Name: cerebellar regional dissection for molecular analysis
Uploaded: 2020-12-05T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cerebellar Regional Dissection for Molecular Analysis at JoVE.com

We zijn Austin Ferro en Juao-Guilherme Rosa in het Cvetanovic-lab dankbaar voor hun hulp bij het oplossen van dissecties en bij RNA-extractie en RTqPCR. Dit onderzoek wordt gefinancierd door M. Cvetanovic, R01 NS197387; HHS | Nationale Instituten voor Gezondheid (NIH).

1. Instellen
<ol><li>Verzamel de benodigde apparatuur, waaronder onthoofdingschaar, stompe tang, dissectieschaar, vasculaire schaar, microspatula, sagittale muishersenmatrix, scheermesjes, 200 μL pipetpunten, glazen petrischaal, glazen glijbaan en ijsemmer. Leg alle apparatuur op een absorberend kussen.</li>
	<li>Plaats petrischaal, glazen plaat en hersenmatrix op ijs.</li>
	<li>Knip met een scheermesje loodrecht onder een loodrechte hoek ongeveer 5 mm van de punt van een pipetpunt van 200 μL af. Hie...

<ol>
	<li>Herculano-Houzel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glia/neuron+ratio:+How+it+varies+uniformly+across+brain+structures+and+species+and+what+that+means+for+brain+physiology+and+evolution.">The glia/neuron ratio: How it varies uniformly across brain structures and species and what that means for brain physiology and evolution.</a> Glia. 62 (9), 1377-1391 (2014).</li><li>Schmahmann, J. D., Caplan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cognition,+enotion,+and+the+cerebellum.">Cognition, enotion, and the cerebellum.</a> Brain. 129 (2), 290-292 (2006).</li><li>Badura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+cognitive+and+social+development+require+posterior+cerebellar+activity.">Normal cognitive and social development require posterior cerebellar activity.</a> eLife. 7, 36401 (2018).</li><li>Diedrichsen, J., King, M., Hernandez-Castillo, C., Sereno, M., Ivry, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+Transform+or+Multiple+Functionality?+Understanding+the+Contribution+of+the+Human+Cerebellum+across+Task+Domains.">Universal Transform or Multiple Functionality? Understanding the Contribution of the Human Cerebellum across Task Domains.</a> Neuron. 102 (5), 918-928 (2019).</li><li>Strick, P. L., Dum, R. P., Fiez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellum+and+Nonmotor+Function.">Cerebellum and Nonmotor Function.</a> Annual Review of Neuroscience. 32 (1), 413-434 (2009).</li><li>King, M., Hernandez-castillo, C. R., Poldrack, R. A., Ivry, R. B., Diedrichsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+boundaries+in+the+human+cerebellum+revealed+by+a+multi-domain+task+battery.">Functional boundaries in the human cerebellum revealed by a multi-domain task battery.</a> Nature Neuroscience. 22, 1371-1378 (2019).</li><li>Buckner, R. L., Krienen, F. M., Castellanos, A., Diaz, J. C., Yeo, B. T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+organization+of+the+human+cerebellum+estimated+by+intrinsic+functional+connectivity.">The organization of the human cerebellum estimated by intrinsic functional connectivity.</a> Journal of neurophysiology. 106 (5), 2322-2345 (2011).</li><li>Schmahmann, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+movement+to+thought:+Anatomic+substrates+of+the+cerebellar+contribution+to+cognitive+processing.">From movement to thought: Anatomic substrates of the cerebellar contribution to cognitive processing.</a> Human Brain Mapping. 4 (3), 174-198 (1996).</li><li>Kelly, R. M., Strick, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+Loops+with+Motor+Cortex+and+Prefrontal+Cortex+of+a+Nonhuman+Primate.">Cerebellar Loops with Motor Cortex and Prefrontal Cortex of a Nonhuman Primate.</a> The Journal of Neuroscience. 23 (23), 8432-8444 (2003).</li><li>Stoodley, C. J., Macmore, J. P., Makris, N., Sherman, J. C., Schmahmann, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+Location+of+lesion+determines+motor+vs.