यह ओडोनाटा में इलेक्ट्रोपॉनेशन-मध्यस्थता आरएनए हस्तक्षेप विधि के लिए एक वीडियो प्रोटोकॉल है। ड्रैगनफ्लियों और डैमफ्लियों, ऑर्डर ओडोनाटा के सदस्य, सबसे पुश्तैनी कीड़ों में से हैं। वयस्क ओडोनाटा शरीर के रंगों और पैटर्न में उल्लेखनीय विविधता दिखाते हैं, और कई पारिस्थितिक और व्यवहार अध्ययन किए गए हैं।
हालांकि, ओडोनाटा पर आणविक आनुवंशिक अध्ययनों की कमी रही है, क्योंकि जीन कार्यात्मक विश्लेषण बहुत मुश्किल है । उदाहरण के लिए, पारंपरिक आरएनएआई विधि ओडोनाटा प्रजातियों में प्रभावी नहीं है। हाल ही में, हमने वीवो इलेक्ट्रोपाउशन के संयोजन में एक आरएनएम विधि स्थापित की।
यहां, हम ड्रैगनफ्लियों और डैमेफ्लियों दोनों में इलेक्ट्रोपॉरेशन-मध्यस्थता आरएनएआई के लिए एक वीडियो प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। हमारे प्रतिनिधि के रूप में प्रजातियों हम नीले पूंछ damselfly का उपयोग करें । इस्चनुरा सेनेगल।
यह सबसे आम डैमशील्फी प्रजातियों में से एक है और अक्सर जापान में धूप तालाबों में पाया जाता है। सबसे पहले, हम आरएनएआई प्रोटोकॉल को एक डैमसेल्फली, इस्चनुरा सेनेगल के पेट को लक्षित करते हुए दिखाते हैं। प्रोथोरैक्स के दोनों किनारों पर उस दो पिन पर बर्फ-ठंड संज्ञाहरण के बाद और लार्वा को एक निश्चित स्टैंड पर ठीक करें।
संदंश का उपयोग करके सातवें और आठवें पेट खंड के बीच अंतर-खंडीय झिल्ली को खींचें और फैलाइए। अंतर-खंडीय झिल्ली को हाथ से फैलाए रखें। तैयार केशिका की नोक को फैला हुआ इंटरसगमेंटल झिल्ली में डालें।
सिरना या dsRNA समाधान के 1 माइक्रोलीटर इंजेक्ट करें। संदंश का उपयोग कर लार्वा सतह पर अल्ट्रासाउंड जेल की दो बूंदों को लागू करें। अल्ट्रासाउंड जेल पर इलेक्ट्रोड रखें, इंजेक्शन के किनारे पर सकारात्मक इलेक्ट्रोड के साथ।
इलेक्ट्रोपोरेटर का उपयोग करके 10 गुना इलेक्ट्रोपोरेशन दालें उत्पन्न करें। एक पेपरटोवेल के साथ सतह पर शेष जेल को मिटा दें। कीट पिन निकालें और वसूली के लिए लगभग एक दिन के लिए एक गीले कागज तौलिया पर इलाज लार्वा रखें।
इसके बाद, हम आरएनएआई प्रोटोकॉल को एक डैमसेल्फली, इस्चनुरा सेनेगल के छाती को लक्षित करते हुए दिखाते हैं। बर्फ-ठंड संज्ञाहरण के बाद प्रोथोरेक्स के दोनों किनारों पर दो पिन संलग्न करते हैं और लार्वा को एक निश्चित स्टैंड पर ठीक करते हैं। हाथ का उपयोग करके प्रोथोरेक्स और सिंथोरेक्स के बीच इंटरसगमेंटल झिल्ली को खींचें और फैलाएं।
तैयार केशिका की नोक को फैला हुआ इंटरसगमेंटल झिल्ली में डालें। सिरना या dsRNA समाधान के एक माइक्रोलीटर इंजेक्ट करें। संदंश का उपयोग करके लार्वा की सतह पर अल्ट्रासाउंड जेल की दो बूंदों को लागू करें।
इंजेक्शन के किनारे पर एक सकारात्मक इलेक्ट्रोड के साथ, अल्ट्रासाउंड जेल पर इलेक्ट्रोड रखें। इलेक्ट्रोप्रोलेटर का उपयोग करके 10 गुना इलेक्ट्रोपॉरेशन दालें उत्पन्न करें। एक पेपरटोवेल के साथ सतह पर शेष जेल को मिटा दें।
कीट पिन निकालें और वसूली के लिए लगभग एक दिन के लिए एक गीले कागज तौलिया पर इलाज लार्वा रखें। एक प्रतिनिधि ड्रैगनफ्लाई प्रजातियों के रूप में हम पिद स्किमर ड्रैगनफ्लाई का उपयोग करते हैं। छद्मथेइस ज़ोनटा।
यह सबसे आम ड्रैगनफ्लाई प्रजातियों में से एक है और अक्सर जापान में छायादार तालाबों में पाया जाता है। अंत में, हम आरएनआई प्रोटोकॉल को ड्रैगनफ्लाई, स्यूडोथेमिस ज़ोनाटा के पेट को लक्षित करते हुए दिखाते हैं। चौथे और पांचवें पेट खंड के बीच इंटरसगमेंटल झिल्ली को फैलाएं।
