Name: in vitro time-lapse live-cell imaging to explore cell migration toward the organ of corti
Uploaded: 2020-12-04T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vitro Time-lapse Live-Cell Imaging to Explore Cell Migration toward the Organ of Corti at JoVE.com

Diese Arbeit wurde durch Forschungsstipendien (NRF-2018-R1D1A1B07050175, HURF-2017-66) der National Research Foundation (NRF) korea und hallym University Research Fund unterstützt.

Alle Forschungsprotokolle mit ICR-Mäusen wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Yonsei University am Wonju College of Medicine genehmigt. Die Experimente wurden nach dem Ethikkodex der World Medical Association durchgeführt. In diesem Protokoll wurden schwangere ICR-Mäuse in einem 12/12 h Licht/Dunkel-Zyklus mit freiem Zugang zu Nahrung und Wasser gehalten.
1. Cochlea-Sektion
<ol><li>Sterilisieren Sie die laminare Strömungsgewebekulturhaube, indem Sie das ultr...

<ol>
	<li>Brown, C. S., Emmett, S. D., Robler, S. K., Tucci, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+hearing+loss+prevention.">Global hearing loss prevention.</a> Otolaryngologic Clinics of North America. 51 (3), 575-592 (2018).</li><li>Chamberlain, G., Fox, J., Ashton, B., Middleton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+mesenchymal+stem+cells:+their+phenotype,+differentiation+capacity,+immunological+features,+and+potential+for+homing.">Concise review: mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing.</a> Stem Cells. 25 (11), 2739-2749 (2007).</li><li>Fu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell+migration+and+tissue+repair.">Mesenchymal stem cell migration and tissue repair.</a> Cells. 8 (8), (2019).</li><li>Uder, C., Br&#252;ckner, S., Winkler, S., Tautenhahn, H. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stromal+cell+homing:+Mechanisms+and+strategies+for+improvement.">Mesenchymal stromal cell homing: Mechanisms and strategies for improvement.</a> iScience. 15, 421-438 (2019).</li><li>Ahn, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+to+enhance+efficacy+of+SPION-labeled+stem+cell+homing+by+magnetic+attraction:+a+systemic+review+with+meta-analysis.">Strategies to enhance efficacy of SPION-labeled stem cell homing by magnetic attraction: a systemic review with meta-analysis.</a> International Journal of Nanomedicine. 14, 4849-4866 (2019).</li><li>Alon, R., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+on+the+run:+shear-regulated+integrin+activation+in+leukocyte+rolling+and+arrest+on+endothelial+cells.">Cells on the run: shear-regulated integrin activation in leukocyte rolling and arrest on endothelial cells.</a> Current Opinion in Cell Biology. 20 (5), 525-532 (2008).</li><li>Sykova, E., Jendelova, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+tracking+of+stem+cells+in+brain+and+spinal+cord+injury.">In vivo tracking of stem cells in brain and spinal cord injury.</a> Progress in Brain Research. 161, 367-383 (2007).</li><li>Landegger, L. D., Dilwali, S., Stankovic, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+murine+cochlear+explant+technique+as+an+in+vitro+screening+tool+in+hearing+research.">Neonatal murine cochlear explant technique as an in vitro screening tool in hearing research.</a> Journal of Visualized Experiments. (124), e55704 (2017).</li><li>Pijuan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+cell+migration,+invasion,+and+adhesion+assays:+From+cell+imaging+to+data+analysis.">In vitro cell migration, invasion, and adhesion assays: From cell imaging to data analysis.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 107 (2019).</li><li>Rask-Andersen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cochlea:+anatomical+characteristics+and+their+relevance+for+cochlear+implantation.">Human cochlea: anatomical characteristics and their relevance for cochlear implantation.</a> The Anatomical Record. 295 (11), 1791-1811 (2012).</li><li>Kamiya, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell+transplantation+accelerates+hearing+recovery+through+the+repair+of+injured+cochlear+fibrocytes.">Mesenchymal stem cell transplantation accelerates hearing recovery through the repair of injured cochlear fibrocytes.</a> The American Journal of Pathology. 171 (1), 214-226 (2007).</li><li>Lee, H. S., Kim, W. J., Gong, J. S., Park, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+safety+and+efficacy+of+autologous+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cell+transplantation+in+sensorineural+hearing+loss+patients.">Clinical safety and efficacy of autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cell transplantation in sensorineural hearing loss patients.</a> Journal of Audiology and Otology. 22 (2), 105-109 (2018).</li><li>Vanden Berg-Foels, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+tissue+regeneration:+chemoattractants+for+endogenous+stem+cell+recruitment.">In situ tissue regeneration: chemoattractants for endogenous stem cell recruitment.</a> Tissue Engineering Part B: Reviews. 20 (1), 28-39 (2014).</li><li>Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+culture+and+plasmid+electroporation+of+the+murine+organ+of+Corti.">Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of Corti.</a> Journal of Visualized Experiments. (36), e1685 (2010).</li><li>Ogier, J. M., Burt, R. A., Drury, H. R., Lim, R., Nayagam, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+culture+of+neonatal+murine+inner+ear+explants.">Organotypic culture of neonatal murine inner ear explants.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 170 (2019).</li><li>Oshima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensitive+hair+cell-like+cells+from+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells.">Mechanosensitive hair cell-like cells from embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> Cell. 141 (4), 704-716 (2010).</li></ol>

