Name: alternate immersion in glucose to produce prolonged hyperglycemia in zebrafish
Uploaded: 2021-05-05T15:00:00
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Vorremmo riconoscere VPC, CJR e MCP per lo sviluppo di questo protocollo. L'EMM ha ricevuto sostegno finanziario dall'American University College of Arts and Sciences Graduate Student Support per svolgere questa ricerca. Questo lavoro è stato anche supportato da un American University Faculty Mellon Award e finanziamenti attraverso l'American University College of Arts and Sciences (entrambi a VPC).

Tutte le procedure sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee dell'American University.
1. Preparazione dei serbatoi di soluzione
<ol><li>Ottenere sei serbatoi, due per ogni gruppo sperimentale (glucosio, mannitolo e acqua). Etichettare uno dei due serbatoi "serbatoio di alloggiamento" (oterrà il pesce) ed etichettare l'altro "serbatoio di soluzione" (terrà la soluzione). NOTA: Il gruppo di trattamento del mannitol è il controllo osmotico e il gruppo di tratt...

<ol>
	<li>Rubinstein, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish:+from+disease+modeling+to+drug+discovery.">Zebrafish: from disease modeling to drug discovery.</a> Current Opinion in Drug Discovery and Development. 6 (2), 218-223 (2003).</li><li>Gerlai, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Associative+learning+in+zebrafish+(Danio+rerio).">Associative learning in zebrafish (Danio rerio).</a> Methods in Cell Biology. 101, 249-270 (2011).</li><li>Goldsmith, J. R., Jobin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Think+small:+zebrafish+as+a+model+system+of+human+pathology.">Think small: zebrafish as a model system of human pathology.</a> BioMed Research International. , (2012).</li><li>Moss, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+the+pancreas+in+adult+zebrafish.">Regeneration of the pancreas in adult zebrafish.</a> Diabetes. 58 (8), 1844-1851 (2009).</li><li>Connaughton, V. P., Baker, C., Fonde, L., Gerardi, E., Slack, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternate+immersion+in+an+external+glucose+solution+differentially+affects+blood+sugar+values+in+older+versus+younger+zebrafish+adults.">Alternate immersion in an external glucose solution differentially affects blood sugar values in older versus younger zebrafish adults.</a> Zebrafish. 13 (2), 87-94 (2016).</li><li>Etuk, E. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+for+studying+diabetes+mellitus.">Animal models for studying diabetes mellitus.</a> Agriculture and Biology Journal of North America. 1 (2), 130-134 (2010).</li><li>Agardh, E., Bruun, A., Agardh, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+glial+cell+immunoreactivity+and+neuronal+cell+changes+in+rats+with+STZ-induced+diabetes.">Retinal glial cell immunoreactivity and neuronal cell changes in rats with STZ-induced diabetes.</a> Current Eye Research. 23 (4), 276-284 (2001).</li><li>Carmo, A., Cunha-Vaz, J. G., Carvalho, A. P., Lopes, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+synthase+activity+in+retinas+from+non-insulin-dependent+diabetic+Goto-Kakizaki+rats:+correlation+with+blood-retinal+barrier+permeability.">Nitric oxide synthase activity in retinas from non-insulin-dependent diabetic Goto-Kakizaki rats: correlation with blood-retinal barrier permeability.</a> Nitric Oxide. 4 (6), 590-596 (2000).</li><li>Ramsey, D. J., Ripps, H., Qian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+electrophysiological+study+of+retinal+function+in+the+diabetic+female+rat.">An electrophysiological study of retinal function in the diabetic female rat.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 47 (11), 5116-5124 (2006).</li><li>Biessels, G. J., Gispen, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+diabetes+on+cognition:+what+can+be+learned+from+rodent+models.">The impact of diabetes on cognition: what can be learned from rodent models.</a> Neurobiology of Aging. 26 (1), 36-41 (2005).</li><li>Intine, R. V., Olsen, A. S., Sarras, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+zebrafish+model+of+diabetes+mellitus+and+metabolic+memory.">A zebrafish model of diabetes mellitus and metabolic memory.