Name: isolation of high quality murine atrial and ventricular myocytes for simultaneous measurements of ca2+ transients and l-type calcium current
Uploaded: 2020-11-03T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door de German Research Foundation (DFG; Clinician Scientist Program In Vascular Medicine (PRIME), MA 2186/14-1 aan P. Tomsits en D. Schüttler; VO1568/3-1, IRTG1816 en SFB1002 project A13 tot N. Voigt), German Research Foundation under Germany's Excellence Strategy (EXC 2067/1- 390729940 to N. Voigt), German Centre for Cardiovascular Research (DZHK; 81X2600255 to S. Clauss and N. Voigt; 81Z0600206 to S. Kääb), the Corona Foundation (S199/10079/2019 to S. Clauss), the ERA-NET on Cardiovascular Diseases (ERA-CVD; 01KL1910 to S. Clauss), de Heinrich-and-Lotte-Mühlfenzl Stiftung (naar S. Clauss) en de Else-Kröner-Fresenius Stichting (EKFS 2016_A20 naar N. Voigt). De financiers hadden geen rol in de voorbereiding van het manuscript.

Alle dierprocedures zijn goedgekeurd door de Nedersaksische Animal Review Board (LAVES, AZ-18/2900) en werden uitgevoerd in overeenstemming met alle institutionele, nationale en internationale richtlijnen voor dierenwelzijn.
1. Voorregelingen
<ol><li>Bereid 1 l 10x perfusiebuffer (tabel 1), 500 ml 1x perfusiebuffer (tabel 2), 50 ml verteringsbuffer (tabel 3), 10 ml stopbuffer (tabel 4), 1 l Tyrode-oplossing (tabel 5), 10 ml ...

