Name: cerebellar regional dissection for molecular analysis
Uploaded: 2020-12-05T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cerebellar Regional Dissection for Molecular Analysis at JoVE.com

אנו מודים לאוסטין פרו וג'ואאו-גילהרמה רוזה במעבדת Cvetanovic על עזרתם בפתרון בעיות ניתוחים ובחילוץ RNA ו- RTqPCR. מחקר זה ממומן על ידי מ'סבטנוביץ', R01 NS197387; | HHS מכוני בריאות לאומיים (NIH).

1. התקנה
<ol><li>לאסוף את הציוד הדרוש כולל מספריים עריפת ראש, מלקחיים קהים, מספריים ביתוש, מספריים וסקולריים, microspatula, מטריצת המוח של עכבר קשת, סכיני גילוח, 200 קצות צינור μL, צלחת פטרי זכוכית, שקופית זכוכית, ודלי קרח. הניחו את כל הציוד על כרית סופגת.</li>
	<li>מניחים צלחת פטרי, צלחת זכוכית ומטר?...

<ol>
	<li>Herculano-Houzel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glia/neuron+ratio:+How+it+varies+uniformly+across+brain+structures+and+species+and+what+that+means+for+brain+physiology+and+evolution.">The glia/neuron ratio: How it varies uniformly across brain structures and species and what that means for brain physiology and evolution.</a> Glia. 62 (9), 1377-1391 (2014).</li><li>Schmahmann, J. D., Caplan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cognition,+enotion,+and+the+cerebellum.">Cognition, enotion, and the cerebellum.</a> Brain. 129 (2), 290-292 (2006).</li><li>Badura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+cognitive+and+social+development+require+posterior+cerebellar+activity.">Normal cognitive and social development require posterior cerebellar activity.</a> eLife. 7, 36401 (2018).</li><li>Diedrichsen, J., King, M., Hernandez-Castillo, C., Sereno, M., Ivry, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+Transform+or+Multiple+Functionality?+Understanding+the+Contribution+of+the+Human+Cerebellum+across+Task+Domains.">Universal Transform or Multiple Functionality? Understanding the Contribution of the Human Cerebellum across Task Domains.</a> Neuron. 102 (5), 918-928 (2019).</li><li>Strick, P. L., Dum, R. P., Fiez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellum+and+Nonmotor+Function.">Cerebellum and Nonmotor Function.</a> Annual Review of Neuroscience. 32 (1), 413-434 (2009).</li><li>King, M., Hernandez-castillo, C. R., Poldrack, R. A., Ivry, R. B., Diedrichsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+boundaries+in+the+human+cerebellum+revealed+by+a+multi-domain+task+battery.">Functional boundaries in the human cerebellum revealed by a multi-domain task battery.</a> Nature Neuroscience. 22, 1371-1378 (2019).</li><li>Buckner, R. L., Krienen, F. M., Castellanos, A., Diaz, J. C., Yeo, B. T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+organization+of+the+human+cerebellum+estimated+by+intrinsic+functional+connectivity.">The organization of the human cerebellum estimated by intrinsic functional connectivity.</a> Journal of neurophysiology. 106 (5), 2322-2345 (2011).</li><li>Schmahmann, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+movement+to+thought:+Anatomic+substrates+of+the+cerebellar+contribution+to+cognitive+processing.">From movement to thought: Anatomic substrates of the cerebellar contribution to cognitive processing.</a> Human Brain Mapping. 4 (3), 174-198 (1996).</li><li>Kelly, R. M., Strick, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+Loops+with+Motor+Cortex+and+Prefrontal+Cortex+of+a+Nonhuman+Primate.">Cerebellar Loops with Motor Cortex and Prefrontal Cortex of a Nonhuman Primate.</a> The Journal of Neuroscience. 23 (23), 8432-8444 (2003).</li><li>Stoodley, C. J., Macmore, J. P., Makris, N., Sherman, J. C., Schmahmann, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+Location+of+lesion+determines+motor+vs.+cognitive+consequences+in+patients+with+cerebellar+stroke.">Clinical Location of lesion determines motor vs. cognitive consequences in patients with cerebellar stroke.</a> NeuroImage: Clinical. 12, 765-775 (2016).