Name: cerebellar regional dissection for molecular analysis
Uploaded: 2020-12-05T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cerebellar Regional Dissection for Molecular Analysis at JoVE.com

Cvetanovic laboratuvarındaki Austin Ferro ve Juao-Guilherme Rosa'ya, diseksiyonların giderilmesinde ve RNA ekstraksiyonu ve RTqPCR'de yardımları için minnettarız. Bu araştırma M. Cvetanovic, R01 NS197387 tarafından finanse edilir; HHS | Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH).

1. Kurulum
<ol><li>Kafa kesme makası, künt forseps, diseksiyon makası, vasküler makas, mikrospatula, sagittal fare beyin matrisi, jilet, 200 μL pipet ucu, cam petri kabı, cam kaydırak ve buz kovası dahil olmak üzere gerekli ekipmanları toplayın. Tüm ekipmanları emici bir ped üzerine yer edin.</li>
	<li>Petri kabı, cam tabak ve beyin matrisini buza yerleştirin.</li>
	<li>Dik bir açıda jilet kullanarak, bir 200 μL pipet ucunun ucundan yaklaşık 5 mm kesin. Bu, ucun ucundaki açıklı?...

<ol>
	<li>Herculano-Houzel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glia/neuron+ratio:+How+it+varies+uniformly+across+brain+structures+and+species+and+what+that+means+for+brain+physiology+and+evolution.">The glia/neuron ratio: How it varies uniformly across brain structures and species and what that means for brain physiology and evolution.</a> Glia. 62 (9), 1377-1391 (2014).</li><li>Schmahmann, J. D., Caplan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cognition,+enotion,+and+the+cerebellum.">Cognition, enotion, and the cerebellum.</a> Brain. 129 (2), 290-292 (2006).</li><li>Badura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+cognitive+and+social+development+require+posterior+cerebellar+activity.">Normal cognitive and social development require posterior cerebellar activity.</a> eLife. 7, 36401 (2018).</li><li>Diedrichsen, J., King, M., Hernandez-Castillo, C., Sereno, M., Ivry, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+Transform+or+Multiple+Functionality?+Understanding+the+Contribution+of+the+Human+Cerebellum+across+Task+Domains.">Universal Transform or Multiple Functionality? Understanding the Contribution of the Human Cerebellum across Task Domains.</a> Neuron. 102 (5), 918-928 (2019).</li><li>Strick, P. L., Dum, R. P., Fiez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellum+and+Nonmotor+Function.">Cerebellum and Nonmotor Function.</a> Annual Review of Neuroscience. 32 (1), 413-434 (2009).</li><li>King, M., Hernandez-castillo, C. R., Poldrack, R. A., Ivry, R. B., Diedrichsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+boundaries+in+the+human+cerebellum+revealed+by+a+multi-domain+task+battery.">Functional boundaries in the human cerebellum revealed by a multi-domain task battery.</a> Nature Neuroscience. 22, 1371-1378 (2019).</li><li>Buckner, R. L., Krienen, F. M., Castellanos, A., Diaz, J. C., Yeo, B. T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+organization+of+the+human+cerebellum+estimated+by+intrinsic+functional+connectivity.">The organization of the human cerebellum estimated by intrinsic functional connectivity.</a> Journal of neurophysiology. 106 (5), 2322-2345 (2011).</li><li>Schmahmann, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+movement+to+thought:+Anatomic+substrates+of+the+cerebellar+contribution+to+cognitive+processing.">From movement to thought: Anatomic substrates of the cerebellar contribution to cognitive processing.</a> Human Brain Mapping. 4 (3), 174-198 (1996).</li><li>Kelly, R. M., Strick, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+Loops+with+Motor+Cortex+and+Prefrontal+Cortex+of+a+Nonhuman+Primate.">Cerebellar Loops with Motor Cortex and Prefrontal Cortex of a Nonhuman Primate.</a> The Journal of Neuroscience. 23 (23), 8432-8444 (2003).</li><li>Stoodley, C. J., Macmore, J. P., Makris, N., Sherman, J. C., Schmahmann, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+Location+of+lesion+determines+motor+vs.+cognitive+consequences+in+patients+with+cerebellar+stroke.">Clinical Location of lesion determines motor vs. cognitive consequences in patients with cerebellar stroke.</a> NeuroImage: Clinical. 12, 765-775 (2016).