<ol>
	<li>Camm, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+management+of+atrial+fibrillation:+the+Task+force+for+the+management+of+atrial+fibrillation+of+the+European+Society+of+Cardiology+(ESC).">Guidelines for the management of atrial fibrillation: the Task force for the management of atrial fibrillation of the European Society of Cardiology (ESC).</a> Europace. 12 (10), 1360-1420 (2010).</li><li>Chugh, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Worldwide+epidemiology+of+atrial+fibrillation:+a+global+burden+of+disease+2010+study.">Worldwide epidemiology of atrial fibrillation: a global burden of disease 2010 study.</a> Circulation. 129 (8), 837-847 (2014).</li><li>Tonchev, I., Luria, D., Orenstein, D., Lotan, C., Biton, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=For+whom+the+bell+tolls+:+Refining+risk+assessment+for+sudden+cardiac+death.">For whom the bell tolls : Refining risk assessment for sudden cardiac death.</a> Current Cardiology Reports. 21 (9), 106 (2019).</li><li>Kirchhof, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2016+ESC+Guidelines+for+the+management+of+atrial+fibrillation+developed+in+collaboration+with+EACTS.">2016 ESC Guidelines for the management of atrial fibrillation developed in collaboration with EACTS.</a> European Heart Journal. 37 (38), 2893-2962 (2016).</li><li>Dobrev, D., Nattel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+antiarrhythmic+drugs+for+treatment+of+atrial+fibrillation.">New antiarrhythmic drugs for treatment of atrial fibrillation.</a> Lancet. 375 (9721), 1212-1223 (2010).</li><li>Heijman, J., Voigt, N., Carlsson, L. G., Dobrev, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+safety+assays.">Cardiac safety assays.</a> Current opinion in pharmacology. 15, 16-21 (2014).</li><li>Sch&#252;ttler, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+atrial+fibrillation.">Animal models of atrial fibrillation.</a> Circulation Research. 127 (1), 91-110 (2020).</li><li>Clauss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+arrhythmia:+classic+electrophysiology+to+genetically+modified+large+animals.">Animal models of arrhythmia: classic electrophysiology to genetically modified large animals.</a> Nature Reviews. Cardiology. 16 (8), 457-475 (2019).</li><li>Voigt, N., Pearman, C. M., Dobrev, D., Dibb, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+isolating+atrial+cells+from+large+mammals+and+humans.">Methods for isolating atrial cells from large mammals and humans.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 86, 187-198 (2015).</li><li>Jansen, H. J., Rose, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+atrial+myocytes+from+adult+mice.">Isolation of atrial myocytes from adult mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (149), e59588 (2019).</li><li>Blackwood, E. A., Bilal, A. S., Azizi, K., Sarakki, A., Glembotski, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+isolation+and+culture+of+atrial+myocytes,+ventricular+myocytes,+and+non-myocytes+from+an+adult+mouse+heart.">Simultaneous isolation and culture of atrial myocytes, ventricular myocytes, and non-myocytes from an adult mouse heart.</a> Journal of Visualized Experiments. (160), e61224 (2020).</li><li>Omatsu-Kanbe, M., Yoshioka, K., Fukunaga, R., Sagawa, H., Matsuura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+antegrade+perfusion+method+for+isolating+viable+single+cardiomyocytes+from+neonatal+to+aged+mice.">A simple antegrade perfusion method for isolating viable single cardiomyocytes from neonatal to aged mice.</a> Physiological Report. 6 (9), 13688 (2018).</li><li>K&#246;hncke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Kv+channel+recordings+in+murine+atrial+and+ventricular+cardiomyocytes.">Isolation and Kv channel recordings in murine atrial and ventricular cardiomyocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e50145 (2013).</li><li>Brandenburg, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axial+tubule+junctions+activate+atrial+Ca(2+)+release+across+species.">Axial tubule junctions activate atrial Ca(2+) release across species.</a> Frontiers in Physiology. 9, 1227 (2018).</li><li>Hofhuis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysferlin+links+excitation-contraction+coupling+to+structure+and+maintenance+of+the+cardiac+transverse-axial+tubule+system.">Dysferlin links excitation-contraction coupling to structure and maintenance of the cardiac transverse-axial tubule system.</a> Europace. 22 (7), 1119-1131 (2020).</li><li>Voigt, N., Zhou, X. B., Dobrev, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+human+atrial+myocytes+for+simultaneous+measurements+of+Ca2++transients+and+membrane+currents.">Isolation of human atrial myocytes for simultaneous measurements of Ca2+ transients and membrane currents.</a> Journal of Visualized Experiment. (77), e50235 (2013).