기위한 신뢰할 수있는 방법을 확립하는 것입니다. 클라미도모나스 레인하르트티균CC-503은 미국 미네소타 대학교의 클라미도모나스 자원 센터에서 얻을 수 있다. 신선한 트리세테이트 인산염 지방 미디어에서 세포를 중간 로그 단계로 성장시면 됩니다.
현미경의 밑에 세포를 확인해서 그(것)들이 좋은 모양이고 어떤 오염도 없는지 확인하십시오. 2000 G-force에서 10분 동안 문화를 회전시하십시오. 펠릿을 방해하지 않고 상체를 버리십시오.
0.1%테트라졸륨 바이올륨 염료 D"를 함유한 신선한 탭 미디어를 제조하여 세포에 타임틴틴, 암피실린, 카나마이신 등 다양한 항생제를 첨가하여 세균 성장을 억제한다. 지방 매체와이 단계는 각 플레이트 유형에 따라 영양소에서 생략해야합니다. 펠릿과 신선한 탭 미디어를 밀리리터당 100만 개의 세포로 다시 중단합니다.
탄소 공급원, 질소 공급원, 인 및 황 소스 플레이트 및 펩타이드 질소 소스와 같은 화학 화합물 어레이 분석 플레이트를 사용합니다. 에세이 플레이트의 각 웰에 자체 함유 매체의 100 마이크로리터를 접종. 에세이를 복제해야 합니다.
이 단계에서 세포는 세균 오염을 모니터링하기 위해 분석 전후에 그램 음성 얼룩으로 테스트되어야한다는 점에 유의해야합니다. 마이크로 플레이트 판독기 시스템에 화학 화합물 영역 분석 플레이트를 삽입합니다. 모든 플레이트를 최대 7일 동안 30도에서 배양하고 마이크로플레이트 판독기 시스템을 프로그래밍하여 15분마다 염료 색상 변화를 읽습니다.
대부분의 마이크로 플레이트 판독기는 잠복하는 동안 연속 적인 빛의 근원을 제공하지 않기 때문에, 조류는 이성영양 호흡을 수행 할 수 있어야합니다. 마이크로 플레이트 판독기에서 원시 운동 데이터를 CSV 파일로 내보내면 표현형 마이크로 어레이 소프트웨어 패키지 및 소프트웨어에 대한 입력으로 사용됩니다. 표현형 마이크로어레이 데이터 분석을 수행하려면 R 소프트웨어 환경에서 실행되는 OmniLog 표현형 마이크로 Erik OPM 소프트웨어 패키지를 사용합니다.
R 스튜디오에서 R의 그래픽 사용자 인터페이스는 원고에 자세히 설명된 명령을 사용하여 OPM 패키지와 종속성을 설치합니다. 운동 데이터의 CSV 파일을 포함하는 디렉터리로 이동하여 읽기 OPM 함수를 사용하여 데이터를 가져옵니다. 운동 데이터는 pref 매개 변수 추정을 사용하여 집계및 불연속화될 수 있습니다.
함수 XY 플롯을 사용하면 호흡 또는 성장 측정을 분석 96 웰 플레이트의 시간 함수로 매핑할 수 있습니다. 데이터는 함수 수준 플롯을 사용하여 히트 맵으로 시각화하여 운동 데이터의 빠른 비교 개요를 허용할 수 있습니다. 다음 단계는 새로운 대사 산물과 관련된 반응과 유전자를 식별하는 것입니다.
조류에 대한 기존 모델이 존재하는 경우, 표현형 마이크로어레이 시스템의 데이터 분석을 사용하여 이 모델을 구체화할 수 있다. 여기서 우리는 표현형 마이크로어레이 데이터를 사용하여 Chlamydomonas 모형을 위한 게놈 규모의 신진 대사 네트워크 정제를 위해 사용된 파이프라인을 제시합니다. 새로운 화합물 테스트가 활용을 위해 양성인 경우, 화합물의 관련 반응 프로파일은 대사 지식 기준을 사용하여 정의되어 관련 효소 커미션 번호를 제공한다.
첫 번째 단계는 케그와 메타사이클을 검색하여 효소 커미션 번호, EC를 식별하여 화학 화합물 어레이에서 발견된 대사를 사용한 반응을 식별하는 것입니다. 다음으로, 당사는 확인된 EC 번호를 공동 게놈 연구소, JGI, Phytozome 및 피어 검토 간행물과 같은 다중 사용 가능한 조류 성서 자원에서 검색 기반으로 사용합니다. 코브라계 클라미도모나스 라인하르트티 대사 네트워크 모델iRC1080에 반응및 대사산물이 추가되어 모델을 확장하고 정제한다.