</li><li>Guo, C. C., Tan, R., Hodges, J. R., Hu, X., Sami, S., Hornberger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Network-selective+vulnerability+of+the+human+cerebellum+to+Alzheimer's+disease+and+frontotemporal+dementia.">Network-selective vulnerability of the human cerebellum to Alzheimer's disease and frontotemporal dementia.</a> Brain. 139 (5), (2016).</li><li>Bocchetta, M., Cardoso, M. J., Cash, D. M., Ourselin, S., Warren, J. D., Rohrer, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+regional+cerebellar+atrophy+in+genetic+frontotemporal+dementia.">Patterns of regional cerebellar atrophy in genetic frontotemporal dementia.</a> NeuroImage: Clinical. 11, 287-290 (2016).</li><li>Sillitoe, R. V., Fu, Y., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellum.">Cerebellum.</a> The Mouse Nervous System. , 360-397 (2012).</li><li>Nguyen-Minh, V. T., Tran-Anh, K., Luo, Y., Sugihara, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+Excitability+and+Parallel+Fiber+Synaptic+Properties+of+Zebrin-Positive+and+-Negative+Purkinje+Cells+in+Lobule+VIII+of+the+Mouse+Cerebellar+Slice.">Electrophysiological Excitability and Parallel Fiber Synaptic Properties of Zebrin-Positive and -Negative Purkinje Cells in Lobule VIII of the Mouse Cerebellar Slice.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 513 (2019).</li><li>Manto, M., Oulad Ben Taib, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+nuclei:+Key+Roles+for+Strategically+Located+Structures.">Cerebellar nuclei: Key Roles for Strategically Located Structures.</a> The Cerebellum. 9 (1), 17-21 (2010).</li><li>Driessen, T. M., Lee, P. J., Lim, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathway+analysis+towards+understanding+tissue+vulnerability+in+spinocerebellar+ataxia+type+1.">Molecular pathway analysis towards understanding tissue vulnerability in spinocerebellar ataxia type 1.</a> eLife. , (2018).</li><li>Grabert, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+brain+region+-+dependent+diversity+and+selective+regional+sensitivities+to+aging.">Microglial brain region - dependent diversity and selective regional sensitivities to aging.</a> Nat Neurosci. 19 (3), 504 (2016).</li><li>Ingram, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+Transcriptome+Profiles+of+ATXN1+Transgenic+Mice+Reveal+SCA1+Disease+Progression+and+Protection+Pathways.">Cerebellar Transcriptome Profiles of ATXN1 Transgenic Mice Reveal SCA1 Disease Progression and Protection Pathways.</a> Neuron. 89 (6), 1194-1207 (2016).</li><li>Cendelin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> From mice to men : lessons from mutant ataxic mice. , 1-21 (2014).</li><li>Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+RNA+Using+TRIzol+(TRI+Reagent).">Purification of RNA Using TRIzol (TRI Reagent).</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (6), (2010).</li><li>Kim, J. H., Lukowicz, A., Qu, W., Johnson, A., Cvetanovic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astroglia+contribute+to+the+pathogenesis+of+spinocerebellar+ataxia+Type+1+(SCA1)+in+a+biphasic,+stage-of-disease+specific+manner.">Astroglia contribute to the pathogenesis of spinocerebellar ataxia Type 1 (SCA1) in a biphasic, stage-of-disease specific manner.</a> Glia. 66 (9), 1972-1987 (2018).</li><li>Chopra, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+Capicua+expression+drives+regional+Purkinje+neuron+vulnerability+through+ion+channel+gene+dysregulation+in+spinocerebellar+ataxia+type+1.">Altered Capicua expression drives regional Purkinje neuron vulnerability through ion channel gene dysregulation in spinocerebellar ataxia type 1.</a> Human Molecular Genetics. , (2020).</li></ol>

השיטה המתוארת כאן מאפשרת להעריך את ביטוי הגנים הבסיסיים ואת המנגנונים המולקולריים בארבעה אזורי מוח הקטן נפרדים – גרעיני המוח הקטן העמוקים (DCN), קליפת המוח הקדמית של ורמיס (CCaV), קליפת המוח המוח האחורית של הוורמיס (CCPV), ואת קליפת המוח הקטן של חצי הכדור (CCH). היכולת להעריך אזורים אלה בנפרד תרחיב ?...