Die Transplantation von MSCs an beschädigten Stellen zur Förderung der Regeneration geschädigter Zellen wurde ausgiebig untersucht, und die therapeutische Wirkung ist offensichtlich. Die Transplantation und die anschließende Differenzierung von MSCs wurden berichtet, um das Gehör bei Ratten mit Hörverlust durch 3-Nitropropionsäure13induziert wiederherzustellen. Obwohl Lee et al. MSCs auf Menschen transvenös anwendeten, erreichten sie keine signifikante Verbesserung im Hören<sup class="xre...

Hörverlust kann angeboren auftreten oder kann schrittweise durch mehrere Faktoren verursacht werden, einschließlich Alterung, Medikamente, und Lärm. Hörverlust ist oft schwierig zu behandeln, weil es sehr schwierig ist, beeinträchtigte Funktion wiederherzustellen, sobald die für das Gehör verantwortlichen Haarzellen geschädigt sind1. Nach Angaben der Weltgesundheitsorganisation leiden weltweit schätzungsweise 461 Millionen Menschen an Hörverlust, was 6,1 % der Weltbevölkerung ausmacht. Von den Menschen mit Hörverlust sind 93 % Erwachsene und 7 % Kinder.
Es wurde versucht, eine Reihe von Ansätzen zur Behandlung von Hörverlust zu finden; insbesondere hat sich ein Regenerationsansatz mit MsC als vielversprechende Behandlung herausgestellt. Wenn Gewebe geschädigt ist, werden MSCs natürlicherweise in das Kreislaufsystem freigesetzt und wandern an die Verletzungsstelle, wo sie verschiedene Moleküle absondern, um eine Mikroumgebung zu bilden, die die Regeneration fördert2. Daher ist es wichtig, eine Methode zur Behandlung von geschädigtem Gewebe durch die Migration von extern implantierten MSCs auf Zielorgane und deren anschließende Sekretion von Molekülen zu entwickeln, die eine starke Immunregulation, Angiogenese und Anti-Apoptose verursachen, um die Wiederherstellung der beschädigten Zellfunktion3,4,5zu verbessern.
Der Homing-Prozess, bei dem MSCs in beschädigte Gewebe migrieren, könnte das wichtigste Hindernis sein, das überwunden werden muss. MSCs verfügen über einen systemischen Homing-Mechanismus mit sequenziellen Schritten des Tethering/Rollings, der Aktivierung, des Arrests, der Transmigration/Diapedese und der Migration6,7,8. Derzeit werden Anstrengungen unternommen, um Wege zur Verbesserung dieser Schritte zu finden. Verschiedene Strategien, einschließlich genetischer Veränderung, Zelloberflächentechnik, In-vitro-Primierung und magnetische Rführung, wurden getestet6,7. Darüber hinaus wurden mehrere Versuche unternommen, den Schutz und die Regeneration von auditiven Haarzellen zu fördern, indem MSCs an die Stelle der beschädigten Cochlea homing. Die Verfolgung von MSCs in vivo ist jedoch zeitaufwändig und arbeitsintensiv und erfordert hochspezialisierte Fähigkeiten9.
Um dieses Problem zu lösen, wurde eine Methode entwickelt, um das Homing von MSCs in der Cochlea durch zeitraffende konfokale Mikroskopie zu beobachten, die die Migration von Zellen über mehrere Stunden fotografiert(Abbildung 1). Es wurde im frühen20. Jahrhundert entwickelt und hat sich vor kurzem zu einem leistungsfähigen Werkzeug für die Untersuchung der Migration von bestimmten Zellen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61947/61947fig01.jpg" style="font-size: 14px;"> Abbildung 1: Grafische Zusammenfassung. (A) Nachdem das sezierte Organ von Corti mit Zangen auf einem Kunststoffdeckel aufeinem Kunststoffdeckel aufkleben wird, wird der Deckelaufschub auf eine 35 mm Glasboden-Konfokalmikroskopische Schale gelegt, und (B) wird der Glaszylinder positioniert. (C) Nach dem Befüllen der Innenseite des Glaszylinders mit Medium(D) werden GFP-beschriftete MSCs mit Medium sorgfältig außerhalb des Zylinders hinzugefügt. (E) Nach der Inkubation über Nacht (F) wird der Glaszylinder entfernt und Die Bilder werden mit einem konfokalen Mikroskop aufgenommen. Abkürzungen: GFP = grünes fluoreszierendes Protein; MSCs = mesenchymale Stammzellen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61947/61947fig01large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10X PBS Buffer</td>
			<td>GenDEPOT</td>
			<td>P2100-104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Formalin</td>
			<td>T&#38;I</td>
			<td>BPP-9004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>sigma&#160;</td>
			<td>A5354-10ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>sigma&#160;</td>
			<td>A4503-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>confocal dish</td>
			<td>SPL</td>
			<td>200350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>confocal microscope&#160;</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>LSM800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>coverslip</td>
			<td>SPL</td>
			<td>20009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10565-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher scientific</td>
			<td>16140071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorsheild with DAPI</td>
			<td>sigma&#160;</td>
			<td>F6057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forcep</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>0508-L5-P0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Thermo Fisher scientific</td>
			<td>14065056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher scientific</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-iFluor 647 Reagent</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab176759</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage Top Incubator</td>
			<td>TOKAI HIT</td>
			<td>WELSX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strain C57BL/6 mouse messenchymal stem cells with GFP</td>
			<td>cyagen</td>
			<td>MUBMX-01101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>sigma&#160;</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro time-lapse live-cell imaging to explore cell migration toward the organ of corti