</a> Journal of Visualized Experiments. (72), e50232 (2013).</li><li>Sarras, M. P., Intine, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+zebrafish+as+a+disease+model+provides+a+unique+window+for+understanding+the+molecular+basis+of+diabetic+metabolic+memory.">Use of zebrafish as a disease model provides a unique window for understanding the molecular basis of diabetic metabolic memory.</a> Research on Diabetes. , (2013).</li><li>Gleeson, M., Connaughton, V., Arneson, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+hyperglycaemia+in+zebrafish+(Danio+rerio)+leads+to+morphological+changes+in+the+retina.">Induction of hyperglycaemia in zebrafish (Danio rerio) leads to morphological changes in the retina.</a> Acta Diabetologica. 44 (3), 157-163 (2007).</li><li>Capiotti, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperglycemia+induces+memory+impairment+linked+to+increased+acetylcholinesterase+activity+in+zebrafish+(Danio+rerio).">Hyperglycemia induces memory impairment linked to increased acetylcholinesterase activity in zebrafish (Danio rerio).</a> Behavioural Brain Research. 274, 319-325 (2014).</li><li>Capiotti, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+impaired+glucose+metabolism+in+a+zebrafish+hyperglycemia+model.">Persistent impaired glucose metabolism in a zebrafish hyperglycemia model.</a> Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. 171, 58-65 (2014).</li><li>Capiotti, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperglycemia+alters+E-NTPDases,+ecto-5'-nucleotidase,+and+ectosolic+and+cytosolic+adenosine+deaminase+activities+and+expression+from+encephala+of+adult+zebrafish+(Danio+rerio).">Hyperglycemia alters E-NTPDases, ecto-5'-nucleotidase, and ectosolic and cytosolic adenosine deaminase activities and expression from encephala of adult zebrafish (Danio rerio).</a> Purinergic Signaling. 12 (2), 211-220 (2016).</li><li>Ali, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoreceptor+Degeneration+Accompanies+Vascular+Changes+in+a+Zebrafish+Model+of+Diabetic+Retinopathy.">Photoreceptor Degeneration Accompanies Vascular Changes in a Zebrafish Model of Diabetic Retinopathy.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 61 (2), 43 (2020).</li><li>Wiggenhauser, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+Retinal+Angiogenesis+in+Hyperglycemic+pdx1-/-+Mutants.">Activation of Retinal Angiogenesis in Hyperglycemic pdx1-/- Mutants.</a> Diabetes. 69 (5), 1020-1031 (2020).</li><li>Chen, X. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+HMGB1+mediated+signalling+pathway+in+diabetic+retinopathy:+evidence+from+type+2+diabetic+rats+and+ARPE-19+cells+under+diabetic+condition.">Involvement of HMGB1 mediated signalling pathway in diabetic retinopathy: evidence from type 2 diabetic rats and ARPE-19 cells under diabetic condition.</a> Journal of Ophthalmology. 97, 1598-1603 (2013).</li><li>Costa, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+light+exposure,+pH,+osmolarity,+and+solvent+on+the+retinal+pigment+epithelial+toxicity+of+vital+dyes.">Effects of light exposure, pH, osmolarity, and solvent on the retinal pigment epithelial toxicity of vital dyes.</a> American Journal of Ophthalmology. 155, 705-712 (2013).</li><li>Alvarez, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predominant+cone+photoreceptor+dysfunction+in+a+hyperglycemic+model+of+non-proliferative+diabetic+retinopathy.">Predominant cone photoreceptor dysfunction in a hyperglycemic model of non-proliferative diabetic retinopathy.</a> Disease Models and Mechanisms. 3, 236-245 (2010).</li><li>Fletcher, E. L., Phipps, J. A., Wilkinson-Berka, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysfunction+of+retinal+neurons+and+glia+during+diabetes.">Dysfunction of retinal neurons and glia during diabetes.</a> Clinical and Experimental Optometry. 88, 132-145 (2005).</li><li>Fletcher, E. L., Phipps, J. A., Ward, M. M., Puthussery, T., Wilkinson-Berka, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+and+glial+abnormality+as+predictors+of+progression+of+diabetic+retinopathy.">Neuronal and glial abnormality as predictors of progression of diabetic retinopathy.