चौथे और पांचवें पेट के खंड के बीच एक ठीक सुई के साथ एक छोटा सा छेद बनाओ। तैयार केशिका की नोक को तैयार छेद में डालें। सिरना या dsRNA समाधान के एक माइक्रोलीटर इंजेक्ट करें।
पिन का उपयोग करके लार्वा को एक निश्चित स्टैंड पर ठीक करें। संदंश का उपयोग कर लार्वा सतह पर अल्ट्रासाउंड जेल की दो बूंदों को लागू करें। इंजेक्शन के किनारे पर सकारात्मक इलेक्ट्रोड के साथ अल्ट्रासाउंड जेल पर इलेक्ट्रोड रखें।
इलेक्ट्रोपोरेटर का उपयोग करके 10 गुना इलेक्ट्रोपोरेशन दालें उत्पन्न करें। एक पेपरटोवेल के साथ सतह पर शेष जेल को मिटा दें। कीट पिन निकालें और वसूली के लिए लगभग एक दिन के लिए एक गीले कागज तौलिया पर इलाज लार्वा रखें।
यहां हमने एक मेलेनिन संश्लेषण जीन MCO2 को लक्ष्य जीन के रूप में चुना, और एक नकारात्मक नियंत्रण लक्ष्य के रूप में ईजीएफपी या बला। विभिन्न कीड़ों में काले रंग के गठन के लिए MCO2 आवश्यक है। सबसे पहले हम इस्चनुरा सेनेगल के पेट में परिणाम दिखाते हैं।
सफेद एरोहेड दबे हुए काले पिगमेंटेशन के क्षेत्रों को इंगित करते हैं जहां सकारात्मक इलेक्ट्रोड को इलेक्ट्रोपाउनेशन पर रखा गया था। सिआरएनए उपचार और डीएसआरएनए उपचार दोनों द्वारा पिगमेंटेशन की इनक्यूबेशन देखी गई। आरएनआई फेनोटाइप का आकार और स्थान व्यक्तियों के बीच काफी भिन्न था।
इलेक्ट्रोपॉनेशन के बिना कोई आरएनआई फेनोटाइप नहीं देखा गया, यह दर्शाता है कि इस प्रजाति में आरएनआई के लिए इलेक्ट्रोपॉनेशन आवश्यक है। इसके बाद, हम इस्चनुरा सेनेगल के छाती में परिणाम दिखाते हैं। इसी प्रकार उस क्षेत्र के चारों ओर काले पिगमेंटेशन का अवरोध देखा गया जहां सकारात्मक इलेक्ट्रोड को इलेक्ट्रोपाउशन पर रखा गया था।
अंत में, हम छद्मथेमिक ज़ोनाटा के पेट में परिणाम दिखाते हैं। जैसा कि अपेक्षित था, आरएनआई फेनोटाइप को उस क्षेत्र के आसपास पाया गया जहां सकारात्मक इलेक्ट्रोड को इलेक्ट्रोपॉशन पर रखा गया था। हम इस बात की पुष्टि करते हैं कि ओडोनाटा में इलेक्ट्रोप्रोप्रेशन-मध्यस्थता-मध्यस्थता आरएनएआई विधि बहुत उपयोगी है।
यह स्थानीय जीन दमन लगभग १००% दक्षता प्रेरित कर सकते हैं । कम से कम एपिडर्मिस में, जब हम उचित विकास के चरणों का चयन करते हैं। इस विधि में CRISPR/Cas9 विधि पर कई हैं।
उदाहरण के लिए, जिस क्षेत्र में आरएनएआई फेनोटाइप्स दिखाई देते हैं, उसे विद्युतीकरण पर सकारात्मक इलेक्ट्रोडी की स्थिति द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है, और आरएनए फेनोटाइप की तुलना एक ही व्यक्ति में साथ-साथ नियंत्रण फेनोटाइप के साथ की जा सकती है। इसके अलावा, इस विधि को छोटे अंडों में माइक्रोइंजेक्शन की आवश्यकता नहीं होती है। इसलिए CRISPR/Cas9 विधि की तुलना में फेनोटाइप का तेजी से निरीक्षण करना बहुत आसान और तेज है ।
इसके अलावा, इस विधि को उन कीड़ों पर लागू किया जा सकता है जिनके नए रखे अंडे इकट्ठा करना मुश्किल है। उदाहरण के लिए, स्यूडोथेइस ज़ोनाटा की महिलाएं उड़ान के दौरान अंडे डालती हैं। इसलिए उनके नए रखे अंडों को इकट्ठा करना बहुत मुश्किल है।
हम उम्मीद करते हैं कि यह प्रोटोकॉल आम तौर पर गैर-मॉडल जीवों पर लागू हो सकता है जब पारंपरिक आरएनआई कुशलता से काम नहीं करता है।