המוח הקטן מכיל יותר ממחצית הנוירונים במוח, מבחינה היסטורית המכונה מרכז שליטה ואיזון מוטורי במוח1. לאחרונה, מחקרים הראו כי המוח הקטן ממלא תפקיד מפתח בפונקציות שונות אחרות, כולל קוגניציה, עיבוד תגמול, ולהשפיעעל 2,3,4,5.
המוח הקטן יש אנטומיה המתוארת היטב: אזור קליפת המוח מורכב גרגר, Purkinje, ושכבות מולקולריות. תאי גרגר יוצרים את שכבת תא הגרגר ושולחים קלט באמצעות סיבים מקבילים לדנדריטים של תאי Purkinje של השכבה המולקולרית אשר מקבלים גם קלט מסיבי טיפוס שמקורם בזית נחות. תאי Purkinje לשלוח תחזיות מעכבות לתאים גרעיני המוח הקטן העמוק (DCN), אשר משמש את הפלט העיקרי מן המוח הקטן. הפלט של מעגל המוח הקטן הזה מווסת עוד יותר על ידי הפעילות של interneurons מעכב בקליפת המוח הקטן, כולל Golgi, stellate, ותאי סל4. יחידה תפקודית מוחית זו מופצת בכל האונים של קליפת המוח הקטן. למרות מעגלים אחידים יחסית זה על פני המוח הקטן, עדויות מספרות דימות מוחי אנושי ומחקרים סבלניים מצביעים על הטרוגניות תפקודית של המוח הקטן6,7.
קליפת המוח הקטן יכולה להיות מחולקת לשני אזורים עיקריים: ורמיס המוגדר על קו האמצע, וחצי הכדור לרוחב. ניתן לחלק את הוורמוי עוד יותר לאופות הקדמיות והאחוריות. אזורים נפרדים אלה של המוח הקטן היו מעורבים בתרומה להתנהגויות שונות. דפוסי פעילות מעוררי משימות או נטולי משימות סיבכו את העובדה שאזורים הקדמיים של הוורמיס תורמים יותר לתפקוד המוטורי בעוד שהרמיס האחורי תורם יותר לקוגניציה6,7. ורמיס מקושר גם עם השפעה ורגשות, בעוד חצי הכדור המוחי לתרום מנהל, חזותי-מרחבי, שפה, ופונקציות mnemonic אחרים8. בנוסף, מחקרים אנטומיים סיפקו ראיות לכך שאזורי המוח הקטן הייחודיים מבחינה תפקודית מחוברים לאזורים קליפתיים שונים9. מיפוי תסמיני נגע גילה כי חולים עם שבץ המשפיעים על lobules הקדמי (מתרחב לתוך lobule VI) היו ביצועים ירודים יותר על משימות מוטוריות עדינות, בעוד חולים עם נזק לאזורי האונה האחורית וחצי הכדורים הראו ליקויים קוגניטיביים בהיעדר תסמונת מוטורית מוחית10. לבסוף, פתולוגיה מוחית אזורית במחלה מצביעה על כך שאזורי המוח הקטן הייחודיים מבחינה תפקודית רגישים גם הם באופן שונה למחלה11,12.
בעוד הרבה פחות נחקר, ראיות ראשוניות מדגים חתימות ביטוי גנים ברורים על פני אזורים קליפת המוח הקטן. ביטוי התא Purkinje של Zebrin II מראה דפוס ספציפי לאזור vermis, כך שיש יותר תאים חיוביים Zebrin II ב lobules האחוריים ופחות ב lobules הקדמי13. זה גם מתואם עם תפקוד פיזיולוגי ייחודי אזורי כמו תאי Purkinje שלילי זברין II להציג תדירות גבוהה יותר של ירי טוניק מאשר תאי Purkinje כי הם זברין II חיובי14.
בנוסף קליפת המוח הקטן, המוח הקטן כולל גרעיני המוח הקטן העמוק (DCN) המשמשים את הפלט העיקרי עבור המוח הקטן. הגרעינים מורכבים מהמידל (MN), משולבים (IN) וגרעיני לרוחב (LN). הדמיה פונקציונלית ומחקרי מטופלים הראו כי DCN גם להשתתף בהתנהגויות שונות15, אבל מעט מאוד מחקרים לבחון שינוי ביטוי גנים ב- DCN.
ההתקדמות בטכניקות מולקולריות אפשרה להעריך ביטוי גנים אזורי במוח וחשפו הטרוגניות על פני ובתוך אזורי מוח שונים הן במצבים פיזיולוגיים והן במצבי מחלה16. מחקרים כאלה מסבכים כי המוח הקטן שונה מאזורי מוח אחרים. לדוגמה, היחס בין נוירונים לתאי גליה הפוך במוח הקטן בהשוואה לאזורי מוח אחרים1. אפילו בתנאים פיזיולוגיים רגילים, הביטוי של גנים פרו-דליקים הוא upregulated במוח הקטן לעומת אזורי המוחהאחרים 17. טכניקות מולקולריות היו גם מאוד שימושי בזיהוי המסלולים התורמים פתוגנזה של מחלות מוחיות. לדוגמה, רצף RNA של כל תמציות המוח הקטן זיהה גנים שהשתנו במודל עכבר מהונדס ספציפי לתא Purkinje של spinocerebellar אטקסיה סוג 1 (SCA1) בהשוואה לבקרות סוג הבר שלהם. ראיות כאלה חשפו מסלולים מולקולריים מרכזיים שבבסיס פתוגנזה בתאי פורקיניה במוח הקטן ועזרו לזהות מטרות טיפוליות פוטנציאליות18. עם זאת, מחקרים אחרונים מראים כי ישנם הבדלים בפגיעות למחלות ברחבי אזורי המוח הקטן11,12,19. זה יכול להצביע על כך שיש שינויים מרכזיים המתרחשים באזורים מוחיים נפרדים, אשר עשוי להיות רעול פנים או מבלי שיבחינו עם תמציות מוחין שלם. לכן, יש צורך לפתח טכניקות המאפשרות לחוקרים לבחון פרופילים מולקולריים באזורים מוחיים שונים.