</a> Current Pharmaceutical Design. 13, 2699-2712 (2007).</li><li>Agardh, E., Bruun, A., Agardh, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+glial+cell+immunoreactivity+and+neuronal+cell+changes+in+rats+with+STZ-+induced+diabetes.">Retinal glial cell immunoreactivity and neuronal cell changes in rats with STZ- induced diabetes.</a> Current Eye Research. 23, 276-284 (2001).</li><li>Barber, A. J., Antonetti, D. A., Gardner, T. W., Group, T. P. S. R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+expression+of+retinal+occludin+and+glial+fibrillary+acidic+protein+in+experimental+diabetes.">Altered expression of retinal occludin and glial fibrillary acidic protein in experimental diabetes.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 41, 3561-3568 (2000).</li><li>Lieth, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+reactivity+and+impaired+glutamate+metabolism+in+short-term+experimental+diabetic+retinopathy.">Glial reactivity and impaired glutamate metabolism in short-term experimental diabetic retinopathy.</a> Diabetes. 47, 815-820 (1998).</li><li>Rungger-Brandle, E., Dosso, A. A., Leuenberger, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+reactivity,+an+early+feature+of+diabetic+retinopathy.">Glial reactivity, an early feature of diabetic retinopathy.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 41, 1971-1980 (2000).</li><li>Zeng, X. X., Ng, Y. K., Ling, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+and+microglial+response+in+the+retina+of+streptozotocin-induced+diabetic+rats.">Neuronal and microglial response in the retina of streptozotocin-induced diabetic rats.</a> Visual Neuroscience. 17, 463-471 (2000).</li><li>Mizutani, M., Gerhardinger, C., Lorenzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muller+cell+changes+in+human+diabetic+retinopathy.">Muller cell changes in human diabetic retinopathy.</a> Diabetes. 47, 445-449 (1998).</li><li>Tanvir, Z., Nelson, R., DeCicco-Skinner, K., Connaughton, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+month+of+hyperglycemia+alters+spectral+responses+of+the+zebrafish+photopic+electroretinogram.">One month of hyperglycemia alters spectral responses of the zebrafish photopic electroretinogram.</a> Disease Models and Mechanisms. 11, (2018).</li><li>Hancock, H. A., Kraft, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oscillatory+potential+analysis+and+ERGs+of+normal+and+diabetic+rats.">Oscillatory potential analysis and ERGs of normal and diabetic rats.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 45, 1002-1008 (2004).</li><li>Layton, C. J., Safa, R., Osborne, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oscillatory+potentials+and+the+b-wave:+partial+masking+and+interdependence+in+dark+adaptation+and+diabetes+in+the+rat.">Oscillatory potentials and the b-wave: partial masking and interdependence in dark adaptation and diabetes in the rat.</a> Graefe's Archives for Clinical and Experimental Ophthalmology. 245, 1335-1345 (2007).</li><li>Li, Q., Zemel, E., Miller, B., Perlman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+retinal+damage+in+experimental+diabetes:+electroretinographical+and+morphological+observations.">Early retinal damage in experimental diabetes: electroretinographical and morphological observations.</a> Experimental Eye Research. 74, 615-625 (2002).</li><li>Kohzaki, K., Vingrys, A. J., Bui, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+inner+retinal+dysfunction+in+streptozotocin-induced+diabetic+rats.">Early inner retinal dysfunction in streptozotocin-induced diabetic rats.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 49, 3595-3604 (2008).</li><li>Phipps, J. A., Yee, P., Fletcher, E. L., Vingrys, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rod+photoreceptor+dysfunction+in+diabetes:+activation,+deactivation,+and+dark+adaptation.">Rod photoreceptor dysfunction in diabetes: activation, deactivation, and dark adaptation.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 47, 3187-3194 (2006).</li></ol>