Um die Auswirkungen von mesenchymalen Stammzellen (MSCs) auf die Zellregeneration und -behandlung zu untersuchen, verfolgt diese Methode MSC-Migration und morphologische Veränderungen nach Derkokultur mit Cochlea-Epithel. Das Organ von Corti wurde auf einem Kunststoffdeckel immobilisiert, indem ein Teil der Reissner-Membran gedrückt wurde, der während der Zerlegung erzeugt wurde. MSCs, die durch einen Glaszylinder begrenzt waren, migrierten zum Cochlea-Epithel, als der Zylinder entfernt wurde. Ihre vorherrschende Lokalisation wurde im Modiolus des Organs von Corti beobachtet, ähnlich ausgerichtet in eine Richtung, die der der Nervenfasern ähnelt. Einige MSCs wurden jedoch im Limbusbereich lokalisiert und zeigten eine horizontal längliche Form. Darüber hinaus wurde die Migration in den Haarzellbereich erhöht, und die Morphologie der MSCs änderte sich nach der Kanamycin-Behandlung in verschiedene Formen. Zusammenfassend deuten die Ergebnisse dieser Studie darauf hin, dass die Kokultur von MSCs mit Cochlea-Epithel für die Entwicklung von Therapeutika durch Zelltransplantation und für Studien zur Zellregeneration nützlich sein wird, die verschiedene Bedingungen und Faktoren untersuchen können.

Die In-vitro-Migration von MSCs im dreidimensionalen Modus wurde durch ein Transwell-System oder durch die traditionelle Wundheilungsmethode zur Beobachtung der Migration im zweidimensionalen (2D) Modus11bewertet. Das Organ von Corti ist eine komplexe Struktur, die aus verschiedenen Zellen wie Boettcherzellen, Claudius-Zellen, Deiter-Zellen, Säulenzellen, Hensen-Zellen, äußeren Haarzellen, inneren Haarzellen, Nervenfasern, Basilarmembran und Reikularlamina<sup c...

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In vitro Time-lapse Live-Cell Imaging to Explore Cell Migration toward the Organ of Corti

In dieser Studie stellen wir ein Echtzeit-Bildgebungsverfahren unter Verwendung der konfokalen Mikroskopie vor, um Zellen zu beobachten, die sich durch Ex-vivo-Inkubation mit dem Cochlea-Epithel, das das Organ von Corti enthält, in Richtung geschädigtes Gewebe bewegen.

In vitro Time-lapse Live-Cell Imaging zur Erforschung der Zellmigration zum Organ von Corti

To study the effects of mesenchymal stem cells (MSCs) on cell regeneration and treatment, this method tracks MSC migration and morphological changes after ...

