שיטה זו של הדמיית in vivo של תאי הרשתית מאפשרת חקירות של מחלות עיניים והבנת תפקודים תקינים של הרשתית. שיטה זו מספקת גישה פשוטה וניתנת לשחזור להדמיית in vivo של הרשתית על ידי מיקרוסקופיה של שני פוטונים. ייצוב נכון של העכבר הוא המפתח להשגת איכות תמונות in vivo.
תרגלו הצבת העכבר במחזיק הראש, והרגישו בנוח עם ההליך לפני שתנסו לרכוש תמונות. הרגיעו את בעל החיים על פי פרוטוקול השימוש המאושר בבעלי חיים. החל תמיסת הרחבת אישונים, והשאר את העכבר בחושך במשך חמש דקות כדי לאפשר לאישונים להתרחב.
אבטחו את פין תעלת האוזן התחתונה במצב המורחב פנימה ואת פין תעלת האוזן העליונה במצב נסוג. סובבו את הזרוע הראשית של מחזיק הראש עד שמוטת האוזניות מוטה בזווית של 60 מעלות מתחת לאופק. כשהעכבר פונה למוט הנשיכה, הרכיבו אוזן אחת על הסיכה התחתונה המורחבת כשהסיכה מוכנסת לתעלת האוזן.
לאחר שחרור הבורג המהדק את פין תעלת האוזן העליונה, הרחיבו את הסיכה לתעלת האוזן השנייה, והדקו מחדש את הבורג כדי לאבטח את הראש. ודא שהעכבר מאובטח במחזיק הראש. לחץ כלפי מטה בחלק העליון של הראש.
העכבר צריך להישאר היטב במוטות האוזניים, וראשו צריך להסתובב בחופשיות סביב ציר תעלות האוזן. כאשר מוט הנשיכה ממוקם לכיוון ראש העכבר, הרם בעדינות את ראש העכבר כדי לאפשר את הורדת החותכות המקסילריות לתוך מחזיק מוט הנשיכה, וחזור על מוט הנשיכה בכוח עדין כדי לאבטח את הראש. השתמש בבורג כדי להדק את מוט הנשיכה למקומו, והנח את העכבר והמחזיק על במת המיקרוסקופ.
החל טיפות סיכה על שתי העיניים של העכבר. סובבו את הזרוע הראשית של מחזיק הראש עד שהאישון של עין אחת יכוון בקו אחד עם נתיב האור, והכניסו כיסוי מספר 1.5 למחזיק המסנן הקומפקטי. לאחר הצמדת המחזיק לשלב המיקרוסקופ, הנמיכו את הכיסוי עד שהוא בא במגע עם ג'ל העיניים של חומר הסיכה מבלי לגעת בקרנית, והתאימו את השלב בממד X-Y ואת מיקום ה-Z האובייקטיבי עד שאור העירור בשדה הרחב יכסה את הקרנית במלואה.
השתמש בעינית כדי להמשיך להתאים את מיקום Z עד שהתאים הפלואורסצנטיים או המבנים ברשתית ייכנסו לפוקוס, והגדיל את מאיר האפיפלואורסצנציה לפי הצורך כדי לפתור תאים בודדים או מבנים בעלי עניין. כוונון עדין של יישור הרשתית עם נתיב האור בהדמיה. כוונן את זווית הראש עד שתתרחש רק הרחבה או כיווץ של האור מחוץ למיקוד בעת שינוי מישור המוקד, תוך מזעור עיוותי X-Y.
לאחר מכן, כבה את תאורת האפיפלואורסצנציה וסגור את תריס התאורה. להדמיית שני פוטונים, יש לעקוב אחר כל פרוטוקולי בטיחות הלייזר המוסדיים. כבה וכסה את כל אור הסביבה, והחלף את נתיב אור העירור ללייזר ואת נתיב אור הפליטה ל- PMTs.
בתוכנת רכישת התמונה, הגדר את גודל המסגרת ל- 512 על 512 ואת ממוצע המסגרת לשלוש. הגדר את צעדי Z כך שיתחילו בחלק העליון של הערימה ויתקדמו כלפי מטה, תוך מזעור הפעלת הלייזר הדו-פוטונית של הפוטורצפטורים. הפעל והפעל את ה- PMTs, והתאם את המתח ל- 680 וולט.
