これは、オドナタにおけるエレクトロポレーション媒介性RNA干渉法のビデオプロトコルです。トンボとダムリー、オーダーオドナタのメンバーは、最も先祖の昆虫の一つです。成人のオドナタは、身体の色やパターンに顕著な多様性を示し、多くの生態学的および行動的研究が行われている。
しかし、遺伝子機能解析が非常に困難であるため、オドナタに関する分子遺伝学的研究は欠けている。例えば、従来のRNAi法は、オドナタ種には有効ではない。近年、生体内エレクトロポレーションと組み合わせてRNM法を確立した。
ここでは、トンボとダムリーの両方でエレクトロポレーション媒介RNAiのビデオプロトコルを提供します。私たちの代表的なダムリー種として、私たちは青い尾のダムを自分で使用します。イシュヌラ・セネガル人症。
これは、最も一般的なダム種の一つであり、しばしば日本の日当たりの良い池で見られます。まず、ダムナリーのイシュヌラ・セネガル人の腹部を標的とするRNAiプロトコルを示す。耳鼻咽喉の両側の2本のピンで氷冷麻酔の後、幼虫を固定したスタンドに固定します。
鉗子を使用して、7番目と8番目の腹部セグメントの間のセグメント間膜を引っ張って伸ばします。セグメント間膜を手で伸ばしたままにします。準備した毛細管の先端を伸ばしたセグメント間膜に挿入します。
1マイクロリットルのsiRNAまたはdsRNA溶液を注入する。鉗子を使用して幼虫表面に超音波ゲルの2つの液滴を適用します。超音波ゲルに電極を置き、射出の側面に正極を置きます。
エレクトロポレーターを使用して10回のエレクトロポレーションパルスを生成します。表面の残りのゲルをペーパータオルで拭き取ります。虫のピンを外し、治療した幼虫を濡れたペーパータオルの上に約1日保管して回復します。
次に、ダムの胸郭を標的とするRNAiプロトコル、イシュヌラ・セネガルンシスを示す。氷冷麻酔後、前走の両側に2本のピンを取り付け、幼虫を固定したスタンドに固定します。手でプロソラックスとシンソラックスの間のセグメント間膜を引っ張って伸ばします。
準備した毛細管の先端を伸ばしたセグメント間膜に挿入します。1マイクロリットルのsiRNAまたはdsRNA溶液を注入する。鉗子を使用して幼虫の表面に超音波ゲルの2つの液滴を適用します。
超音波ゲルに電極を置き、注射の側面に正極を置きます。エレクトロプロレータを使用して10回のエレクトロポレーションパルスを生成します。表面の残りのゲルをペーパータオルで拭き取ります。
虫のピンを外し、治療した幼虫を濡れたペーパータオルの上に約1日保管して回復します。代表的なトンボ種として、パイドスキマートンボを使用しています。擬偽数ゾナタ.
これは最も一般的なトンボ種の一つであり、日本の砂の池によく見られます。最後に、トンボの腹部を標的とするRNIプロトコル、擬似語学ゾナータを示す。第4腹部と第5の腹部セグメントの間にセグメント間膜を伸ばします。
第4と第5の腹部セグメントの間に細かい針で小さな穴を作ります。準備した毛細管の先端を準備した穴に差し込みます。1マイクロリットルのsiRNAまたはdsRNA溶液を注入する。
幼虫をピンで固定したスタンドに固定します。鉗子を使用して幼虫表面に超音波ゲルの2つの液滴を適用します。射出の側面の正極と超音波ゲルの上に電極を置きます。
エレクトロポレーターを使用して10回のエレクトロポレーションパルスを生成します。表面の残りのゲルをペーパータオルで拭き取ります。虫のピンを外し、治療した幼虫を濡れたペーパータオルの上に約1日保管して回復します。
ここでは、メラニン合成遺伝子MCO2を標的遺伝子として、EGFPまたはblaを陰性対照標的として選択した。MCO2は、様々な昆虫の黒色形成に不可欠です。まず、イシュヌラ・セネガルの腹部に結果を示す。
白い矢印は、エレクトロポレーション時に正極が配置された抑制された黒色素沈着の領域を示す。色素沈着のインキュベーションは、siRNA処理およびdsRNA処理の両方によって観察された。RNI表現型の大きさと位置は、個人間で大きく異なった。
エレクトロポレーションを行わない場合にはRNIのフェノタイプは認められず、この種ではRNIにエレクトロポレーションが必須であることを示す。次に、イシュヌラ・セネガルの胸郭に結果を示す。同様に、エレクトロポレーション時に正極が配置された領域の周辺でも黒色素沈着の阻害が認められた。
最後に、擬似学の腹部の腹部に結果を示す。予想通り、正極がエレクトロポレーション時に配置された領域の周囲にRNI表現型が検出された。電解媒介性RNAi法がオドナタで非常に有用であることを確認する。
それは、局地的な遺伝子抑制をほぼ100%効率で誘導することができる。少なくとも表皮では、適切な発達段階を選択する場合。この方法は、CRISPR/Cas9メソッドに対して複数の方法を持っています。
例えば、RNAiの表型が現れる領域は、電化時の正極の位置によって制御することができ、RNAの型は同じ個体中の対照フェノタイプと並んで簡単に比較することができる。さらに、この方法は、小さな卵にマイクロインジェクションを必要としません。したがって、CRISPR/Cas9法よりも速く表現型を観察する方がはるかに簡単で速いです。
さらに、この方法は、新たに産卵した卵を採取することが困難な昆虫に適用することができる。例えば、擬似人数ゾナタの雌は飛行中に卵を産む。だから、彼らの新しく産んだ卵を収集することは非常に困難です。
我々は、従来のRNIが効率的に動作しない場合、このプロトコルは、一般的に非モデル生物に適用可能である可能性があることを期待する。
