Dette er en videoprotokoll for elektroporasjonsmediert RNA interferensmetode i Odonata. Dragonflies og damselflies, medlemmer av ordenen Odonata, er blant de mest forfedrenes insekter. Voksen Odonata viser et bemerkelsesverdig mangfold i kroppsfarger og mønstre, og mange økologiske og atferdsstudier har blitt utført.
Molekylære genetiske studier på Odonata har imidlertid manglet, fordi genfunksjonell analyse er svært vanskelig. For eksempel er den konvensjonelle RNAi-metoden ikke effektiv i Odonata-arter. Nylig etablerte vi en RNM-metode i kombinasjon med in vivo elektroporasjon.
Her gir vi en videoprotokoll for elektroporasjonsmedierte RNAi i både øyenstikkere og damselflies. Som vår representative damselflies arter bruker vi blå-tailed damselfly. Ischnura senegalensis.
Dette er en av de vanligste damselfly arter og ofte funnet i solfylte dammer i Japan. Først viser vi RNAi-protokollen rettet mot magen til en damselfly, Ischnura senegalensis. Etter iskald anestesi på at to pinner på begge sider av prothoraxen og fest larven til et fast stativ.
Trekk og strekk den intersegmentale membranen mellom det syvende og åttende buksegmentet ved hjelp av tang. Hold intersegmental membran strukket for hånd. Sett spissen av den tilberedte kapillæren inn i den strukket intersegmentale membranen.
Injiser 1 mikroliter siRNA- eller dsRNA-oppløsning. Påfør to dråper ultralydgel på larvaloverflaten ved hjelp av tang. Plasser elektroder på ultralydgelen, med den positive elektroden på siden av injeksjonen.
Generer 10 ganger elektroporasjonspulser ved hjelp av en elektroporator. Tørk av den gjenværende gelen på overflaten med en papirhåndkle. Fjern insektpinner og hold de behandlede larver på et vått papirhåndkle i omtrent en dag for gjenoppretting.
Deretter viser vi RNAi-protokollen rettet mot thoraxen til en damselfly, Ischnura senegalensis. Etter iskald anestesi feste to pinner på begge sider av prothoraxen og fest larven til et fast stativ. Trekk og strekk den intersegmentale membranen mellom prothoraxen og synthoraxen med hånden.
Sett spissen av den tilberedte kapillæren inn i den strukket intersegmentale membranen. Injiser ett mikroliter siRNA- eller dsRNA-oppløsning. Påfør to dråper ultralydgel på larvens overflate ved hjelp av tang.
Plasser elektroder på ultralydgelen, med en positiv elektrode på injeksjonssiden. Generer 10 ganger elektroporasjonspulser ved hjelp av en elektroprolator. Tørk av den gjenværende gelen på overflaten med en papirhåndkle.
Fjern insektpinner og hold de behandlede larver på et vått papirhåndkle i omtrent en dag for gjenoppretting. Som en representativ dragonfly arter bruker vi Pied skimmer dragonfly. Pseudothemis zonata.
Dette er en av de vanligste dragonfly arter og ofte funnet i skyggefulle dammer i Japan. Til slutt viser vi RNI-protokollen rettet mot magen til en øyenstikker, Pseudothemis zonata. Strekk intersegmental membran mellom fjerde og femte abdominalsegment.
Lag et lite hull med en fin nål mellom fjerde og femte abdominal segment. Sett spissen av det tilberedte kapillæret inn i det tilberedte hullet. Injiser ett mikroliter siRNA- eller dsRNA-oppløsning.
Fest larven til et fast stativ ved hjelp av pinner. Påfør to dråper ultralydgel på larvaloverflaten ved hjelp av tang. Plasser elektroder på ultralydgelen med den positive elektroden på siden av injeksjonen.
Generer 10 ganger elektroporasjonspulser ved hjelp av en elektroporator. Tørk av den gjenværende gelen på overflaten med en papirhåndkle. Fjern insektpinner og hold de behandlede larver på et vått papirhåndkle i omtrent en dag for gjenoppretting.
Her valgte vi et melaninsyntesegen MCO2 som målgen, og EGFP eller bla som et negativt kontrollmål. MCO2 er avgjørende for den svarte fargedannelsen i ulike insekter. Først viser vi resultatene i magen av Ischnura senegalensis.
Hvite pilspisser indikerer områdene med undertrykt svart pigmentering der den positive elektroden ble plassert ved elektroporasjon. Inkubasjon av pigmentering ble observert både ved behandling med siRNA og dsRNA-behandling. Størrelsen og plasseringen av RNI fenotypen varierte betydelig blant individer.
Uten elektroporasjon ble det ikke observert RNI fenotyper, noe som indikerer at elektroporasjon er avgjørende for RNI i denne arten. Deretter viser vi resultatene i thorax av Ischnura senegalensis. Tilsvarende hemming av svart pigmentering ble observert rundt i regionen der den positive elektroden ble plassert ved elektroporasjon.
Til slutt viser vi resultatene i magen til Pseudothemis zonata. Som forventet ble RNI fenotypen oppdaget rundt i regionen der den positive elektroden ble plassert ved elektroporasjon. Vi bekrefter at elektroprorasjonsmediert RNAi-metoden er svært nyttig i Odonata.
Det kan indusere lokal genundertrykkelse nesten 100%effektivitet. I hvert fall i epidermis, når vi velger passende utviklingsstadier. Denne metoden har flere over CRISPR/Cas9-metoden.
For eksempel kan regionen der RNAi fenotypene vises, kontrolleres av posisjonen til den positive elektroden ved elektrering, og RNA fenotypene kan enkelt sammenlignes med kontrollfenotypene side om side i samme individ. Videre krever denne metoden ikke mikroinjeksjon i små egg. Så det er mye enklere og raskere å observere fenotypen raskere enn CRISPR/Cas9-metoden.
Videre kan denne metoden brukes på insekter hvis nylagte egg er vanskelige å samle. For eksempel legger kvinner av Pseudothemis zonata egg under flyturen. Så det er veldig vanskelig å samle sine nylagte egg.
Vi forventer at denne protokollen generelt kan gjelde for ikke-modellorganismer når den konvensjonelle RNI ikke fungerer effektivt.