הטכניקה המוצעת כאן מתארת שיטה ניתנת לשחזור לנתח ארבעה אזורים נפרדים של המוח הקטן של העכבר על מנת לבודד RNA מאזורים אלה ולחקור הבדלים אזוריים בביטוי גנים. השרטוט של המוח הקטן של העכבר באיור 1A מדגיש את הוורמיס בכחול, ואת ההמיספרות בצהוב. באופן ספציפי, טכניקה זו מאפשרת לבודד ארבעה אזורים: גרעיני המוח הקטן העמוק (DCN) (תיבות מנוקדות באדום באיור 1A),קליפת המוח הקטן של ורמיס הקדמי (CCaV) (כחול כהה באיור 1A), קליפת המוח המוח של ורמיס האחורי (CCpV) (כחול בהיר באיור 1A),וקליפת המוח הקטן של האונה הקדמית (CCH) (צהוב באיור 1A). על ידי הערכת ביטוי גנים של אזורים אלה בנפרד, ניתן יהיה לחקור מנגנונים מולקולריים שבביסת פונקציות נפרדות של אזורים שונים אלה, כמו גם הבדלים פוטנציאליים בפגיעותם במחלות.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >1.5 Microcentrifuge tubes</td>
			<td >ThermoScietific</td>
			<td >3456</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >100% Isopropyl Alcohol</td>
			<td >VWR Life sciences</td>
			<td >1106C361</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >200 ul Pipet tips</td>
			<td >GeneMate</td>
			<td >P-1237-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Adult Mouse Brain Matrix Sagittal</td>
			<td >Kent Scientific Corporation</td>
			<td >RBMA-200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Blunt forceps</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Chloroform</td>
			<td >Macron</td>
			<td >220905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Decapitation Scissors</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dissecting Scissors</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethyl Alcohol</td>
			<td >Pharmco</td>
			<td >111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glass Slide (for electrophoresis)</td>
			<td >BIORAD</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Homogenizer</td>
			<td >Kimble</td>
			<td >6HAZ6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ice Bucket</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Insulin Syringe (.5ml)</td>
			<td >BD</td>
			<td >329461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >iScript Adv cDNA kit for RT-qPCR</td>
			<td >BIORAD</td>
			<td >1725037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micro Spatula</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Needle Nose forceps</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Petri Dish</td>
			<td >Pyrex</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Primetime Primer for Aldolase C</td>
			<td >IDT</td>
			<td >Mm.PT.58&#62;43415246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Primetime Primer for Kcng4</td>
			<td >IDT</td>
			<td >Mm.PT.56a.9448518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Primetime Primer for Parvalbumin</td>
			<td >IDT</td>
			<td >Mm.PT.58.7596729</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Primetime Primer Rps18&#160;</td>
			<td >IDT</td>
			<td >Mm.PT.58.12109666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Single Edge Rzor Blades</td>
			<td >Personna GEM</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterile, sigle-use pestles</td>
			<td >FisherScientific</td>
			<td >12141364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TRIzol Reagent</td>
			<td >Ambion by Life technologies</td>
			<td >15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vascular Scissors</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cerebellar regional dissection for molecular analysis