+cognitive+consequences+in+patients+with+cerebellar+stroke.">Clinical Location of lesion determines motor vs. cognitive consequences in patients with cerebellar stroke.</a> NeuroImage: Clinical. 12, 765-775 (2016).</li><li>Guo, C. C., Tan, R., Hodges, J. R., Hu, X., Sami, S., Hornberger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Network-selective+vulnerability+of+the+human+cerebellum+to+Alzheimer's+disease+and+frontotemporal+dementia.">Network-selective vulnerability of the human cerebellum to Alzheimer's disease and frontotemporal dementia.</a> Brain. 139 (5), (2016).</li><li>Bocchetta, M., Cardoso, M. J., Cash, D. M., Ourselin, S., Warren, J. D., Rohrer, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+regional+cerebellar+atrophy+in+genetic+frontotemporal+dementia.">Patterns of regional cerebellar atrophy in genetic frontotemporal dementia.</a> NeuroImage: Clinical. 11, 287-290 (2016).</li><li>Sillitoe, R. V., Fu, Y., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellum.">Cerebellum.</a> The Mouse Nervous System. , 360-397 (2012).</li><li>Nguyen-Minh, V. T., Tran-Anh, K., Luo, Y., Sugihara, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+Excitability+and+Parallel+Fiber+Synaptic+Properties+of+Zebrin-Positive+and+-Negative+Purkinje+Cells+in+Lobule+VIII+of+the+Mouse+Cerebellar+Slice.">Electrophysiological Excitability and Parallel Fiber Synaptic Properties of Zebrin-Positive and -Negative Purkinje Cells in Lobule VIII of the Mouse Cerebellar Slice.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 513 (2019).</li><li>Manto, M., Oulad Ben Taib, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+nuclei:+Key+Roles+for+Strategically+Located+Structures.">Cerebellar nuclei: Key Roles for Strategically Located Structures.</a> The Cerebellum. 9 (1), 17-21 (2010).</li><li>Driessen, T. M., Lee, P. J., Lim, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathway+analysis+towards+understanding+tissue+vulnerability+in+spinocerebellar+ataxia+type+1.">Molecular pathway analysis towards understanding tissue vulnerability in spinocerebellar ataxia type 1.</a> eLife. , (2018).</li><li>Grabert, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+brain+region+-+dependent+diversity+and+selective+regional+sensitivities+to+aging.">Microglial brain region - dependent diversity and selective regional sensitivities to aging.</a> Nat Neurosci. 19 (3), 504 (2016).</li><li>Ingram, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+Transcriptome+Profiles+of+ATXN1+Transgenic+Mice+Reveal+SCA1+Disease+Progression+and+Protection+Pathways.">Cerebellar Transcriptome Profiles of ATXN1 Transgenic Mice Reveal SCA1 Disease Progression and Protection Pathways.</a> Neuron. 89 (6), 1194-1207 (2016).</li><li>Cendelin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> From mice to men : lessons from mutant ataxic mice. , 1-21 (2014).</li><li>Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+RNA+Using+TRIzol+(TRI+Reagent).">Purification of RNA Using TRIzol (TRI Reagent).</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (6), (2010).</li><li>Kim, J. H., Lukowicz, A., Qu, W., Johnson, A., Cvetanovic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astroglia+contribute+to+the+pathogenesis+of+spinocerebellar+ataxia+Type+1+(SCA1)+in+a+biphasic,+stage-of-disease+specific+manner.">Astroglia contribute to the pathogenesis of spinocerebellar ataxia Type 1 (SCA1) in a biphasic, stage-of-disease specific manner.</a> Glia. 66 (9), 1972-1987 (2018).</li><li>Chopra, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+Capicua+expression+drives+regional+Purkinje+neuron+vulnerability+through+ion+channel+gene+dysregulation+in+spinocerebellar+ataxia+type+1.">Altered Capicua expression drives regional Purkinje neuron vulnerability through ion channel gene dysregulation in spinocerebellar ataxia type 1.</a> Human Molecular Genetics. , (2020).</li></ol>

