이것은 오도나타에서 전기 포기 중재 RNA 간섭 방법을 위한 비디오 프로토콜입니다. 드래곤플라이와 댐셀프, 오도나타 계급의 구성원은 가장 조상 곤충 중 하나입니다. 성인 오도나타는 신체 색상과 패턴의 놀라운 다양성을 보여주며 많은 생태 및 행동 연구가 수행되었습니다.
그러나, 오도나타에 대한 분자 유전 연구는 유전자 기능 분석이 매우 어렵기 때문에 부족했습니다. 예를 들어, 종래의 RNAi 방법은 오도나타 종에서 효과적이지 않다. 최근에는 생체 내 전기포화와 함께 RNM 방법을 확립했습니다.
여기서는 잠자리와 담셀프 모두에서 전기기 매개 RNAi에 대한 비디오 프로토콜을 제공합니다. 우리의 대표적인 댐셀프 종으로서 우리는 청색 꼬리를 스스로 사용합니다. 이쉬누라 세네갈렌시스.
이것은 일본에서 햇볕이 잘 드는 연못에서 흔히 발견되는 가장 흔한 담수 종 중 하나입니다. 첫째, 우리는 저주, 이쇠 누라 세네갈렌시스의 복부를 대상으로 RNAi 프로토콜을 보여줍니다. 프로토랙스 양쪽에 있는 두 개의 핀에서 얼음이 차가운 마취 후 유충을 고정 된 스탠드에 고정하십시오.
집게를 사용하여 일곱 번째와 여덟 번째 복부 세그먼트 사이 세그먼트 간 막을 당기고 스트레칭합니다. 세그먼트 간 멤브레인을 손으로 길게 유지합니다. 준비된 모세관의 끝을 뻗은 세그먼트 간 막에 삽입합니다.
siRNA 또는 dsRNA 용액의 마이크로리터 1을 주입하십시오. 포셉을 사용하여 애벌레 표면에 초음파 젤 두 방울을 바하십시오. 주사 측에 양극을 장착한 초음파 젤에 전극을 놓습니다.
전기포로이터를 사용하여 10배의 전기포이션 펄스를 생성합니다. 지과건으로 표면에 남은 젤을 닦아냅니다. 곤충 핀을 제거하고 치료를 젖은 종이 타월에 보관하여 회복을 위해 약 1일 동안 보관하십시오.
다음으로, 우리는 저주의 흉부, 이쉬누라 세네갈렌시스를 대상으로 RNAi 프로토콜을 보여줍니다. 얼음차가운 마취 후 프로토랙스 양쪽에 두 개의 핀을 부착하고 유충을 고정 스탠드에 고정시합니다. 손으로 프로토락스와 신디사이지 막을 당기고 스트레칭합니다.
준비된 모세관의 끝을 뻗은 세그먼트 간 막에 삽입합니다. siRNA 또는 dsRNA 용액의 마이크로리터 1개를 주입하십시오. 집게를 사용하여 유충 표면에 초음파 젤 두 방울을 바하십시오.
주사 측에 양극이 있는 초음파 젤에 전극을 놓습니다. 전기 프로레이터를 사용하여 10 배 의 전기 포기 펄스를 생성합니다. 지과건으로 표면에 남은 젤을 닦아냅니다.
곤충 핀을 제거하고 치료를 젖은 종이 타월에 보관하여 회복을 위해 약 1일 동안 보관하십시오. 대표적인 잠자리 종으로 우리는 Pied 스키머 잠자리를 사용합니다. 의사 성테마즈 조나타.
이것은 일본에서 그늘진 연못에서 종종 발견되는 가장 일반적인 잠자리 종 중 하나입니다. 마지막으로, 우리는 잠자리, 의사 성 소나타의 복부를 대상으로 RNI 프로토콜을 보여줍니다. 네 번째와 다섯 번째 복부 세그먼트 사이의 세그먼트 간 막을 스트레칭.
네 번째와 다섯 번째 복부 세그먼트 사이에 미세 한 바늘로 작은 구멍을 확인합니다. 준비된 모세관의 끝을 준비된 구멍에 삽입합니다. siRNA 또는 dsRNA 용액의 마이크로리터 1개를 주입하십시오.
핀을 사용하여 유충을 고정 스탠드에 고정합니다. 포셉을 사용하여 애벌레 표면에 초음파 젤 두 방울을 바하십시오. 주사 측에 양극이 있는 초음파 젤에 전극을 놓습니다.
전기포로이터를 사용하여 10배의 전기포이션 펄스를 생성합니다. 지과건으로 표면에 남은 젤을 닦아냅니다. 곤충 핀을 제거하고 치료를 젖은 종이 타월에 보관하여 회복을 위해 약 1일 동안 보관하십시오.
여기서 우리는 멜라닌 합성 유전자 MCO2를 표적 유전자로서, 및 EGFP 또는 블라를 음성 대조군 표적으로 선택하였다. MCO2는 다양한 곤충의 검은 색 형성에 필수적입니다. 먼저 우리는 이쉬누라 세네갈렌시스의 복부에 있는 결과를 보여줍니다.
백색 화살촉은 양극이 전기포레이션에 배치된 억압된 검정색 색소침착의 영역을 나타낸다. 색소 침착의 배양은 siRNA 치료 및 dsRNA 치료에 의해 모두 관찰되었다. RNI 표현형의 크기와 위치는 개인들 사이에서 상당히 다양했다.
전기기분기 없이 RNI 표현형이 관찰되지 않았으며, 이는 이 종에서 RNI에 전기포기가 필수적임을 나타냅니다. 다음으로, 우리는 이쉬누라 세네갈렌시스의 흉부에서 결과를 보여줍니다. 마찬가지로 검정색 색소침착의 억제는 양성 전극이 전기포화에 배치된 영역 의 주위에 관찰되었다.
마지막으로, 우리는 의사 근성 조나타의 복부에 있는 결과를 보여줍니다. 예상대로, RNI 표현형은 양극이 전기포화에 배치된 지역 주변에서 검출되었다. 우리는 전기 매개 RNAi 방법이 오도나타에서 매우 유용하다는 것을 확인합니다.
그것은 거의 100% 효율성을 현지 유전자 억제를 유도할 수 있습니다. 적어도 표피에서 적절한 발달 단계를 선택할 때. 이 메서드에는 CRISPR/Cas9 메서드에 대한 몇 가지 방법이 있습니다.
예를 들어, RNAi 표현형이 나타나는 영역은 전기전경에 양전극의 위치에 의해 조절될 수 있으며, RNA 표현형은 동일한 개인에서 나란히 대조되는 표현형과 쉽게 비교할 수 있다. 또한,이 방법은 작은 계란에 미세 주입을 필요로하지 않습니다. 따라서 CRISPR/Cas9 방법보다 표현형을 더 빠르게 관찰하는 것이 훨씬 쉽고 빠릅니다.
또한, 이 방법은 새로 낳은 알을 수집하기 어려운 곤충에 적용될 수 있습니다. 예를 들어, 의사 성 중의 암컷은 비행 중에 알을 낳습니다. 그래서 새로 낳은 알을 수집하는 것은 매우 어렵습니다.
우리는 이 프로토콜이 통상적인 RNI가 효율적으로 작동하지 않을 때 비모델 유기체에 일반적으로 적용될 수 있기를 기대합니다.