</li><li>Guo, C. C., Tan, R., Hodges, J. R., Hu, X., Sami, S., Hornberger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Network-selective+vulnerability+of+the+human+cerebellum+to+Alzheimer's+disease+and+frontotemporal+dementia.">Network-selective vulnerability of the human cerebellum to Alzheimer's disease and frontotemporal dementia.</a> Brain. 139 (5), (2016).</li><li>Bocchetta, M., Cardoso, M. J., Cash, D. M., Ourselin, S., Warren, J. D., Rohrer, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+regional+cerebellar+atrophy+in+genetic+frontotemporal+dementia.">Patterns of regional cerebellar atrophy in genetic frontotemporal dementia.</a> NeuroImage: Clinical. 11, 287-290 (2016).</li><li>Sillitoe, R. V., Fu, Y., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellum.">Cerebellum.</a> The Mouse Nervous System. , 360-397 (2012).</li><li>Nguyen-Minh, V. T., Tran-Anh, K., Luo, Y., Sugihara, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+Excitability+and+Parallel+Fiber+Synaptic+Properties+of+Zebrin-Positive+and+-Negative+Purkinje+Cells+in+Lobule+VIII+of+the+Mouse+Cerebellar+Slice.">Electrophysiological Excitability and Parallel Fiber Synaptic Properties of Zebrin-Positive and -Negative Purkinje Cells in Lobule VIII of the Mouse Cerebellar Slice.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 513 (2019).</li><li>Manto, M., Oulad Ben Taib, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+nuclei:+Key+Roles+for+Strategically+Located+Structures.">Cerebellar nuclei: Key Roles for Strategically Located Structures.</a> The Cerebellum. 9 (1), 17-21 (2010).</li><li>Driessen, T. M., Lee, P. J., Lim, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathway+analysis+towards+understanding+tissue+vulnerability+in+spinocerebellar+ataxia+type+1.">Molecular pathway analysis towards understanding tissue vulnerability in spinocerebellar ataxia type 1.</a> eLife. , (2018).</li><li>Grabert, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+brain+region+-+dependent+diversity+and+selective+regional+sensitivities+to+aging.">Microglial brain region - dependent diversity and selective regional sensitivities to aging.</a> Nat Neurosci. 19 (3), 504 (2016).</li><li>Ingram, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+Transcriptome+Profiles+of+ATXN1+Transgenic+Mice+Reveal+SCA1+Disease+Progression+and+Protection+Pathways.">Cerebellar Transcriptome Profiles of ATXN1 Transgenic Mice Reveal SCA1 Disease Progression and Protection Pathways.</a> Neuron. 89 (6), 1194-1207 (2016).</li><li>Cendelin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> From mice to men : lessons from mutant ataxic mice. , 1-21 (2014).</li><li>Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+RNA+Using+TRIzol+(TRI+Reagent).">Purification of RNA Using TRIzol (TRI Reagent).</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (6), (2010).</li><li>Kim, J. H., Lukowicz, A., Qu, W., Johnson, A., Cvetanovic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astroglia+contribute+to+the+pathogenesis+of+spinocerebellar+ataxia+Type+1+(SCA1)+in+a+biphasic,+stage-of-disease+specific+manner.">Astroglia contribute to the pathogenesis of spinocerebellar ataxia Type 1 (SCA1) in a biphasic, stage-of-disease specific manner.</a> Glia. 66 (9), 1972-1987 (2018).</li><li>Chopra, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+Capicua+expression+drives+regional+Purkinje+neuron+vulnerability+through+ion+channel+gene+dysregulation+in+spinocerebellar+ataxia+type+1.">Altered Capicua expression drives regional Purkinje neuron vulnerability through ion channel gene dysregulation in spinocerebellar ataxia type 1.</a> Human Molecular Genetics. , (2020).</li></ol>

Burada açıklanan yöntem, dört ayrı serebellar bölgede altta kalan gen ekspresyonunu ve moleküler mekanizmaların değerlendirilmesini mümkün kılar - derin serebellar çekirdek (DCN), vermisin ön serebellar korteksi (CCaV), vermisin arka serebellar korteksi (CCpV) ve yarımkürelerin serebellar korteksi (CCH). Bu bölgeleri ayrı ayrı değerlendirme yeteneği, belirli serebellar bölgelerin heterojenliği hakkındaki bilgimizi genişletecek ve muhtemelen çeşitli davranışlara katkılarına ışık tutacakt?...