De hier beschreven methode maakt het mogelijk om de onderliggende genexpressie en moleculaire mechanismen binnen vier verschillende cerebellaire gebieden te beoordelen - de diepe cerebellaire kernen (DCN), de voorste cerebellaire cortex van de vermis (CCaV), de achterste cerebellaire cortex van de vermis (CCpV) en de cerebellaire cortex van de hemisferen (CCH). Het vermogen om deze regio's afzonderlijk te beoordelen zal onze kennis van de heterogeniteit van specifieke cerebellaire regio's uitbreiden en mogelijk licht wer...

Het cerebellum bevat meer dan de helft van de neuronen in de hersenen en is historisch aangeduid als een motorische controle en evenwicht centrum in de hersenen1. Meer recentelijk hebben studies aangetoond dat het cerebellum een sleutelrol speelt in verschillende andere functies, waaronder cognitie, beloningsverwerking en2,3,4,5beïnvloedt .
Het cerebellum heeft een goed beschreven anatomie: het cortexgebied bestaat uit korrels, Purkinje en moleculaire lagen. Korrelcellen vormen de korrelcellaag en sturen via parallelle vezels input naar de Purkinje-celdendrieten van de moleculaire laag die ook input ontvangen van klimvezels die afkomstig zijn van de inferieure olijf. Purkinje-cellen sturen remmende projecties naar cellen in de diepe cerebellaire kernen (DCN), die dient als de belangrijkste output van het cerebellum. De output van dit cerebellaire circuit wordt verder gemoduleerd door de activiteit van de remmende interneurons in de cerebellaire cortex, waaronder Golgi, stellaat en mandcellen4. Deze cerebellaire functionele eenheid is verdeeld over alle lobules van de cerebellaire cortex. Ondanks deze relatief uniforme circuits over het cerebellum wijst bewijs uit menselijke neuroimaging literatuur en patiëntenstudies op functionele heterogeniteit van het cerebellum6,7.
De cerebellaire cortex kan worden onderverdeeld in twee hoofdgebieden: de middellijngedefinieerde vermis en de laterale hemisferen. De vermis kan verder worden onderverdeeld in voorste en achterste lobules. Deze verschillende gebieden van het cerebellum zijn betrokken bij het bijdragen aan verschillende gedragingen. Taak-opgeroepen of taakvrije activiteitspatronen impliceerden dat voorste gebieden van de vermis meer bijdragen aan de motorische functie, terwijl posterieure vermis meer bijdraagt aan cognitie6,7. De vermis is ook verbonden met affect en emoties, terwijl cerebellaire hemisferen bijdragen aan uitvoerende, visueel-ruimtelijke, taal en andere mnemonische functies8. Bovendien leverden anatomische studies bewijs dat functioneel verschillende cerebellaire regio's verbonden zijn met verschillende corticale regio's9. Laesiesymptomen in kaart gebracht bleek dat patiënten met beroertes die de voorste lobules aantasten (die zich uitstrekken tot lobule VI) slechtere prestaties hadden bij fijne motorische taken, terwijl patiënten met schade aan achterste kwabregio's en hemisferen cognitieve tekorten vertoonden bij afwezigheid van cerebellair motorisch syndroom10. Ten slotte geeft regionale cerebellaire pathologie bij ziekten aan dat functioneel verschillende cerebellaire regio's ook verschillend vatbaar zijn voor ziekte11,12.
Hoewel veel minder onderzocht, toont voorlopig bewijs verschillende genexpressiesignaturen aan in cerebellaire corticale regio's. Purkinje celexpressie van Zebrin II toont regiospecifieke patronen in de vermis zodanig dat er meer Zebrin II positieve cellen in de achterste lobules en minder in de voorste lobules13. Dit correleert ook met regionaal onderscheidende fysiologische functie als Zebrin II negatieve Purkinje cellen vertonen een hogere frequentie van tonic vuren dan Purkinje cellen die Zebrin II positief14.
Naast de cerebellaire cortex omvat het cerebellum de diepe cerebellaire kernen (DCN) die dienen als de primaire output voor het cerebellum. De kernen bestaan uit de mediale (MN), interposed (IN) en laterale kernen (LN). Functionele beeldvorming en patiëntstudies hebben aangetoond dat de DCN ook deelneemt aan verschillende gedragingen15, maar zeer weinig studies onderzoeken genexpressieverandering in DCN.