Il diabete è un problema nazionale. Gli studi dimostrano che entro il 2030, si stima che 400 milioni di persone avranno una qualche forma di diabete. Nei modelli di roditori, il DM di tipo 2 viene studiato utilizzando la manipolazione genetica. Nei ratti, i ratti grassi diabetici Zucker (ZDF) e i ratti grassi Otsuka Long-Evans Tokushima (OLETF), forniscono maggiori informazioni sugli effetti del tipo 2 DM10. Inoltre, diete ad alto contenuto di grassi sono state utilizzate nei roditori per indurre...

Il pesce zebra(Danio rerio)sta rapidamente diventando un modello animale ampiamente utilizzato per studiare sia la malattia che la cognizione1. La facilità di manipolazione genetica e la trasparenza embrionale attraverso le prime fasi di sviluppo, li rendono un candidato principale per studiare le malattie umane con una base genetica nota. Ad esempio, i pesci zebra sono stati utilizzati per studiare la sindrome di Holt-Oram, le cardiomiopatie, la malattia renale glomerulocistica, la distrofia muscolare e il diabete mellito (DM) tra le altremalattie 1. Inoltre, il modello zebrafish è ideale per le piccole dimensioni della specie, la facilità di manutenzione e l'elevata fecondità2,3.
Il pancreas zebrafish è sia anatomicamente che funzionalmente simile al pancreas di mammiferi4. Pertanto, le caratteristiche uniche di dimensioni, alta fecondità e strutture endocrine simili rendono zebrafish un candidato adatto per lo studio delle complicanze legate alla DM. Nel pesce zebra, ci sono due metodi sperimentali utilizzati per indurre l'iperglicemia prolungata che è caratteristica del DM: un afflusso di glucosio (modellazione di tipo 2) e la cessazione della secrezione di insulina (modellazione tipo 1)5,6. Sperimentalmente, per fermare la secrezione di insulina, le cellule β pancreatiche possono essere distrutte chimicamente usando iniezioni di Streptozotocina (STZ) o Alloxan. STZ è stato utilizzato con successo nei roditori e nei pesci zebra, con conseguenti complicazioni associate alla retinopatia7,8,9,deficit cognitivi10e rigenerazione degli arti11. Tuttavia, nel pesce zebra, β-cellule si rigenerano dopo il trattamento, causando la necessaria "iniezione di richiamo" di STZ per mantenere le condizioni diabetiche12. In alternativa, il pancreas del pesce zebra può essere rimosso6. Si tratta sia di procedure altamente invasive, dovute alle iniezioni multiple, sia di un ampio tempo di recupero.
Al contrario, l'iperglicemia può essere indotta in modo non invasivo attraverso l'esposizione al glucosio esogeno. In questo protocollo, i pesci sono immersi in una soluzione di glucosio altamente concentrata per 24 ore5,13 o continuamente per 2 settimane14,15,16. Il glucosio esogeno viene assunto transdermicamente, per ingestione e/o attraverso le branchie con conseguente elevati livelli di zucchero nel sangue. Poiché questa tecnica non invasiva non manipola direttamente i livelli di insulina, non può pretendere di indurre il DM di tipo 2. Tuttavia, può essere utilizzato per esaminare le complicanze indotte dall'iperglicemia, che è uno dei principali sintomi del DM di tipo 2.
Recentemente, il mutante zebrafish pdx1-/- è stato sviluppato manipolando il gene pancreatico e duodenale omeobox 1, un gene legato alla causa genetica del DM di tipo 2 nell'uomo. Utilizzando questo mutante, i ricercatori sono stati in grado di replicare l'interruzione dello sviluppo pancreatico, l'alto livello di zucchero nel sangue e studiare la retinopatia diabetica indotta da iperglicemia17,18.
In questo articolo, descriviamo un metodo di induzione dell'iperglicemia non invasiva che utilizza un protocollo ad immersione alternata. Questo protocollo mantiene condizioni iperglicemiche per un massimo di 8 settimane con complicazioni successive osservate. In breve, i pesci zebra adulti vengono posti in una soluzione di zucchero per 24 ore e quindi in una soluzione d'acqua per 24 ore. A differenza dell'immersione continua in soluzioni esterne di glucosio, alternare giorni tra zucchero e acqua imita l'aumento e la caduta della glicemia nel diabete. Un protocollo di glucosio alternato consente inoltre di indotta l'iperglicemia per periodi di tempo più lunghi, poiché i pesci zebra non sono così in grado di compensare le elevate condizioni esterne di glucosio. Come prova di principio, forniamo dati che mostrano che l'iperglicemia indotta usando questo protocollo altera la chimica retinica e la fisiologia.