EC 번호를 지원하는 유전적 증거가 발견되지 않으면 NCBI 위치 특이적 반복성, NCBI PSI-BLAST와 같은 프로파일 기반 검색이 반응과 관련된 후보 유전자를 식별하기 위해 수행될 수 있다. 그런 다음 결과를 수동으로 평가합니다. 검색 EC 번호와 관련성을 위해 E 값0.05 미만으로 이 QC 단계를 전달하는 경우 메트릭 모델에 추가됩니다.
이 프로토콜의 마지막 단계는 모델을 구체화하고 모델을 평가하고 비교하는 것입니다. 최신 COBRA 툴박스 버전 3.0과 MATLAB 플랫폼을 사용하여 모델 개선 단계를 수행합니다. 코브라 도구 상자를 설치한 후 iRC1080 모델을 다운로드할 수 있습니다.
그런 다음 MATLAB에서 가장 먼저 해야 할 일은 참조 모델iRC1080을 포함하는 폴더로 이동하는 것입니다. 코브라 툴박스 기능을 사용하여 iRC1080과 같은 신진 대사 모델에 관련 유전자를 가진 확인된 반응을 추가합니다. 반응을 추가하고 유전자 협회를 변경합니다.
iRC1080 모델이 포함된 디렉터리로 이동하여 모델을 로드하는 명령을 실행합니다. 이름을 바꾸고 새로운 반응과 관련 유전자를 추가합니다. 어떤 경우에는 대사산물이 세포내에서 생산되지 않고, 매체로부터 취항되는 경우, 새로운 대사산물에 대한 수송 반응은 세포외 배지로 대사산물을 입력하거나 출력하기 위해 추가/교환 반응 기능을 사용하여 모델에 추가되어야 한다.
새로운 결과 및 모델, 예를 들어, iBD1106의 동작을 테스트하여, 플럭스 밸런스 분석을 수행하여 FBA, 이 기능을 사용하여 물체 함수로서 바이오매스의 최대화를 위해 밝고 어두운 조건에서 CB 모델을 최적화한다. 그 중에서도 FBA 솔루션은 반응 플럭스, 대사산물 그림자 가격 및 반응 감소 비용 세 벡터를 출력합니다. 여기서, iRC1080 모델이 각 모델에서 차지하는 변화 및 대사산물에 대한 바이오매스 객관적 기능의 감도를 나타내는 섀도우 가격을 획득하여, 정제된 버전iBD1106과 비교되는 예가 제공된다.
여기서 우리는 각각 청록색과 보라색으로 블랭크 및 CC-503에 대한 탄소 원및 질소 소스 분석 플레이트의 호흡 XY 플롯 및 레벨 플롯을 보여줍니다. 각 우물 내에서 호흡 곡선은 시간 함수로서 감소하여 염료 변환을 나타냅니다. 패널 A의 강조 된 피크는 클라미도모나스 문학과 일치하는이 플레이트에서 유일한 탄소 원으로 아세테이트의 검출을 나타냅니다.
세 가지 다른 방법을 사용하여 확인된 대사 산물의 수의 비교, iRC1080, 이는 잘 큐레이터 클라미도모나 대사 모델, 비행 GC-TOF의 가스 크로마토그래피 시간, 그리고 표현형 마이크로 어레이 에세이는 3 세트 사이에 6 개의 대사 산물 중첩을 보여줍니다, 동안 149 는 iRC108마이크로어레이로 iRC1088. 이것은 각 기술이 신진 대사 프로파일링 연구를 향해 힘을 가지고 있지만, 표현형 마이크로 어레이 분석 세트는 새로운 대사 정보의 중요한 근원이 될 수 있다는 것을 보여줍니다. 획득된 정보는 대사 네트워크 모델 iRC1080을 확장하고 정제하는 데 사용되었다.
여기서, 우리는 iRC1080 모델의 함량과 확장 된 모델 iBD1106의 함량을 비교, 반응의 수, 대사 산물의 수와 유전자의 수를 포함. 모델 정제는 새로운 결과 네트워크에 254개 이상의 반응을 추가한 것으로 나타났습니다. 이러한 반응은 아미노산, 디펩티드, 트리펩티드 및 수송 반응으로 분류됩니다.
새로 확인된 대사산물은 기존 클라미도모나스 라인하르트티 대사 모델의 대사 네트워크 확장 및 정제에 사용되었다. 표현형 마이크로어레이 어더세약은 기존 및 새로 분리된 균주의 대사 표현형을 특성화하는 데 사용될 수 있다. 또한, 미세 조류의 맥락에서 우리가 사용한 프로토콜은 다른 종의 대사 모델의 정제를 안내 할 수 있습니다.