Vooruitgang in moleculaire technieken heeft het mogelijk gemaakt om regionale genexpressie in de hersenen te beoordelen en heeft heterogeniteit in en binnen verschillende hersengebieden in zowel fysiologische als ziektetoestanden blootgelegd16. Dergelijke studies impliceren dat het cerebellum verschilt van andere hersengebieden. De verhouding van neuronen tot gliacellen wordt bijvoorbeeld omgekeerd in het cerebellum in vergelijking met andere hersengebieden1. Zelfs in normale fysiologische omstandigheden wordt de expressie van pro-inflammatoire genen geüreguleerd in het cerebellum in vergelijking met de andere hersengebieden17. Moleculaire technieken zijn ook zeer nuttig geweest bij het identificeren van de paden die bijdragen aan de pathogenese van cerebellaire ziekten. Bijvoorbeeld, RNA sequencing van de hele cerebellaire extracten geïdentificeerd genen veranderd in een Purkinje cel specifieke transgene muis model van spinocerebellaire ataxie type 1 (SCA1) in vergelijking met hun wild type controles. Dergelijk bewijs heeft belangrijke moleculaire routes onthuld die ten grondslag liggen aan pathogenese in cerebellaire Purkinje-cellen en heeft geholpen bij het identificeren van potentiële therapeutische doelen18. Recente studies suggereren echter dat er verschillen zijn in de kwetsbaarheid voor ziekten in de cerebellaire regio 's11,12,19. Dit kan erop wijzen dat er belangrijke veranderingen optreden in verschillende cerebellaire regio's, die kunnen worden gemaskeerd of onopgemerkt met hele cerebellaire extracten. Er is dus behoefte aan technieken waarmee onderzoekers moleculaire profielen in verschillende cerebellaire gebieden kunnen onderzoeken.
De hier voorgestelde techniek beschrijft een reproduceerbare methode om vier verschillende gebieden van het muis cerebellum te ontleden om RNA van die gebieden te isoleren en regionale verschillen in genexpressie te onderzoeken. Het schema van het muis cerebellum in figuur 1A markeert de vermis in blauw en hemisferen in geel. In het bijzonder maakt deze techniek het mogelijk om vier regio's te isoleren: diepe cerebellaire kernen (DCN) (roodgestippelde vakken in figuur 1A),de cerebellaire cortex van voorste vermis (CCaV) (donkerblauw in figuur 1A),de cerebellaire cortex van de posterieure vermis (CCpV) (lichtblauw in figuur 1A)en de cerebellaire cortex van de hemisferen (CCH) (geel in figuur 1A). Door de genexpressie van deze regio's afzonderlijk te beoordelen, zal het mogelijk zijn om moleculaire mechanismen te onderzoeken die ten grondslag liggen aan discrete functies van deze verschillende regio's, evenals potentiële verschillen in hun kwetsbaarheid voor ziekten.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >1.5 Microcentrifuge tubes</td>
			<td >ThermoScietific</td>
			<td >3456</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >100% Isopropyl Alcohol</td>
			<td >VWR Life sciences</td>
			<td >1106C361</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >200 ul Pipet tips</td>
			<td >GeneMate</td>
			<td >P-1237-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Adult Mouse Brain Matrix Sagittal</td>
			<td >Kent Scientific Corporation</td>
			<td >RBMA-200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Blunt forceps</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Chloroform</td>
			<td >Macron</td>
			<td >220905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Decapitation Scissors</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dissecting Scissors</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethyl Alcohol</td>
			<td >Pharmco</td>
			<td >111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glass Slide (for electrophoresis)</td>
			<td >BIORAD</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Homogenizer</td>
			<td >Kimble</td>
			<td >6HAZ6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ice Bucket</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Insulin Syringe (.5ml)</td>
			<td >BD</td>
			<td >329461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >iScript Adv cDNA kit for RT-qPCR</td>
			<td >BIORAD</td>
			<td >1725037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micro Spatula</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Needle Nose forceps</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Petri Dish</td>
			<td >Pyrex</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Primetime Primer for Aldolase C</td>
			<td >IDT</td>
			<td >Mm.PT.58&#62;43415246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Primetime Primer for Kcng4</td>
			<td >IDT</td>
			<td >Mm.PT.56a.9448518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Primetime Primer for Parvalbumin</td>
			<td >IDT</td>
			<td >Mm.PT.58.7596729</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Primetime Primer Rps18&#160;</td>
			<td >IDT</td>
			<td >Mm.PT.58.12109666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Single Edge Rzor Blades</td>
			<td >Personna GEM</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterile, sigle-use pestles</td>
			<td >FisherScientific</td>
			<td >12141364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TRIzol Reagent</td>
			<td >Ambion by Life technologies</td>
			<td >15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vascular Scissors</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cerebellar regional dissection for molecular analysis