Beyincik beyindeki nöronların yarısından fazlasını içerir ve tarihsel olarak beyinde motor kontrol ve denge merkezi olarak adlandırılır1. Daha yakın zamanlarda, çalışmalar serebellumun biliş, ödül işleme dahil olmak üzere diğer çeşitli işlevlerde kilit bir rol oynadığını ve 2 , 3,4,5'i etkilediğinigöstermiştir.
Beyincik iyi tanımlanmış anatomiye sahiptir: korteks bölgesi granül, Purkinje ve moleküler katmanlardan oluşur. Granül hücreler granül hücre tabakasını oluşturur ve paralel lifler aracılığıyla moleküler tabakanın Purkinje hücre dendritlerine giriş gönderir ve bu da alt zeytinden kaynaklanan tırmanma liflerinden giriş alır. Purkinje hücreleri, beyincikten ana çıktı görevi gören derin serebellar çekirdekteki (DCN) hücrelere inhibitör projeksiyonlar gönderir. Bu serebellar devrenin çıkışı, Golgi, stellat ve sepet hücreleri de dahil olmak üzere serebellar korteksteki inhibitör internöronların aktivitesi ile daha da modüle edilir4. Bu serebellar fonksiyonel ünite serebellar korteksin tüm lobüllerine dağılmıştır. Beyincik boyunca bu nispeten düzgün devreye rağmen, insan nörogörüntüleme literatüründen ve hasta çalışmalarından elde edilen kanıtlar beyincik6,7'ninfonksiyonel heterojenliğini göstermektedir.
Serebellar korteks iki ana bölgeye ayrılabilir: orta çizgi tanımlı vermis ve lateral yarımküreler. Vermis daha da ön ve arka lobüllere ayrılabilir. Beyinciklerin bu farklı bölgeleri farklı davranışlara katkıda bulunmakla suçlanmıştır. Görev çağrışan veya görevsiz aktivite kalıpları, vermis'in ön bölgelerinin motor fonksiyona daha fazla katkıda bulunduğunu, posterior vermis'in ise biliş6,7'yedaha fazla katkıda bulunduğunu ortaya çıkardı. Vermis ayrıca etki ve duygularla bağlantılıdır, serebellar yarımküreler yürütme, görsel-mekansal, dil ve diğer anımsatıcı işlevlere katkıda bulunur8. Ek olarak, anatomik çalışmalar fonksiyonel olarak farklı serebellar bölgelerin farklı kortikal bölgelerle bağlantılı olduğuna dair kanıtlar sağlamıştır9. Lezyon semptom haritalaması, ön lobları etkileyen inmeleri olan hastaların (lob VI'ya kadar uzanan) ince motor görevlerde daha düşük performansa sahip olduğunu, arka lob bölgelerinde ve yarımkürelerde hasarı olan hastaların serebellar motor sendromunun yokluğunda bilişsel eksiklikler sergilediğini ortaya koydu10. Son olarak, hastalıkta bölgesel serebellar patoloji, fonksiyonel olarak farklı serebellar bölgelerin de hastalığa farklı şekilde duyarlı olduğunu gösterir11,12.
Çok daha az araştırılsa da, ön kanıtlar serebellar kortikal bölgelerde belirgin gen ekspresyon imzaları göstermektedir. Zebrin II'nin Purkinje hücre ifadesi, vermiste bölgeye özgü desenleme gösterir, böylece arka lobüllerde daha fazla Zebrin II pozitif hücre ve ön lobüllerde dahaazdır 13. Bu aynı zamanda Zebrin II negatif Purkinje hücreleri Zebrin II pozitif14olan Purkinje hücrelerinden daha yüksek tonik ateşleme sıklığı gösterdiğinden bölgesel olarak farklı fizyolojik işlevle de ilişkilidir.
Serebellar kortekse ek olarak, serebellum, beyincik için birincil çıktı görevi gören derin serebellar çekirdeği (DCN) içerir. Çekirdekler medial (MN), interposed (IN) ve lateral çekirdeklerden (LN) oluşur. Fonksiyonel görüntüleme ve hasta çalışmaları, DCN'nin çeşitli davranışlara da katıldığını göstermiştir15, ancak çok az çalışma DCN'deki gen ekspresyon değişimini inceler.
Moleküler tekniklerdeki gelişmeler beyindeki bölgesel gen ekspresyonun değerlendirilmesini mümkün kıldı ve hem fizyolojik hem de hastalık durumlarında farklı beyin bölgelerinde ve içinde heterojenliği ortaya çıkardı16. Bu tür çalışmalar, beyinciğerinin diğer beyin bölgelerinden farklı olduğunu ima eder. Örneğin, nöronların glial hücrelere oranı beyincikte diğer beyin bölgelerine göre ters çevrilmiş1. Normal fizyolojik koşullarda bile, proinflamatuar genlerin ekspresyonu beyincikte diğer beyin bölgelerine göre artmaktadır17. Moleküler teknikler, serebellar hastalıkların patogenezine katkıda bulunan yolların tanımlanmasında da çok yararlı olmuştur. Örneğin, tüm serebellar özlerin RNA dizilimi, vahşi tip kontrollerine kıyasla spinocerebellar ataksi tip 1'in (SCA1) Purkinje hücresine özgü transgenik fare modelinde değiştirilen genleri tanımladı. Bu tür kanıtlar, serebellar Purkinje hücrelerinde patogenezin altında kalan temel moleküler yolları ortaya çıkarmıştır ve potansiyel terapötik hedeflerin belirlenmesine yardımcı olmuştur18. Bununla birlikte, son çalışmalar serebellar bölgelerde hastalıklara karşı savunmasızlıkta farklılıklar olduğunu göstermektedir11,12,19. Bu, tüm serebellar özlerle maskelenmiş veya tespit edilmemiş olabilecek farklı serebellar bölgelerde meydana gelen önemli değişiklikler olduğunu gösterebilir. Bu nedenle, araştırmacıların farklı serebellar bölgelerdeki moleküler profilleri incelemelerini sağlayan teknikler geliştirmeye ihtiyaç vardır.