</li><li>Voigt, N., Makary, S., Nattel, S., Dobrev, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-clamp-based+methods+for+the+detection+of+constitutively+active+acetylcholine-gated+I(K,ACh)+channels+in+the+diseased+heart.">Voltage-clamp-based methods for the detection of constitutively active acetylcholine-gated I(K,ACh) channels in the diseased heart.</a> Methods in Enzymology. 484, 653-675 (2010).</li><li>Voigt, N., Nattel, S., Dobrev, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proarrhythmic+atrial+calcium+cycling+in+the+diseased+heart.">Proarrhythmic atrial calcium cycling in the diseased heart.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 740, 1175-1191 (2012).</li><li>Trafford, A. W., D&#237;az, M. E., Eisner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel,+rapid+and+reversible+method+to+measure+Ca+buffering+and+time-course+of+total+sarcoplasmic+reticulum+Ca+content+in+cardiac+ventricular+myocytes.">A novel, rapid and reversible method to measure Ca buffering and time-course of total sarcoplasmic reticulum Ca content in cardiac ventricular myocytes.</a> Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 437 (3), 501-503 (1999).</li><li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+patch-clamp+techniques+for+high-resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches.">Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.</a> European Journal of Physiology. 391 (2), 85-100 (1981).</li><li>Voigt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+sarcoplasmic+reticulum+Ca2++leak+and+increased+Na+-Ca2++exchanger+function+underlie+delayed+afterdepolarizations+in+patients+with+chronic+atrial+fibrillation.">Enhanced sarcoplasmic reticulum Ca2+ leak and increased Na+-Ca2+ exchanger function underlie delayed afterdepolarizations in patients with chronic atrial fibrillation.</a> Circulation. 125 (17), 2059-2070 (2012).</li><li>Fakuade, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+atrial+cytosolic+calcium+handling+contributes+to+the+development+of+postoperative+atrial+fibrillation.">Altered atrial cytosolic calcium handling contributes to the development of postoperative atrial fibrillation.</a> Cardiovascular Research. , (2020).</li><li>Chen, W., Frangogiannis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+inflammatory+and+fibrogenic+pathways+in+heart+failure+associated+with+aging.">The role of inflammatory and fibrogenic pathways in heart failure associated with aging.</a> Heart Failure Reviews. 15 (5), 415-422 (2010).</li><li>Pla&#269;ki&#263;, J., Kocksk&#228;mper, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+atrial+and+ventricular+cardiomyocytes+for+in+vitro+studies.">Isolation of atrial and ventricular cardiomyocytes for in vitro studies.</a> Methods in Molecular Biology. 1816, 39-54 (2018).</li><li>D&#237;az, M. E., Trafford, A. W., Eisner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+exogenous+calcium+buffers+on+the+systolic+calcium+transient+in+rat+ventricular+myocytes.">The effects of exogenous calcium buffers on the systolic calcium transient in rat ventricular myocytes.</a> Biophysical Journal. 80 (4), 1915-1925 (2001).</li><li>Zimmerman, A. N., H&#252;lsmann, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paradoxical+influence+of+calcium+ions+on+the+permeability+of+the+cell+membranes+of+the+isolated+rat+heart.">Paradoxical influence of calcium ions on the permeability of the cell membranes of the isolated rat heart.</a> Nature. 211 (5049), 646-647 (1966).</li><li>Chen, X., O'Connell, T. D., Xiang, Y. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=With+or+without+Langendorff:+A+new+method+for+adult+myocyte+isolation+to+be+tested+with+time.">With or without Langendorff: A new method for adult myocyte isolation to be tested with time.</a> Circulation Research. 119 (8), 888-890 (2016).</li><li>Kappadan, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+optical+measurement+of+cardiac+restitution,+contraction,+and+fibrillation+dynamics+in+beating+vs.+blebbistatin-uncoupled+isolated+rabbit+hearts.">High-resolution optical measurement of cardiac restitution, contraction, and fibrillation dynamics in beating vs. blebbistatin-uncoupled isolated rabbit hearts.</a> Frontiers in Physiology. 11, 464 (2020).</li><li>Brack, K. E., Narang, R., Winter, J., Ng, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanical+uncoupler+blebbistatin+is+associated+with+significant+electrophysiological+effects+in+the+isolated+rabbit+heart.">The mechanical uncoupler blebbistatin is associated with significant electrophysiological effects in the isolated rabbit heart.</a> Experiment in Physiology. 98 (5), 1009-1027 (2013).</li><li>Seibertz, F., Reynolds, M., Voigt, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+optical+action+potential+measurement+in+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Single-cell optical action potential measurement in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Journal of Visual Experiment. , e61890 (2020).</li></ol>