Cerebellum speelt een belangrijke rol in verschillende belangrijke functies, waaronder controle van beweging, evenwicht, cognitie, beloning en invloed. Beeldvormende studies geven aan dat verschillende cerebellaire regio's bijdragen aan deze verschillende functies. Moleculaire studies die regionale cerebellaire verschillen onderzoeken, blijven achter, omdat ze meestal worden gedaan op hele cerebellaire extracten, waardoor elk onderscheid tussen specifieke cerebellaire regio's wordt gemaskeerd. Hier beschrijven we een techniek om vier verschillende cerebellaire gebieden reproduceerbaar en snel te ontleden: de diepe cerebellaire kernen (DCN), de voorste en achterste verale cerebellaire cortex en de cerebellaire cortex van de hemisferen. Het ontleden van deze verschillende regio's maakt het mogelijk om moleculaire mechanismen te verkennen die ten grondslag kunnen liggen aan hun unieke bijdragen aan evenwicht, beweging, invloed en cognitie. Deze techniek kan ook worden gebruikt om verschillen in pathologische gevoeligheid van deze specifieke regio's tussen verschillende muisziektemodellen te onderzoeken.

Voor deze experimenten werden vier elf weken oude vrouwelijke wilde type C57/Black6 muizen gebruikt. Eén muis werd gebruikt om een volledige cerebellaire dissectie uit te voeren die "bulk cerebellum" wordt genoemd en die het mogelijk maakte om RNA-niveaus in ontleedde gebieden te vergelijken met een volledige dissectie. De andere drie muizen werden gebruikt om de cerebellaire dissectie uit te voeren die in dit protocol wordt beschreven. Het gebruik van drie muizen maakt het mogelijk om e...

Watch this Scientific Journal Video about Cerebellar Regional Dissection for Molecular Analysis at JoVE.com

Cerebellar Regional Dissection for Molecular Analysis

Verschillende cerebellaire regio's zijn betrokken om een rol te spelen in verschillende gedragsoutputs, maar de onderliggende moleculaire mechanismen blijven onbekend. Dit werk beschrijft een methode om de cerebellaire cortex van de hemisferen, voorste en achterste gebieden van de vermis en de diepe cerebellaire kernen reproduceerbaar en snel te ontleden om moleculaire verschillen te onderzoeken door RNA te isoleren en te testen op verschillen in genexpressie.

Cerebellaire regionale dissectie voor moleculaire analyse

Cerebellum plays an important role in several key functions including control of movement, balance, cognition, reward, and affect. Imaging studies ...

