Dette er en videoprotokol til elektroporation-medieret RNA-interferensmetode i Odonata. Guldsmede og damselflies, medlemmer af den rækkefølge Odonata, er blandt de mest forfædres insekter. Voksen Odonata viser en bemærkelsesværdig mangfoldighed i kropsfarver og mønstre, og mange økologiske og adfærdsmæssige undersøgelser er blevet gennemført.
Men, molekylære genetiske undersøgelser af Odonata har manglet, fordi gen funktionelle analyse er meget vanskeligt. For eksempel er den konventionelle RNAi-metode ikke effektiv i Odonata-arter. For nylig etablerede vi en RNM-metode i kombination med in vivo elektroporation.
Her giver vi en video protokol for elektroporation-medieret RNAi i både guldsmede og damselflies. Som vores repræsentative damselflies arter bruger vi den blå-tailed damselfly. Ischnura senegalensis.
Dette er en af de mest almindelige damselfly arter og ofte findes i solrige damme i Japan. For det første viser vi RNAi-protokollen rettet mod maven på en damselfly, Ischnura senegalensis. Efter iskold anæstesi på, at to stifter på begge sider af prothorax og fastgør larverne til en fast stand.
Træk og stræk den intersegmentale membran mellem det syvende og ottende abdominalsegment ved hjælp af snæver. Hold den intersegmentale membran strakt i hånden. Sæt spidsen af den forberedte kapillær ind i den strakte intersegmentale membran.
Injicer 1 mikroliter siRNA- eller dsRNA-opløsning. Påfør to dråber ultralydgel på larveoverfladen ved hjælp af sniver. Placer elektroder på ultralyd gel, med den positive elektrode på siden af injektion.
Generer 10 gange elektroporationsimpulser ved hjælp af en elektroporator. Tør den resterende gel af på overfladen med en køkkenrulle. Fjern insektstifter og hold de behandlede larver på en våd køkkenrulle i ca. en dag til nyttiggørelse.
Dernæst viser vi RNAi-protokollen rettet mod brystkassen på en damselfly, Ischnura senegalensis. Efter iskold anæstesi vedhæfte to stifter på begge sider af prothorax og fastgør larver til en fast stand. Træk og stræk den intersegmentale membran mellem prothorax og synthorax ved hjælp af hånd.
Sæt spidsen af den forberedte kapillær ind i den strakte intersegmentale membran. Injicer en mikroliter siRNA- eller dsRNA-opløsning. Påfør to dråber ultralydgel på larvens overflade ved hjælp af scef.
Placer elektroder på ultralyd gel, med en positiv elektrode på siden af injektion. Generer 10 gange elektroporationsimpulser ved hjælp af en elektroprolator. Tør den resterende gel af på overfladen med en køkkenrulle.
Fjern insektstifter og hold de behandlede larver på en våd køkkenrulle i ca. en dag til nyttiggørelse. Som en repræsentativ guldsmed arter, vi bruger Pied skimmer guldsmed. Pseudothemis zonata.
Dette er en af de mest almindelige guldsmed arter og ofte findes i skyggefulde damme i Japan. Endelig viser vi RNI-protokollen rettet mod maven af en guldsmed, Pseudothemis zonata. Stræk den intersegmentale membran mellem det fjerde og femte abdominale segment.
Lav et lille hul med en fin nål mellem den fjerde og femte abdominal segment. Sæt spidsen af den forberedte kapillær ind i det forberedte hul. Injicer en mikroliter siRNA- eller dsRNA-opløsning.
Fastgør larverne til en fast stand ved hjælp af stifter. Påfør to dråber ultralydgel på larveoverfladen ved hjælp af sniver. Placer elektroder på ultralydgelen med den positive elektrode på siden af injektionen.
Generer 10 gange elektroporationsimpulser ved hjælp af en elektroporator. Tør den resterende gel af på overfladen med en køkkenrulle. Fjern insektstifter og hold de behandlede larver på en våd køkkenrulle i ca. en dag til nyttiggørelse.
Her valgte vi et melaninsyntesegen MCO2 som målgenet og EGFP eller bla som et negativt kontrolmål. MCO2 er afgørende for den sorte farve dannelse i forskellige insekter. Først viser vi resultaterne i maven af Ischnura senegalensis.
Hvide pilespidser angiver de områder af undertrykt sort pigmentering, hvor den positive elektrode blev placeret på elektroporation. Inkubation af pigmentering blev observeret både ved siRNA-behandling og dsRNA-behandling. Størrelsen og placeringen af RNI fænotype varierede betydeligt blandt enkeltpersoner.
Uden elektroporation blev der ikke observeret RNI fænotyper, hvilket indikerer, at elektroporation er afgørende for RNI hos denne art. Dernæst viser vi resultaterne i brystkassen af Ischnura senegalensis. Tilsvarende hæmning af sort pigmentering blev observeret omkring regionen, hvor den positive elektrode blev placeret på elektroporation.
Endelig viser vi resultaterne i maven af Pseudothemis zonata. Som forventet blev RNI fænotypen påvist omkring den region, hvor den positive elektrode blev placeret ved elektroporation. Vi bekræfter, at den elektroproration-medieret RNAi metode er meget nyttig i Odonata.
Det kan fremkalde lokal genundertrykkelse næsten 100% effektivitet. I hvert fald i epidermis, når vi vælger passende udviklingsstadier. Denne metode har flere over CRISPR/Cas9-metoden.
For eksempel kan den region, hvor RNAi fænotyper vises, styres af placeringen af den positive elektrode ved elektrokation, og RNA fænotyper kan nemt sammenlignes med kontrol fænotyper side om side i samme person. Desuden er denne metode ikke kræver mikroinjektion i bittesmå æg. Så det er meget nemmere og hurtigere at observere fænotypen hurtigere end CRISPR/Cas9-metoden.
Desuden kan denne metode anvendes på insekter, hvis nylagte æg er vanskelige at indsamle. For eksempel, hunner af Pseudothemis zonata lægge æg under flyvningen. Så det er meget vanskeligt at samle deres nylagte æg.
Vi forventer, at denne protokol kan være generelt anvendelig for ikke-model organismer, når den konventionelle RNI ikke fungerer effektivt.