Dit artikel biedt een eenvoudige en functionele manier om hoogwaardige atriale en ventriculaire myocyten van dezelfde muis te verkrijgen voor patch-clamp studies met gelijktijdige calcium transiënte opnames. De kwaliteit van de verkregen gegevens is sterk afhankelijk van de kwaliteit van de celisolatie. Zoals hierboven vermeld, zijn veel methoden om muizencardiomyocyten te isoleren eerder beschreven 9,10,11,12.<sup c...

Hartritmestoornissen komen vaak voor en zijn een van de huidige grote uitdagingen in de gezondheidszorg, omdat ze miljoenen mensen wereldwijd treffen. Aritmieën zijn geassocieerd met hoge morbiditeit en mortaliteit 1,2 en vormen de onderliggende oorzaak voor de meerderheid van plotselinge hartdoden3. Up-to-date behandelingsopties hebben de overleving van de patiënt verbeterd, maar zijn nog steeds voornamelijk symptomatische behandelingen in plaats van zich te richten op de onderliggende mechanismen. Deze behandelingen hebben dus een beperkte werkzaamheid en kunnen vaak ernstige bijwerkingen veroorzaken 4,5,6. Een verbetering van de huidige behandelingsopties vereist inzicht in de onderliggende pathofysiologie, waardoor de behoefte ontstaat aan geschikte modellen om te bestuderen. Kleine diermodellen - en met name muismodellen - spelen een cruciale rol in aritmieonderzoek omdat ze het mogelijk maken om belangrijke mechanismen van aritmogenese te bestuderen, bijvoorbeeld de genetische impact op cellulaire elektrofysiologie, ionkanaalfunctie of calciumbehandeling 7,8.
Voor dit doel zijn geïsoleerde atriale en ventriculaire cardiomyocyten van voldoende hoeveelheid en levensvatbaarheid vereist. Een breed spectrum van verschillende isolatiebenaderingen om atriale en ventriculaire myocyten te verkrijgen is eerder beschreven 9,10,11,12,13 en sommige groepen hebben gegevens gepresenteerd van gelijktijdige metingen van L-type stroom en calciumstroom geïnduceerde calciumtransiënten van atrium 14 of ventrikel 15 Muriene cardiomyocyten. Voor zover wij weten zijn er echter geen gegevens beschikbaar van zowel atriale als ventriculaire metingen van één dier. Onderzoekers richten zich op een breed scala aan onderwerpen, variërend van elektrofysiologie tot proteomica, functionele studies zoals celcontractiliteit of eiwitinteracties, mitochondriale functie of genetica - allemaal hebben ze behoefte aan geïsoleerde cardiomyocyten. Veel van de gepubliceerde protocollen zijn dus niet specifiek ontwikkeld voor patchklemstudies, wat leidt tot beperkte opbrengsten en onvoldoende celkwaliteit voor patchklemstudies. Gelijktijdige patchklem- en calciumtransiënte metingen van atriale en ventriculaire cellen geïsoleerd van één dier kunnen dus niet worden uitgevoerd met vastgestelde protocollen.
Isolatie van murine - vooral atriale - myocyten voor patchklemexperimenten blijft een uitdaging. Dit artikel biedt een eenvoudige en snelle methode voor de isolatie van hoogwaardige murine atriale en ventriculaire myocyten via retrograde enzymgebaseerde Langendorff-perfusie, die vervolgens gelijktijdige metingen van zowel netvliesstroom als stroomgeïnduceerde calciumtransiënten van één dier mogelijk maakt. Dit artikel werkt een protocol uit voor de isolatie van atriale en ventriculaire myocyten afgeleid van wild type muizen en muizen met genetische mutaties. Dit protocol kan worden gebruikt voor zowel mannelijke als vrouwelijke muizen. De myocytenisolatie, afbeeldingen en representatieve resultaten die hieronder worden beschreven, werden verkregen van wilde type C57Bl / 6-muizen op de leeftijd van 6 (± 1) maanden. Niettemin is dit protocol met succes gebruikt voor muizen op verschillende leeftijden, variërend van 2 tot 24 maanden met verschillende genotypen. Figuur 1 toont de isolatieopstelling en een close-up van een gecannuleerd hart tijdens enzymperfusie.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2,3-Butanedione monoxime</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G cannula</td>
			<td>Servoprax</td>
			<td>L10220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Aminopyridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A78403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrous DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D12345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aortic cannula</td>
			<td>Radnoti</td>
			<td>130163-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>342920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blunt surgical forceps</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>INS650915-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Calf Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>12133C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caffeine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circulating heated water bath</td>
			<td>Julabo</td>
			<td>ME</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type II</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS994177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>disscetion scissors</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>INS600124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-aspartat K+-salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-3</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F3715</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-3 AM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F1242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine 5&#8242;-triphosphate tris salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating coil</td>
			<td>Radnoti</td>
			<td>158821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Ratiopharm</td>
			<td>25.000 IE/5ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>induction chamber</td>
			<td>CWE incorporated</td>
			<td>13-40020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Cp-pharma</td>
			<td>1214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jacketed heart chamber</td>
			<td>Radnoti</td>
			<td>130160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1049360250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl x 6H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4 x 7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4 x 2H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon mesh (200 &#181;m)</td>
			<td>VWR-Germany</td>
			<td>510-9527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pasteur pipette</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z331759</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petri-dishes</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>150318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic Acid F-127</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probenecid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roller Pump</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td>ISM597D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical forceps</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>INS650908-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical scissors</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>INS700540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>suturing silk</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>NC9416241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z683531-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>86330</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of high quality murine atrial and ventricular myocytes for simultaneous measurements of ca2+ transients and l-type calcium current