Burada önerilen teknik, RNA'yı bu bölgelerden izole etmek ve gen ifadesindeki bölgesel farklılıkları araştırmak için fare beyinciğinin dört farklı bölgesini parçalamak için tekrarlanabilir bir yöntemi açıklar. Şekil 1A'daki fare beyinciliğinin şeması, vermis'i mavi ve yarımküreleri sarı renkle vurgular. Özellikle, Bu teknik dört bölgenin izole olmasını mümkün kılar: derin serebellar çekirdek (DCN) (Şekil 1A'dakikırmızı noktalı kutular), ön vermis (CCaV) serebellar korteksi (koyu mavi inç) Şekil 1A), arka vermis (CCpV) serebellar korteksi (Şekil 1A'daaçık mavi) ve yarımkürelerin serebeller korteksi (CCH) (Şekil 1A'dasarı). Bu bölgelerin gen ekspresyonunun ayrı ayrı değerlendirilmesi ile bu farklı bölgelerin ayrık fonksiyonlarının altında kalan moleküler mekanizmaların yanı sıra hastalıktaki kırılganlıklarındaki potansiyel farklılıkların araştırılması mümkün olacaktır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >1.5 Microcentrifuge tubes</td>
			<td >ThermoScietific</td>
			<td >3456</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >100% Isopropyl Alcohol</td>
			<td >VWR Life sciences</td>
			<td >1106C361</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >200 ul Pipet tips</td>
			<td >GeneMate</td>
			<td >P-1237-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Adult Mouse Brain Matrix Sagittal</td>
			<td >Kent Scientific Corporation</td>
			<td >RBMA-200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Blunt forceps</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Chloroform</td>
			<td >Macron</td>
			<td >220905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Decapitation Scissors</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dissecting Scissors</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethyl Alcohol</td>
			<td >Pharmco</td>
			<td >111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glass Slide (for electrophoresis)</td>
			<td >BIORAD</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Homogenizer</td>
			<td >Kimble</td>
			<td >6HAZ6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ice Bucket</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Insulin Syringe (.5ml)</td>
			<td >BD</td>
			<td >329461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >iScript Adv cDNA kit for RT-qPCR</td>
			<td >BIORAD</td>
			<td >1725037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micro Spatula</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Needle Nose forceps</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Petri Dish</td>
			<td >Pyrex</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Primetime Primer for Aldolase C</td>
			<td >IDT</td>
			<td >Mm.PT.58&#62;43415246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Primetime Primer for Kcng4</td>
			<td >IDT</td>
			<td >Mm.PT.56a.9448518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Primetime Primer for Parvalbumin</td>
			<td >IDT</td>
			<td >Mm.PT.58.7596729</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Primetime Primer Rps18&#160;</td>
			<td >IDT</td>
			<td >Mm.PT.58.12109666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Single Edge Rzor Blades</td>
			<td >Personna GEM</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterile, sigle-use pestles</td>
			<td >FisherScientific</td>
			<td >12141364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TRIzol Reagent</td>
			<td >Ambion by Life technologies</td>
			<td >15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vascular Scissors</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cerebellar regional dissection for molecular analysis