Cerebellum ממלא תפקיד חשוב במספר פונקציות מפתח כולל שליטה בתנועה, איזון, קוגניציה, תגמול, השפעה. מחקרי הדמיה מצביעים על כך שאזורים מוחיים נפרדים תורמים לפונקציות שונות אלה. מחקרים מולקולריים הבוחנים הבדלים במוח הקטן האזורי מפגרים כפי שהם נעשים בעיקר על תמציות מוחין שלמות ובכך להסוות כל הבחנות על פני אזורים מוחיים ספציפיים. כאן אנו מתארים טכניקה לשחזור ובמהירות של ארבעה אזורי מוח הקטן שונים: גרעיני המוח הקטן העמוקים (DCN), קליפת המוח המוח הקדמית והאחורית, קליפת המוח המוח הקטן של חצי הכדור. ניתוח אזורים נפרדים אלה מאפשר לחקור מנגנונים מולקולריים שעשויים לעמוד בבסיס תרומתם הייחודית לאיזון, תנועה, השפעה וקוגניציה. טכניקה זו עשויה לשמש גם כדי לחקור הבדלים ברגישות הפתולוגית של אזורים ספציפיים אלה על פני מודלים שונים של מחלות עכבר.

בניסויים אלה נעשה שימוש בארבעה עכברי בר מסוג נקבה בני 11 שבועות מסוג C57/Black6. עכבר אחד שימש לעריכת ניתוח מוחי מלא המכונה "המוח הקטן בתפזורת" ומאפשר השוואה של רמות RNA באזורים ניתחו לביתור מלא. שלושת העכברים האחרים שימשו לעריכת ניתוח המוח הקטן המתואר בפרוטוקול זה. שימוש בשלושה ...

Watch this Scientific Journal Video about Cerebellar Regional Dissection for Molecular Analysis at JoVE.com

Cerebellar Regional Dissection for Molecular Analysis

אזורים מוחיים שונים כבר מעורבים לשחק תפקיד תפוקות התנהגותיות ברורות, עדיין המנגנונים המולקולריים הבסיסיים עדיין לא ידוע. עבודה זו מתארת שיטה להתרבות במהירות ולנתח קליפת המוח המוח הקטן של חצי הכדור, האזורים הקדמיים והאחוריים של ורמיס, ואת גרעיני המוח הקטן העמוקים על מנת לחקור הבדלים מולקולריים על ידי בידוד RNA ובדיקת הבדלים בביטוי הגנים.

ניתוח אזורי של Cerebellar לניתוח מולקולרי

Cerebellum plays an important role in several key functions including control of movement, balance, cognition, reward, and affect. Imaging studies ...