Traditional molecular studies of the cerebellum have been done on whole cerebellar extracts, which may mask any distinctions across specific cerebellar regions. This protocol makes it possible to assess distinct regions of the cerebellum separately and allows for the exploration of molecular mechanisms that may underlie their unique contributions to a variety behaviors and disease progression. The main advantage of this technique is that it allows for the reproducible and quick dissection of four cerebellar regions, the deep cerebellar nuclei, the anterior and posterior cerebellar cortex of the Vermis and the cerebellar cortex of the hemispheres.After decapitating the euthanized mouse, make an incision with a razor blade along the medial sagittal line of the head, starting at the nose and continuing all the way back. Separate the skin and use the razor blade to cut away the muscle on each side, cutting down past the ear canals. Using dissecting scissors, trim many spinal cord regions up to where the brain stem meets the cerebellum, taking care to not damage the cerebellum.Insert one of the vascular scissor blades into the space between the brainstem and vertebral column and cut toward the ear canal, lifting upward while cutting to limit damage to the tissue. Continue to cut along the edge of the skull up toward the olfactory bulbs. Using the blunt forceps, gently peel off the back of this skull to uncover the posterior region of the brain and cerebellum.Position the blunt forceps along the cut edge of the skull and peel the skull up and over the brain. Trim the rest of the skull with the vascular scissors and blunt forceps, clearing most of it from the top of the brain. Slightly lift the brain with the micro spatula to remove the olfactory bulbs from the remaining skull and disconnect optic tract fibers.The brain should come free easily at this point. Place the brain into the Petri dish, sitting on ice and remove any remaining skull or other debris. Gently place the brain into the brain matrix with the dorsal side up.Make sure that it is set level in the matrix and that the midline is in the center. Place one razor blade along the sagittal midline, making sure that the blade pushes all the way to the bottom of the matrix. Place another razor blade one millimeter to the side of the first blade.Place two more blades resulting in three blades placed on one side of the brain, all one millimeter apart. Repeat this on the other side. carefully grab the front and back end to the razorblades, and lift them straight up out of the matrix.Discard the tissue on the outside of the razor blades. Slowly, separate one razor blade at a time from the others being careful not to damage the tissue sections. Slide the tissue section off the razor blade and onto the glass slide with the micro spatula.Six sagittal brain sections should be collected. The foremost lateral sections will have DCN visible. To isolate the DCN, hold a trim to 200 microliter pipette tip perpendicularly over the DCN and push down through the tissue firmly rocking in all directions.Lift the pipette up and visually confirm the presence of the tissue in the tip. Place one finger at the top of the tip and push down, causing the tissue to bulge out. Insert the tip into a correctly labeled microfiche tube and ensure that the tissue punch is placed in the bottom of the tube.Repeat this for the remaining three sections, placing the DCN punches in the same tube. Flash freeze the tube in liquid nitrogen. Push away the rest of the brain tissue around the cerebellum in the sections where the DCN was extracted.Use blunt forceps to gently pick up these hemisphere cerebellar cortex sections and place them into respective microfiche tubes, then flash freeze them. For the last two vermal sections, push away surrounding brain tissue to leave only the cerebellum. Using a razor blade, make a cut separating the anterior labials from the posterior labials.Ensure that the cut is just after the formation of labial six and does not include labial 10. Using blunt forceps, carefully placed the anterior cerebellar cortex sections and posterior cerebellar cortex sections into their respective microfiche tubes and flash freeze them by leaving the tubes in liquid nitrogen for five minutes. Place the microfiche tubes on ice to keep the tissue from thawing too quickly and apply 150 microliters of cold RNA isolation solution in the microfiche tube, then homogenize with a sterilized pestle.Once the tissue is homogenized pipette the solution up and down to ensure there is no remaining intact tissue. Further, break up any small tissue pieces by pulling it up into an insulin syringe a few times. Add another 350 microliters of the reagent, pipette up and down to mix thoroughly and let it sit at room temperature for five minutes.Add 150 microliters of chloroform to the tube and shake it vigorously, then let it rest for two to three minutes. Centrifuge at 12, 000 times G at 15 degrees Celsius for 10 minutes. Carefully remove the tubes from the centrifuge and set the temperature of the centrifuge to four degrees Celsius.Transfer only the clear aqueous phase into a new tube, taking care not to disrupt the opaque interphase. Save or discard the remaining solution in the tubes. Add 100%isopropyl alcohol at a one to two ratio and mix thoroughly by pipetting up and down.Let the sample rest at room temperature for 10 minutes to precipitate the RNA out of the solution. Centrifuge at 12, 000 times G and four degrees Celsius for 10 minutes, placing all tubes in the same orientation to make it easier to visualize the pellet. After centrifugation, carefully remove the tubes and remove the supernatant with the pipette, making sure to not disrupt the pellet.The pellet is gel like and difficult to see, so estimate where it is based on the orientation of the tubes in the centrifuge. After removing all supernatant, add 500 microliters of 75%ethanol, vortex briefly and centrifuge at 7, 500 times G and four degrees Celsius for five minutes. Remove the supernatant carefully, without disrupting the pellet.Leave the caps open to dry the sample for five to 10 minutes. Once dry resuspend the pellet in DNA's free water at 20 microliters to the samples for DCN and 30 microliters for all others. Store the samples at minus 80 degrees Celsius until further analysis.This protocol was used to dissect four distinct regions of the mouse cerebellum and to explore regional differences in gene expression. The expression levels of Aldolase C, parvalbumin and KCNG4 were assessed using real-time quantitative PCR. Aldolase C is more highly expressed in the posterior cerebellar vermis.But lower in the DCN and the anterior region of the vermis when compared to the bulk cerebellar dissection. Parvalbumin is similarly present in the DCN anterior vermis, posterior vermis and hemisphere cerebellar cortices, when compared to bulk cerebellar extracts. KCNG4 is significantly enriched in the DCN and the interior vermis, but not in the posterior vermis or hemispheres when compared to the bulk extraction.To directly compare the expression of aldolase C across the cerebellar cortex, the expression levels were compared to the anterior vermis. The expression level of aldolase C was significantly higher in the posterior Vermis and trending higher in the cerebellar hemispheres. The RNA extracted from these regions can also be used in RNA sequencing, experiments.RNA seq comparing these for cerebellar regions would provide more detailed information on molecular mechanisms, underlying discrete functions of these regions. As well as potential differences in their vulnerability in disease.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Simple Composite Phenotype Scoring System for Evaluating Mouse Models of Cerebellar Ataxia