Existing in vitro method to investigate migration of MSCs include Transwell or wound healing protocols. The method described here can be used to track migration of MSCs to explant in real time. In terms of culture of explant, the advantage of this method compared to others is that it achieves a reduction in time and cost, as well as a simplification of experimental steps.This technique can be used to observe stem cell homing to target in real time leading to development of models with optimized homing efficiency. Removal of tectorial membrane is difficult for unexperienced researchers. Depending on the development stage, understanding the right time to remove the tectorial membrane is important for the success of this protocol.Demonstrating the procedure will be Dr.Jeong-Eun Park and Dr.Su Hoon Lee, researcher professors from my lab. Begin by sterilizing the laminar flow tissue culture hood by turning on the ultraviolet light for approximately 30 minutes. Spray all surfaces with 70%ethanol prior to use and allow them to dry.Place dissection instruments in 70%ethanol for 10 minutes, then dry them before using. After decapitating a three to four-day-old mouse, soak the ahead in 70%ethanol and place it under a serial microscope in the laminar flow hood. Quickly soak the tissue in tissue dissection solution to remove the ethanol.Cut the center line of the skull with the surgical blade, then expose the skull by pulling down the skin anteriorly and cutting the external auditory canal of the ear. Cut from the anterior to the posterior part of the cranium across the eye line, then open the skull and remove the forebrain, cerebellum, and brainstem with blunt forceps. Using microforceps, separate the cochlea from the temporal bone and transfer it to a Petri dish containing tissue dissection solution.Carefully dissect all of the cochlear otic capsule leaving only the internal cochlear soft tissue. Hold the modiolus of the cochlea with forceps and the cochlear duct with another pair of forceps, then slowly separate the two tissues. Remove the stria vascularis and tectorial membrane by gently peeling them away.Place a sterilized plastic coverslip in new tissue dissection solution, then place the organ of Corti on the coverslip making sure that the basilar membrane faces downward. Immobilize the tissue by pressing the Reissner's membrane and the remaining modiolus tissue onto the coverslip with forceps. Transfer the coverslip with the embedded tissue to the center of a 35 millimeter confocal dish.Place the glass cloning cylinder on the dish with the cochlear explant positioned in the center of the dish and add 100 microliters of explant culture medium into the cylinder. Place 5, 000 bone marrow derived GFP-tagged mesenchymal stem cells or MSCs in two milliliters of culture medium outside the glass cylinder and put the dish in the incubator. After culturing the cells as described in the text manuscript, aspirate all medium inside and outside the cylinder and remove the glass cylinder from the confocal dish.Add two milliliters of fresh culture medium to the dish. Place it in a humidified incubator until ready for analysis. Use a confocal microscopy system with a stage top incubator.Turn on the confocal microscope, fluorescent light and computer. Set the conditions of the stage top incubator to 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide atmosphere. Place the sample dish on the dish fixing vessel, cover it with the dish fixing lid and close the chamber with the top heater lid.Adjust the zoom and focus to localize the organ of Corti and MSCs in the field of view. Open the image processing software. Under the locate option, select a 20X plan-apochromat objective or numerical aperture 0.8 and a 0.5X crop area.Under acquisition, click on smart setup and select EGFP. Open the channel tab under acquisition and set the laser power to 0.2%the pinhole to 44 micrometers, the master gain to 750 volts, and the digital gain to 1.0. Click on ESID under imaging setup and set the ESID gain to four and the digital gain to 7.5.Click on tiles and stake to produce 210 tiles. Open focus strategy and select the focus mode. Under time series, set the duration to 24 hours and the interval to 10 minutes.Under acquisition, set the frame size to 512 by 512 pixels, scan speed to eight, the direction to bidirectional, the averaging to 4X, and the bits per pixel to 16. Click on start experiment to begin the experiment. The two-dimensional path of mesenchymal stem cells or MSCs was tracked in a wound healing method by using a glass cylinder as a barrier between the MSCs and the organ of Corti.When the organ of Corti was cultured, fibroblasts grew very quickly outward from the outer hair cells in the outermost layer. Most GFP-labeled MSCs were pushed out by fast-growing fibroblasts. Nonetheless, some penetrated the layer of fibroblasts and successfully migrated to the organ of Corti.The results from 72 hours of incubation showed that MSCs migrated to the organ of Corti and were mainly localized in the modiolus and the area with the cochlear nerve fibers separated from the modiolus. The morphology of the MSCs was altered to a radial shape similar to that of nerve fibers. The cells were transformed into a linear shape along the limbus line, rather than the hair cell area.The MSCs were able to migrate and grow in the nerve fiber collection area by penetrating the various cell layers and physical barriers. When damage to hair cells was induced by a 16-hour treatment with kanamycin and cells were cultured for a further 72 hours after the removal of kanamycin, MSCs were localized not only in the modiolus, but also in the outer hair cells. Immobilizing the tissue is an important step in this protocol was the organ of Corti is attached.It does not fall off easily. This is a trivial, but helpful tip for successful explant culture. This method may be adapted to study the efficacy of exosomes secreted from MSCs.

Research

JoVE Journal

Medicine

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Forschung

Medizin

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