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		<tr>
			<td>Airline Tubing</td>
			<td>petsmart</td>
			<td>5291863</td>
			<td>This can be used in the tank to circulate air</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Airpump</td>
			<td>petsmart</td>
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			<td>This can be used in the tank to circulate air</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Airstones</td>
			<td>petsmart</td>
			<td>5149683</td>
			<td>This can be used in the tank to circulate air</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270-5KG</td>
			<td></td>
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			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC125340050</td>
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		<tr>
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		<tr>
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			<td>Amazon</td>
			<td>B0002APZO4</td>
			<td></td>
		</tr>
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alternate immersion in glucose to produce prolonged hyperglycemia in zebrafish

I pesci zebra (Danio rerio) sono un modello eccellente per indagare gli effetti dell'iperglicemia cronica, un segno distintivo del diabete mellito di tipo II (T2DM). Questo protocollo ad immersione alternativa è un metodo non invasivo e step-wise per indurre iperglicemia per un massimo di otto settimane. I pesci zebra adulti sono alternativamente esposti allo zucchero (glucosio) e all'acqua per 24 ore ciascuno. Il pesce zebra inizia il trattamento in una soluzione di glucosio all'1% per 2 settimane, quindi una soluzione al 2% per 2 settimane e infine una soluzione al 3% per le restanti 4 settimane. Rispetto ai controlli trattati con acqua (stress) e trattati con mannitolo (osmotico), i pesci zebra trattati con glucosio hanno livelli significativamente più elevati di zucchero nel sangue. Il pesce zebra trattato con glucosio mostra livelli di zucchero nel sangue 3 volte superiori a quello dei controlli, suggerendo che dopo quattro e otto settimane l'iperglicemia può essere raggiunta. L'iperglicemia sostenuta è stata associata all'aumento della proteina acida fibrillare gliale (GFAP) e all'aumento dei livelli di fattore nucleare Kappa B (NF-kB) nella retina e alla diminuzione delle risposte fisiologiche, così come i deficit cognitivi che suggeriscono che questo protocollo può essere utilizzato per modellare le complicanze della malattia.

Utilizzando questo protocollo (Figura 1), i valori della glicemia sono significativamente elevati dopo 4 settimane e 8 settimane di trattamento (Figura 2A), con iperglicemia definita come 3 volte le medie di controllo provenienti sia da gruppi trattati con acqua che da gruppi trattati con mannito. I controlli trattati con acqua vengono trasferiti ogni giorno all'interno e all'uscita dall'acqua, fornendo un controllo dello stress/movimentazione. Il mannitolo fung...

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Alternate Immersion in Glucose to Produce Prolonged Hyperglycemia in Zebrafish

Questo protocollo induce in modo non invasivo l'iperglicemia nel pesce zebra per un massimo di 8 settimane. Utilizzando questo protocollo, è possibile fare uno studio approfondito degli effetti avversi dell'iperglicemia.

Immersione alternativa nel glucosio per produrre iperglicemia prolungata in Zebrafish

Zebrafish (Danio rerio) are an excellent model to investigate the effects of chronic hyperglycemia, a hallmark of Type II Diabetes Mellitus (T2DM). This ...