Serebellum, hareket kontrolü, denge, biliş, ödül ve etki dahil olmak üzere çeşitli temel işlevlerde önemli bir rol oynar. Görüntüleme çalışmaları farklı serebellar bölgelerin bu farklı fonksiyonlara katkıda bulunduğunu göstermektedir. Bölgesel serebellar farklılıkları inceleyen moleküler çalışmalar, çoğunlukla serebellar özlerin tamamında yapıldığı için geride kalmaktadır ve böylece belirli serebellar bölgelerdeki ayrımları maskelemektedir. Burada dört farklı serebellar bölgeyi tekrar ve hızlı bir şekilde parçalama tekniğini açıklıyoruz: derin serebellar çekirdek (DCN), ön ve arka vermal serebellar korteks ve yarımkürelerin serebellar korteksi. Bu farklı bölgelerin diseksiyonunun, denge, hareket, etki ve bilişe benzersiz katkılarının altında yatan moleküler mekanizmaların araştırılmasına izin verir. Bu teknik, çeşitli fare hastalığı modellerinde bu belirli bölgelerin patolojik duyarlılığındaki farklılıkları araştırmak için de kullanılabilir.

Bu deneyler için dört on bir haftalık dişi vahşi tip C57/Black6 fare kullanıldı. Bir fare, 'dökme beyincik' olarak adlandırılan ve kesilen bölgelerdeki RNA seviyelerinin tam bir diseksiyonla karşılaştırılmasına izin verilen tam bir serebellar diseksiyon yapmak için kullanıldı. Diğer üç fare, bu protokolde açıklanan serebellar diseksiyonu yapmak için kullanılmıştır. Üç fare kullanmak, RNA seviyelerinde tespit edilen eğilimlerin fareler arasında tekrarlanab...

Watch this Scientific Journal Video about Cerebellar Regional Dissection for Molecular Analysis at JoVE.com

Cerebellar Regional Dissection for Molecular Analysis

Farklı serebellar bölgelerin farklı davranışsal çıktılarda rol oynadığı belirtilmiştir, ancak alttaki moleküler mekanizmalar bilinmemektedir. Bu çalışma, RNA'yı izole ederek ve gen ifadesindeki farklılıkları test ederek moleküler farklılıkları araştırmak için yarımkürelerin serebellar korteksini, vermisin ön ve arka bölgelerini ve derin serebellar çekirdekleri tekrar ve hızlı bir şekilde parçalama yöntemini açıklar.

Moleküler Analiz için Serebellar Bölgesel Diseksiyon

Cerebellum plays an important role in several key functions including control of movement, balance, cognition, reward, and affect. Imaging studies ...