Traditional molecular studies of the cerebellum have been done on whole cerebellar extracts, which may mask any distinctions across specific cerebellar regions. This protocol makes it possible to assess distinct regions of the cerebellum separately and allows for the exploration of molecular mechanisms that may underlie their unique contributions to a variety behaviors and disease progression. The main advantage of this technique is that it allows for the reproducible and quick dissection of four cerebellar regions, the deep cerebellar nuclei, the anterior and posterior cerebellar cortex of the Vermis and the cerebellar cortex of the hemispheres.After decapitating the euthanized mouse, make an incision with a razor blade along the medial sagittal line of the head, starting at the nose and continuing all the way back. Separate the skin and use the razor blade to cut away the muscle on each side, cutting down past the ear canals. Using dissecting scissors, trim many spinal cord regions up to where the brain stem meets the cerebellum, taking care to not damage the cerebellum.Insert one of the vascular scissor blades into the space between the brainstem and vertebral column and cut toward the ear canal, lifting upward while cutting to limit damage to the tissue. Continue to cut along the edge of the skull up toward the olfactory bulbs. Using the blunt forceps, gently peel off the back of this skull to uncover the posterior region of the brain and cerebellum.Position the blunt forceps along the cut edge of the skull and peel the skull up and over the brain. Trim the rest of the skull with the vascular scissors and blunt forceps, clearing most of it from the top of the brain. Slightly lift the brain with the micro spatula to remove the olfactory bulbs from the remaining skull and disconnect optic tract fibers.The brain should come free easily at this point. Place the brain into the Petri dish, sitting on ice and remove any remaining skull or other debris. Gently place the brain into the brain matrix with the dorsal side up.Make sure that it is set level in the matrix and that the midline is in the center. Place one razor blade along the sagittal midline, making sure that the blade pushes all the way to the bottom of the matrix. Place another razor blade one millimeter to the side of the first blade.Place two more blades resulting in three blades placed on one side of the brain, all one millimeter apart. Repeat this on the other side. carefully grab the front and back end to the razorblades, and lift them straight up out of the matrix.Discard the tissue on the outside of the razor blades. Slowly, separate one razor blade at a time from the others being careful not to damage the tissue sections. Slide the tissue section off the razor blade and onto the glass slide with the micro spatula.Six sagittal brain sections should be collected. The foremost lateral sections will have DCN visible. To isolate the DCN, hold a trim to 200 microliter pipette tip perpendicularly over the DCN and push down through the tissue firmly rocking in all directions.Lift the pipette up and visually confirm the presence of the tissue in the tip. Place one finger at the top of the tip and push down, causing the tissue to bulge out. Insert the tip into a correctly labeled microfiche tube and ensure that the tissue punch is placed in the bottom of the tube.Repeat this for the remaining three sections, placing the DCN punches in the same tube. Flash freeze the tube in liquid nitrogen. Push away the rest of the brain tissue around the cerebellum in the sections where the DCN was extracted.Use blunt forceps to gently pick up these hemisphere cerebellar cortex sections and place them into respective microfiche tubes, then flash freeze them. For the last two vermal sections, push away surrounding brain tissue to leave only the cerebellum. Using a razor blade, make a cut separating the anterior labials from the posterior labials.Ensure that the cut is just after the formation of labial six and does not include labial 10. Using blunt forceps, carefully placed the anterior cerebellar cortex sections and posterior cerebellar cortex sections into their respective microfiche tubes and flash freeze them by leaving the tubes in liquid nitrogen for five minutes. Place the microfiche tubes on ice to keep the tissue from thawing too quickly and apply 150 microliters of cold RNA isolation solution in the microfiche tube, then homogenize with a sterilized pestle.Once the tissue is homogenized pipette the solution up and down to ensure there is no remaining intact tissue. Further, break up any small tissue pieces by pulling it up into an insulin syringe a few times. Add another 350 microliters of the reagent, pipette up and down to mix thoroughly and let it sit at room temperature for five minutes.Add 150 microliters of chloroform to the tube and shake it vigorously, then let it rest for two to three minutes. Centrifuge at 12, 000 times G at 15 degrees Celsius for 10 minutes. Carefully remove the tubes from the centrifuge and set the temperature of the centrifuge to four degrees Celsius.Transfer only the clear aqueous phase into a new tube, taking care not to disrupt the opaque interphase. Save or discard the remaining solution in the tubes. Add 100%isopropyl alcohol at a one to two ratio and mix thoroughly by pipetting up and down.Let the sample rest at room temperature for 10 minutes to precipitate the RNA out of the solution. Centrifuge at 12, 000 times G and four degrees Celsius for 10 minutes, placing all tubes in the same orientation to make it easier to visualize the pellet. After centrifugation, carefully remove the tubes and remove the supernatant with the pipette, making sure to not disrupt the pellet.The pellet is gel like and difficult to see, so estimate where it is based on the orientation of the tubes in the centrifuge. After removing all supernatant, add 500 microliters of 75%ethanol, vortex briefly and centrifuge at 7, 500 times G and four degrees Celsius for five minutes. Remove the supernatant carefully, without disrupting the pellet.Leave the caps open to dry the sample for five to 10 minutes. Once dry resuspend the pellet in DNA's free water at 20 microliters to the samples for DCN and 30 microliters for all others. Store the samples at minus 80 degrees Celsius until further analysis.This protocol was used to dissect four distinct regions of the mouse cerebellum and to explore regional differences in gene expression. The expression levels of Aldolase C, parvalbumin and KCNG4 were assessed using real-time quantitative PCR. Aldolase C is more highly expressed in the posterior cerebellar vermis.But lower in the DCN and the anterior region of the vermis when compared to the bulk cerebellar dissection. Parvalbumin is similarly present in the DCN anterior vermis, posterior vermis and hemisphere cerebellar cortices, when compared to bulk cerebellar extracts. KCNG4 is significantly enriched in the DCN and the interior vermis, but not in the posterior vermis or hemispheres when compared to the bulk extraction.To directly compare the expression of aldolase C across the cerebellar cortex, the expression levels were compared to the anterior vermis. The expression level of aldolase C was significantly higher in the posterior Vermis and trending higher in the cerebellar hemispheres. The RNA extracted from these regions can also be used in RNA sequencing, experiments.RNA seq comparing these for cerebellar regions would provide more detailed information on molecular mechanisms, underlying discrete functions of these regions. As well as potential differences in their vulnerability in disease.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Simple Composite Phenotype Scoring System for Evaluating Mouse Models of Cerebellar Ataxia