הפעל את תריסי ההדמיה והפליטה. התחל תצוגה מקדימה חיה של התמונה של רקמת היעד, החל מעוצמת לייזר של 1%, והתאם אוטומטית את בהירות התצוגה כדי להמחיש את התאים או המבנים המעניינים. אם רקמת המטרה עמומה או לא ברורה, הגדל את אחוז הספק הלייזר עד שהמבנים יהיו גלויים מבלי לעלות על 45 מילי-וואט.
תמרנו את שלב המיקרוסקופ בכיוון X-Y כדי להתמקד באזור ההדמיה הרצוי, ונווטו למישור Z עם המבנים בעלי העניין במיקוד. עבור ניסוי בהילוך זמן כרוני, פתח תמונה שהתקבלה בעבר כדי להשתמש בה כהפניה לתאים המעניינים, תוך הקפדה על כך שזווית ההדמיה בתמונה הנוכחית תהיה דומה לזו של התמונות הקודמות. לאחר מכן, נווט למישורי Z העליונים והתחתונים ביותר כדי להגדיר את גבולות Z של ערימת ההדמיה ולרכוש את התמונה.
לאחר רכישת כל התמונות, השבת את ה- PMTs ואת תריס הלייזר. החלף את נתיב אור העירור לתאורת אפיפלואורסצנציה ונתיב אור פליטה בחזרה לעינית. לאחר מכן, צא מתוכנת רכישת התמונות, כבה את הלייזר בממשק המחשב וכבה את החומרה בסדר הפעלה הפוך, למעט הציוד הפועל תמיד.
בסוף הניתוח, הסר את העכבר ממחזיק הראש, והשתמש ברקמה ללא מוך כדי להסיר בעדינות את ג'ל העיניים. לאחר מכן, יש למרוח משחת עיניים עם חומר סיכה על שתי העיניים, ולהניח את העכבר על כרית חימום במחזור מים חמים של 37 מעלות צלזיוס עם ניטור עד למנוחה מלאה, לפני החזרת העכבר למארזו. בעכברי VGlut-2-Cre, ניתן להבחין בבירור בסומות של תאי גנגליון ברשתית, ולעתים קרובות ניתן להבחין בפאסיקלים של האקסון.
מסלול האקסונים והדימוי השלילי של כלי הדם מאפשר זיהוי של ראש עצב הראייה בעכברי VGlut-2-Cre, שהוא שימושי כנקודת ציון בניסויי הדמיה כרוניים. בניגוד לתאי גנגליון ברשתית, נויריטים של תאי אמקרין נצפים לעתים קרובות יותר בשכבות הפרספקס הפנימיות. יום לאחר הזרקת NMDA תוך עינית, מיקרוגליה ברשתית מדגימה תהליכים קצרים או מורפולוגיה אמבואידית בהתאם לדיווחים קודמים.
אספקת הצבע הכחול של אוונס באמצעות הזרקה תוך-צפקית אחת 30 עד 60 דקות לפני ההדמיה גורמת לתיוג חזק של כלי הדם הנובעים מראש עצב הראייה שנמשך לפחות שבעה ימים. לאחר הקיבוע, ניתן למדוד את המרחק האמיתי בין זוגות תאים בתוך תושבות שלמות של רשתית שטוחה בסריקות קונפוקליות ולהתאים אותו למרחקי פיקסלים in vivo כדי לקבוע את גודל הפיקסלים הממוצע של תמונות in vivo. מיקרוספרות פלואורסצנטיות המוזרקות לעיני עכברים מאפשרות מדידה של קוטר המיקרוספרה in vivo, מה שנותן הערכת גודל פיקסלים מעט גדולה יותר אך עם שונות רבה יותר.
ניתן לשלב הדמיית in vivo עם ניתוחים היסטולוגיים כמו אימונוסטינינג והכלאה in situ. שיטות אלה יכולות לזהות סוגי תאים ספציפיים ולבחון ביטוי גנים של תאים בעלי תמונה.