Traditional molecular studies of the cerebellum have been done on whole cerebellar extracts, which may mask any distinctions across specific cerebellar regions. This protocol makes it possible to assess distinct regions of the cerebellum separately and allows for the exploration of molecular mechanisms that may underlie their unique contributions to a variety behaviors and disease progression. The main advantage of this technique is that it allows for the reproducible and quick dissection of four cerebellar regions, the deep cerebellar nuclei, the anterior and posterior cerebellar cortex of the Vermis and the cerebellar cortex of the hemispheres.After decapitating the euthanized mouse, make an incision with a razor blade along the medial sagittal line of the head, starting at the nose and continuing all the way back. Separate the skin and use the razor blade to cut away the muscle on each side, cutting down past the ear canals. Using dissecting scissors, trim many spinal cord regions up to where the brain stem meets the cerebellum, taking care to not damage the cerebellum.Insert one of the vascular scissor blades into the space between the brainstem and vertebral column and cut toward the ear canal, lifting upward while cutting to limit damage to the tissue. Continue to cut along the edge of the skull up toward the olfactory bulbs. Using the blunt forceps, gently peel off the back of this skull to uncover the posterior region of the brain and cerebellum.Position the blunt forceps along the cut edge of the skull and peel the skull up and over the brain. Trim the rest of the skull with the vascular scissors and blunt forceps, clearing most of it from the top of the brain. Slightly lift the brain with the micro spatula to remove the olfactory bulbs from the remaining skull and disconnect optic tract fibers.The brain should come free easily at this point. Place the brain into the Petri dish, sitting on ice and remove any remaining skull or other debris. Gently place the brain into the brain matrix with the dorsal side up.Make sure that it is set level in the matrix and that the midline is in the center. Place one razor blade along the sagittal midline, making sure that the blade pushes all the way to the bottom of the matrix. Place another razor blade one millimeter to the side of the first blade.Place two more blades resulting in three blades placed on one side of the brain, all one millimeter apart. Repeat this on the other side. carefully grab the front and back end to the razorblades, and lift them straight up out of the matrix.Discard the tissue on the outside of the razor blades. Slowly, separate one razor blade at a time from the others being careful not to damage the tissue sections. Slide the tissue section off the razor blade and onto the glass slide with the micro spatula.Six sagittal brain sections should be collected. The foremost lateral sections will have DCN visible. To isolate the DCN, hold a trim to 200 microliter pipette tip perpendicularly over the DCN and push down through the tissue firmly rocking in all directions.Lift the pipette up and visually confirm the presence of the tissue in the tip. Place one finger at the top of the tip and push down, causing the tissue to bulge out. Insert the tip into a correctly labeled microfiche tube and ensure that the tissue punch is placed in the bottom of the tube.Repeat this for the remaining three sections, placing the DCN punches in the same tube. Flash freeze the tube in liquid nitrogen. Push away the rest of the brain tissue around the cerebellum in the sections where the DCN was extracted.Use blunt forceps to gently pick up these hemisphere cerebellar cortex sections and place them into respective microfiche tubes, then flash freeze them. For the last two vermal sections, push away surrounding brain tissue to leave only the cerebellum. Using a razor blade, make a cut separating the anterior labials from the posterior labials.Ensure that the cut is just after the formation of labial six and does not include labial 10. Using blunt forceps, carefully placed the anterior cerebellar cortex sections and posterior cerebellar cortex sections into their respective microfiche tubes and flash freeze them by leaving the tubes in liquid nitrogen for five minutes. Place the microfiche tubes on ice to keep the tissue from thawing too quickly and apply 150 microliters of cold RNA isolation solution in the microfiche tube, then homogenize with a sterilized pestle.Once the tissue is homogenized pipette the solution up and down to ensure there is no remaining intact tissue. Further, break up any small tissue pieces by pulling it up into an insulin syringe a few times. Add another 350 microliters of the reagent, pipette up and down to mix thoroughly and let it sit at room temperature for five minutes.Add 150 microliters of chloroform to the tube and shake it vigorously, then let it rest for two to three minutes. Centrifuge at 12, 000 times G at 15 degrees Celsius for 10 minutes. Carefully remove the tubes from the centrifuge and set the temperature of the centrifuge to four degrees Celsius.Transfer only the clear aqueous phase into a new tube, taking care not to disrupt the opaque interphase. Save or discard the remaining solution in the tubes. Add 100%isopropyl alcohol at a one to two ratio and mix thoroughly by pipetting up and down.Let the sample rest at room temperature for 10 minutes to precipitate the RNA out of the solution. Centrifuge at 12, 000 times G and four degrees Celsius for 10 minutes, placing all tubes in the same orientation to make it easier to visualize the pellet. After centrifugation, carefully remove the tubes and remove the supernatant with the pipette, making sure to not disrupt the pellet.The pellet is gel like and difficult to see, so estimate where it is based on the orientation of the tubes in the centrifuge. After removing all supernatant, add 500 microliters of 75%ethanol, vortex briefly and centrifuge at 7, 500 times G and four degrees Celsius for five minutes. Remove the supernatant carefully, without disrupting the pellet.Leave the caps open to dry the sample for five to 10 minutes. Once dry resuspend the pellet in DNA's free water at 20 microliters to the samples for DCN and 30 microliters for all others. Store the samples at minus 80 degrees Celsius until further analysis.This protocol was used to dissect four distinct regions of the mouse cerebellum and to explore regional differences in gene expression. The expression levels of Aldolase C, parvalbumin and KCNG4 were assessed using real-time quantitative PCR. Aldolase C is more highly expressed in the posterior cerebellar vermis.But lower in the DCN and the anterior region of the vermis when compared to the bulk cerebellar dissection. Parvalbumin is similarly present in the DCN anterior vermis, posterior vermis and hemisphere cerebellar cortices, when compared to bulk cerebellar extracts. KCNG4 is significantly enriched in the DCN and the interior vermis, but not in the posterior vermis or hemispheres when compared to the bulk extraction.To directly compare the expression of aldolase C across the cerebellar cortex, the expression levels were compared to the anterior vermis. The expression level of aldolase C was significantly higher in the posterior Vermis and trending higher in the cerebellar hemispheres. The RNA extracted from these regions can also be used in RNA sequencing, experiments.RNA seq comparing these for cerebellar regions would provide more detailed information on molecular mechanisms, underlying discrete functions of these regions. As well as potential differences in their vulnerability in disease.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Simple Composite Phenotype Scoring System for Evaluating Mouse Models of Cerebellar Ataxia