ניקוד פשוט Composite הפנוטיפ מערכת להערכת מודלים של עכבר אטקסיה cerebellar

We describe a protocol for the rapid and sensitive quantification of disease severity in mouse models of cerebella ataxia. It is derived from previously ...

Organotypic Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

תרבויות cerebellar Organotypic: אתגרים אפופטוטיים וזיהוי

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. ...

Single Drosophila Ommatidium Dissection and Imaging

Single Drosophila Ommatidium Dissection and Imaging

אחד תסיסנית אומטידיום Dissection והדמיה

The fruit fly Drosophila melanogaster has made invaluable contributions to neuroscience research and has been used widely as a model for neurodegenerative ...

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

ניתוח כמותי של רענון שלפוחיות Synaptic בריכת ב Cultured נוירונים גרגיר cerebellar באמצעות צבעים FM

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

להדמיה מניפולציה גנטית של דנדריטים עם קוצים בקליפת עכבר היפוקמפוס מוחין באמצעות<em&gt; ברחם</em&gt; Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

Dissection, תרבות וניתוח של<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; רקמת רשתית עוברית

The process by which  the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina  continues to be a major focus of both clinical and ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

מניפולציה גנטית של Cerebellar גרגיר נוירונים<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; בVivo</em&gt; ללמוד עצבי מורפולוגיה וגירה

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

ניתוח של השריר Transversus Abdominis לניתוח צומת נוירומוסקולרי הר שלם

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Nanosurgery הלייזר של האקסונים Cerebellar<em&gt; בVivo</em

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

צעד-אחד פשוט פרוטוקול לנתיחה עבור כל הר הכנה למבוגרים<em&gt; תסיסנית</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...