Questo protocollo induce l'iperglicemia nei pesci zebra in un modello di aumento e caduta che imita l'iperglicemia che si vede nel diabete di tipo due. Il principale vantaggio di questa tecnica è che è una tecnica non invasiva che consente di garantire che l'iperglicemia sia la causa di eventuali alterazioni osservate nei pesci iperglicemici. Questo protocollo potrebbe potenzialmente essere utilizzato per esplorare vie terapeutiche o farmaci che prendono di mira le complicanze dell'iperglicemia.Questo protocollo ha molti passaggi, ma quando i passaggi vengono seguiti correttamente e con cura, dovrebbe diventare rapidamente una seconda natura. Ricorda tuttavia, di trattare sempre gli animali delicatamente e umanamente durante l'intero protocollo. Inizia impostando sei carri armati, due per ogni gruppo sperimentale.Utilizzare serbatoi da due litri, se il numero totale di pesci è inferiore a 20 e quattro litri serbatoi se il numero totale di pesci è superiore a 20. Etichettare uno dei due serbatoi, il serbatoio dell'alloggiamento e l'altro serbatoio della soluzione. Tenere i serbatoi in un bagno d'acqua a 28-29 gradi Celsius per mantenere la temperatura dell'acqua.Il primo giorno, metti il pesce nelle rispettive soluzioni di trattamento per 24 ore. Il secondo giorno, trasferire il pesce dalle loro soluzioni di trattamento all'acqua per 24 ore. Il terzo giorno, trasferire il pesce dall'acqua alle soluzioni di trattamento.Continuare questa esposizione alternata per il resto dell'esperimento. Trasferimento quotidiano di pesci di controllo trattati con acqua dall'acqua all'acqua. Assicurarsi che il pesce venga nutrito e trasferito all'interno della stessa finestra di due ore ogni giorno per tutta la durata dell'esperimento.Trasferire il pesce in ogni gruppo di trattamento dal serbatoio di alloggiamento al serbatoio di soluzione corrispondente utilizzando una rete di pesce standard. Riposizionare il serbatoio contenente il pesce nel bagno d'acqua e sostituire la pietra d'aria e il coperchio del serbatoio. Questo serbatoio è ora il serbatoio dell'alloggiamento e il serbatoio che in precedenza teneva il pesce è ora il serbatoio della soluzione.Scartare la vecchia soluzione e pulire il serbatoio insieme ai coperchi del serbatoio, alle linee dell'aria, alle pietre d'aria e alle reti per prevenire l'accumulo di glucosio e mannitol. Utilizzare acqua e una spugna dedicata per ogni condizione di trattamento per pulire correttamente i serbatoi. Asciugare i serbatoi di soluzione appena puliti con un tovagliolo di carta e preparare le soluzioni per il giorno successivo utilizzando questo serbatoio.Assicurarsi che gli altri articoli siano asciugati e separati da gruppi di trattamento appropriati. Per preparare le soluzioni di zucchero, riempire ogni serbatoio della soluzione con due o quattro litri di acqua di sistema. Misurare la corretta quantità di glucosio e mannitol utilizzando una bilancia di carico superiore e barche di pesata separate per ogni sostanza chimica.Aggiungere l'aliquota pesata di glucosio o mannitol al serbatoio della soluzione pulita appropriato. Mescolare le soluzioni con aste di vetro separate fino a quando gli zuccheri non sono completamente sciolti. Quindi restituire i serbatoi di soluzione al bagno d'acqua e coprirli con i coperchi corrispondenti.Per preparare la soluzione d'acqua, riempire i serbatoi sperimentali con acqua di sistema Restituire questi serbatoi di soluzione al bagno d'acqua e coprirli con i coperchi corrispondenti. I valori di zucchero nel sangue sono stati significativamente elevati dopo entrambi i trattamenti di glucosio di quattro settimane e otto settimane. Con iperglicemia definita come tre volte le medie di controllo sia dai gruppi trattati con acqua che dal mannitolo.Il tessuto retinico raccolto dopo quattro settimane di iperglicemia ha avuto un aumento della proteina acida fibrillare gliale o dei livelli di GFAP. L'espressione GFAP è osservata nelle cellule gliali di Mueller nella retina, che sono alterate nella retinopatia diabetica. Questo aumento della GFAP è stato associato ad un aumento dei livelli di kappaB dei fattori nucleari.Suggerendo che l'iperglicemia indotta innesca una risposta infiammatoria e gliosi reattiva. Le registrazioni ERG dopo quattro settimane di trattamento hanno identificato una diminuzione della risposta nelle retine trattate con glucosio rispetto ai controlli trattati con mannitol. Le ampiezze sia del fotorecettore che dei componenti cellulari bipolari sono state ridotte nei pesci iperglicemici.Questa procedura può essere integrata da altri test di iperglicemia. Ad esempio, un saggio di memoria può essere usato per esaminare deficit cognitivi o registrare risposte visive come la risposta optomotoria per valutare le complicanze basate sulla visione. Una volta stabilita questa tecnica, il nostro laboratorio è stato in grado di usarla per studiare le complicanze indotte dall'iperglicemia nel modello del pesce zebra.Abbiamo osservato queste complicazioni relativamente rapidamente, dopo quattro settimane di trattamento.

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