Serebellar Ataksi Fare Modelleri Değerlendirme Basit Kompozit Fenotip Puanlama Sistemi

We describe a protocol for the rapid and sensitive quantification of disease severity in mouse models of cerebella ataxia. It is derived from previously ...

Nörobilim

Organotypic Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

Organotipik Serebellar Kültürler: Apoptotik Zorluklar ve Tayin

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. ...

Single Drosophila Ommatidium Dissection and Imaging

Single Drosophila Ommatidium Dissection and Imaging

Tek Drosophila Ommatidium Diseksiyon ve Görüntüleme

The fruit fly Drosophila melanogaster has made invaluable contributions to neuroscience research and has been used widely as a model for neurodegenerative ...

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

FM Boyalar Kültür Serebellar Granül Nöronlar Synaptic veziküllü Havuzu Yenileme Kantitatif Analiz

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Kullanarak Fare Serebral Korteks ve Hippocampus Görselleştirme ve Dendritler ve Spine Genetik Manipülasyon<em&gt; Utero olarak</em&gt; Elektroporasyon

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

Diseksiyon, Kültür ve Analizi<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embriyonik Retina Doku

The process by which  the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina  continues to be a major focus of both clinical and ...

A Dual Tracer PET-MRI Protocol for the Quantitative Measure of Regional Brain Energy Substrates Uptake in the Rat

Rat Bölgesel Beyin Enerji Yüzeyleri Alımına Kantitatif Tedbir için A Çift Tracer PET-MR Protokolü

We present a method for comparing the uptake of the brain&#39;s two key energy substrates: glucose and ketones (acetoacetate [AcAc] in this case) in the ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Serebellar Granül Nöronlar Genetik Manipülasyon<em&gt; In Vitro</em&gt; Ve<em&gt; In Vivo</em&gt; Nöronal morfoloji ve Göç Eğitim için

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Tüm Montajlı Nöromüsküler Kavşak Analizi için Enine Abdominis Kasının Diseksiyonu

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Serebellar Aksonlar Lazer Nanosurgery<em&gt; In Vivo</em

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to ...