A Simple Composite Fenotype Scoring System voor het evalueren van muismodellen van cerebellaire ataxie

We describe a protocol for the rapid and sensitive quantification of disease severity in mouse models of cerebella ataxia. It is derived from previously ...

Organotypic Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

Organotypische Cerebellaire culturen: apoptotische uitdagingen en Detectie

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. ...

Single Drosophila Ommatidium Dissection and Imaging

Single Drosophila Ommatidium Dissection and Imaging

Single Drosophila Ommatidium Dissection en Imaging

The fruit fly Drosophila melanogaster has made invaluable contributions to neuroscience research and has been used widely as a model for neurodegenerative ...

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

Kwantitatieve analyse van synaptische Blaasjes Pool Replenishment in gekweekte Cerebellaire Korrel Neuronen met behulp van FM-kleurstoffen

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualisatie en genetische manipulatie van dendrieten en stekels in de muis Cerebral cortex en de hippocampus met behulp van<em&gt; In utero</em&gt; Elektroporatie

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

Dissection, Cultuur en Analyse van<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryonale netvliesweefsel

The process by which  the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina  continues to be a major focus of both clinical and ...

A Dual Tracer PET-MRI Protocol for the Quantitative Measure of Regional Brain Energy Substrates Uptake in the Rat

We present a method for comparing the uptake of the brain&#39;s two key energy substrates: glucose and ketones (acetoacetate [AcAc] in this case) in the ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Genetische Manipulatie van Cerebellaire Korrel Neuronen<em&gt; In Vitro</em&gt; En<em&gt; In Vivo</em&gt; Om te studeren Neuronale morfologie en Migratie

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Dissectie van de Transversus Abdominis Spier voor Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Laser nanosurgery van Cerebellar Axonen<em&gt; In Vivo</em

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to ...