Muismodellen spelen een cruciale rol in aritmieonderzoek en maken het mogelijk om belangrijke mechanismen van aritmogenese te bestuderen, waaronder een veranderde ionkanaalfunctie en calciumbehandeling. Voor dit doel zijn atriale of ventriculaire cardiomyocyten van hoge kwaliteit nodig om patch-clampmetingen uit te voeren of om calciumbehandelingsafwijkingen te onderzoeken. De beperkte opbrengst van hoogwaardige cardiomyocyten verkregen door de huidige isolatieprotocollen maakt beide metingen in dezelfde muis echter niet mogelijk. Dit artikel beschrijft een methode om hoogwaardige murine atriale en ventriculaire myocyten te isoleren via retrograde enzymgebaseerde Langendorff-perfusie, voor daaropvolgende gelijktijdige metingen van calciumtransiënten en L-type calciumstroom van één dier. Muizenharten worden verkregen en de aorta wordt snel gecannuleerd om bloed te verwijderen. Harten worden vervolgens in eerste instantie doordrenkt met een calciumvrije oplossing (37 °C) om het weefsel te dissociëren ter hoogte van geïntercaleerde schijven en daarna met een enzymoplossing die weinig calcium bevat om de extracellulaire matrix (37 °C) te verstoren. Het verteerde hart wordt vervolgens ontleed in boezems en ventrikels. Weefselmonsters worden in kleine stukjes gehakt en opgelost door voorzichtig op en neer te pipetteren. De enzymatische spijsvertering wordt gestopt en cellen worden stapsgewijs opnieuw geïntroduceerd in fysiologische calciumconcentraties. Na het laden met een fluorescerende Ca2+-indicator worden geïsoleerde cardiomyocyten voorbereid voor gelijktijdige meting van calciumstromen en transiënten. Daarnaast worden isolatie-valkuilen besproken en patch-clamp-protocollen en representatieve sporen van L-type calciumstromen met gelijktijdige calciumtransiënte metingen in atriale en ventriculaire murine myocyten geïsoleerd zoals hierboven beschreven.

De isolatieopbrengst wordt bepaald na herintroductie van calcium door 10 μL celsuspensie op een microscoopglaasje te pipetteren. Meer dan 100 levensvatbare, staafvormige, niet-contracterende cellen/10 μL voor atriale celisolatie en meer dan 1.000 levensvatbare, staafvormige, niet-contracterende cellen/10 μL voor ventriculaire celisolatie worden beschouwd als voldoende opbrengst en worden gewoonlijk verkregen met behulp van dit protocol. Atriale cellen verkregen met dit protocol toonden een verscheidenheid aan verschil...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current at JoVE.com

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current (Video) | JoVE

Muismodellen maken het mogelijk om belangrijke mechanismen van aritmogenese te bestuderen. Voor dit doel zijn cardiomyocyten van hoge kwaliteit nodig om patchklemmetingen uit te voeren. Hier wordt een methode beschreven om murine atriale en ventriculaire myocyten te isoleren via retrograde enzymgebaseerde Langendorff-perfusie, die gelijktijdige metingen van calciumtransiënten en L-type calciumstroom mogelijk maakt.

