Detta är ett videoprotokoll för elektroporationsmedierad RNA-interferensmetod i Odonata. Trollsländor och damselflies, medlemmar av ordningen Odonata, är bland de mest förfädernas insekter. Vuxen Odonata visar en anmärkningsvärd mångfald i kroppens färger och mönster, och många ekologiska och beteendemässiga studier har genomförts.
Molekylärgenetiska studier på Odonata har dock saknats, eftersom genfunktionalanalys är mycket svårt. Till exempel är den konventionella RNAi-metoden inte effektiv i Odonata arter. Nyligen etablerade vi en RNM-metod i kombination med in vivo elektroporation.
Här tillhandahåller vi ett videoprotokoll för den elektroporationsmedierade RNAi i både trollsländor och damselflies. Som vår representativa damselflies arter vi använder den blåstjärtade damselfly. Ischnura senegalensis.
Detta är en av de vanligaste damselfly arter och ofta finns i soliga dammar i Japan. Först visar vi RNAi protokollet riktar buken av en damselfly, Ischnura senegalensis. Efter iskall anestesi vid att två stift på båda sidor av prothorax och fixera larven till ett fast stativ.
Dra och sträcka mellansegmentemembranet mellan den sjunde och åttonde buken segmentet med hjälp av tänjningar. Håll det intersegmentella membranet sträckt för hand. Sätt in spetsen på den förberedda kapillären i det sträckta intersegmentala membranet.
Injicera 1 mikroliter siRNA- eller dsRNA-lösning. Applicera två droppar av ultraljudsgel på larvytan med hjälp av kraftpenser. Placera elektroder på ultraljudsgelen, med den positiva elektroden på injektionens sida.
Generera 10 gånger elektroporationspulser med hjälp av en elektroporator. Torka bort den återstående gelén på ytan med en pappersstål. Ta bort insektsstift och håll de behandlade larverna på en våt pappershandduk i ungefär en dag för återhämtning.
Därefter visar vi RNAi-protokollet som riktar sig mot bröstkorgen i en damselfly, Ischnura senegalensis. Efter iskall anestesi fäst två stift på båda sidor av prothorax och fixera larven till ett fast stativ. Dra och sträck det intersegmentala membranet mellan prothorax och synthorax med hjälp av hand.
Sätt in spetsen på den förberedda kapillären i det sträckta intersegmentala membranet. Injicera en mikroliter av siRNA- eller dsRNA-lösning. Applicera två droppar av ultraljudsgel på larvens yta med hjälp av kraftpenser.
Placera elektroder på ultraljudsgelen, med en positiv elektrod på injektionens sida. Generera 10 gånger elektroporationspulser med hjälp av en elektroprolator. Torka bort den återstående gelén på ytan med en pappersstål.
Ta bort insektsstift och håll de behandlade larverna på en våt pappershandduk i ungefär en dag för återhämtning. Som en representativ trollslända arter vi använder Pied skimmer trollslända. Pseudothemis zonata.
Detta är en av de vanligaste trollslända arter och ofta finns i skuggiga dammar i Japan. Slutligen visar vi RNI-protokollet som riktar sig mot buken hos en trollslända, Pseudothemis zonata. Sträck det intersegmentala membranet mellan fjärde och femte buksegmentet.
Gör ett litet hål med en fin nål mellan fjärde och femte buksegmentet. För in spetsen på den förberedda kapillären i det förberedda hålet. Injicera en mikroliter av siRNA- eller dsRNA-lösning.
Fixera larven på ett fast stativ med hjälp av stift. Applicera två droppar av ultraljudsgel på larvytan med hjälp av kraftpenser. Placera elektroder på ultraljudsgelen med den positiva elektroden på injektionens sida.
Generera 10 gånger elektroporationspulser med hjälp av en elektroporator. Torka bort den återstående gelén på ytan med en pappersstål. Ta bort insektsstift och håll de behandlade larverna på en våt pappershandduk i ungefär en dag för återhämtning.
Här valde vi en melanin syntes gen MCO2 som målgen, och EGFP eller bla som en negativ kontroll mål. MCO2 är väsentligt för den svarta färgbildningen i olika insekter. Först visar vi resultaten i buken av Ischnura senegalensis.
Vita pilspetsar indikerar regionerna av undertryckta svart pigmentering där den positiva elektroden placerades på elektroporation. Inkubation av pigmentering observerades både genom siRNA behandling och dsRNA behandling. Storleken och placeringen av RNI fenotyp varierade avsevärt bland individer.
Utan electroporation inga RNI fenotyper observerades, vilket indikerar att electroporation är avgörande för RNI i denna art. Därefter visar vi resultaten i bröstkorgen i Ischnura senegalensis. Likarigt hämning av svart pigmentering observerades runt regionen där den positiva elektroden placerades på electroporation.
Slutligen visar vi resultaten i buken av Pseudothemis zonata. Som väntat upptäcktes RNI fenotyp runt regionen där den positiva elektroden placerades på electroporation. Vi bekräftar att den elektroproration-medierad RNAi metoden är mycket användbar i Odonata.
Det kan framkalla lokal gendämpning nästan 100%-effektivitet. Åtminstone i epidermis, när vi väljer lämpliga utvecklingsstadier. Denna metod har flera över CRISPR/Cas9 metoden.
Till exempel, den region där RNAi fenotyper visas kan styras av positionen för den positiva elektrod vid elektrporation, och RNA fenotyper kan lätt jämföras med kontroll fenotyper sida vid sida i samma individ. Dessutom kräver denna metod inte mikroinjektion i små ägg. Så det är mycket enklare och snabbare att observera fenotypen snabbare än CRISPR/Cas9-metoden.
Vidare kan denna metod tillämpas på insekter vars nylagda ägg är svåra att samla in. Till exempel, honor av Pseudothemis zonata lägga ägg under flygning. Så det är mycket svårt att samla sina nylagda ägg.
Vi förväntar oss att detta protokoll kan vara allmänt tillämpliga på icke-modell organismer när den konventionella RNI inte fungerar effektivt.