Isolatie van hoogwaardige murine atriale en ventriculaire myocyten voor gelijktijdige metingen van Ca2+ transiënten en L-type calciumstroom

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and ...

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Isolation and Genetic Manipulation of Adult Cardiac Myocytes for Confocal Imaging

Isolation and Genetic Manipulation of Adult Cardiac Myocytes for Confocal Imaging (Video) | JoVE

Isolatie en genetische manipulatie van Adult hartspiercellen voor confocale Imaging

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and ...

Isolation and Kv Channel Recordings in Murine Atrial and Ventricular Cardiomyocytes

Isolation and Kv Channel Recordings in Murine Atrial and Ventricular Cardiomyocytes (Video) | JoVE

Isolatie en Kv Channel Opnamen in Murine atriale en ventriculaire cardiomyocyten

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their ...

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents (Video) | JoVE

Isolatie van Human atriale Myocyten voor gelijktijdige metingen van Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Transients en Membraan Currents

The study of  electrophysiological properties of cardiac ion channels with the patch-clamp  technique and the exploration of cardiac cellular Ca2+ ...

Preparation of Pancreatic Acinar Cells for the Purpose of Calcium Imaging, Cell Injury Measurements, and Adenoviral Infection

Preparation of Pancreatic Acinar Cells for the Purpose of Calcium Imaging, Cell Injury Measurements, and Adenoviral Infection (Video) | JoVE

Bereiding van acinaire cellen ten behoeve van Calcium Imaging, Cell Injury Metingen en adenovirale infectie

The pancreatic acinar  cell is the main parenchymal cell of the exocrine pancreas and plays a primary  role in the secretion of pancreatic enzymes into ...

Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry (Video) | JoVE

Cytosole Calcium Metingen in Renal epitheelcellen door flowcytometrie

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...

Voltage and Calcium Dual Channel Optical Mapping of Cultured HL-1 Atrial Myocyte Monolayer

Voltage and Calcium Dual Channel Optical Mapping of Cultured HL-1 Atrial Myocyte Monolayer (Video) | JoVE

Spanning en Calcium Dual Channel Optische kaart brengen van Gekweekte HL-1 atriale Myocyte Monolayer

Optical mapping has proven to be a valuable technique to detect cardiac electrical activity on both intact ex vivo hearts and in cultured myocyte ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements (Video) | JoVE

Isolatie van Mitochondriën uit Minimale hoeveelheden muis skeletspieren voor Metingen High Throughput Microplate Respiratory

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production (Video) | JoVE

Ontwikkeling en karakterisering van<em&gt; In Vitro</em&gt; Microvaatje Netwerk- en kwantitatieve metingen van endotheliale [Ca<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt; i</sub&gt; En productie van stikstofoxide

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy (Video) | JoVE

Gelijktijdige meting van mitochondriale calcium en mitochondriale membraan potentieel in levende cellen door fluorescentie microscopie

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Simultaneous Isolation of High Quality Cardiomyocytes, Endothelial Cells, and Fibroblasts from an Adult Rat Heart

Simultaneous Isolation of High Quality Cardiomyocytes, Endothelial Cells, and Fibroblasts from an Adult Rat Heart (Video) | JoVE

Gelijktijdige isolatie van hoogwaardige cardiomyocyten, endothelcellen en fibroblasten uit een volwassen rat hart

The rat is an important animal model used in cardiovascular research, and rat cardiac cells are used routinely for in vitro analysis of the molecular ...