Este método de obtención de imágenes in vivo de las células de la retina permite investigar enfermedades oftalmológicas y comprender las funciones normales de la retina. Este método proporciona un enfoque sencillo y altamente reproducible para la obtención de imágenes in vivo de la retina mediante microscopía de dos fotones. Estabilizar correctamente el ratón es clave para obtener imágenes in vivo de calidad.
Practique colocar el mouse en el soporte de la cabeza y siéntase cómodo con el procedimiento antes de intentar adquirir imágenes. Sedar al animal de acuerdo con el protocolo de uso animal aprobado. Aplique la solución de dilatación de la pupila y deje el ratón en la oscuridad durante cinco minutos para permitir que las pupilas se dilaten.
Asegure el pasador del canal auditivo inferior en la posición extendida hacia adentro y el pasador del canal auditivo superior en la posición retirada. Gire el brazo principal del soporte para la cabeza hasta que la barra del auricular esté inclinada en un ángulo de 60 grados por debajo de la horizontal. Con el ratón mirando hacia la barra de mordida, monte una oreja en el pasador inferior extendido con el alfiler insertado en el canal auditivo.
Después de aflojar el tornillo que asegura el pasador del canal auditivo superior, extienda el pasador en el otro canal auditivo y vuelva a apretar el tornillo para asegurar la cabeza. Asegúrese de que el ratón esté seguro en el soporte de la cabeza. Presione hacia abajo en la parte superior de la cabeza.
El ratón debe permanecer seguro en las barras del oído, y su cabeza debe girar libremente alrededor del eje de los canales auditivos. Con la barra de mordida colocada hacia la cabeza del ratón, eleve suavemente la cabeza del ratón para permitir que los incisivos maxilares se bajen en el soporte de la barra de mordida y retraiga la barra de mordida con una fuerza suave para asegurar la cabeza. Use el tornillo para asegurar la barra de mordida en su posición y coloque el mouse y el soporte en la plataforma del microscopio.
Aplique gotas oftálmicas lubricantes en ambos ojos del ratón. Gire el brazo principal del portacabezas hasta que la pupila de un ojo esté orientada en línea con la trayectoria de la luz, y coloque un cubreobjetos número 1.5 en el soporte del filtro compacto. Después de asegurar el soporte a la etapa del microscopio, baje el cubreobjetos hasta que entre en contacto con el gel lubricante para los ojos sin tocar la córnea, y ajuste la etapa en la dimensión X-Y y la posición Z del objetivo hasta que la luz de excitación de campo amplio cubra completamente la córnea.
Use el ocular para continuar ajustando la posición Z hasta que las células o estructuras fluorescentes de la retina entren en foco, aumentando el iluminador de epifluorescencia según sea necesario para resolver células individuales o estructuras de interés. Ajuste la alineación de la retina con la trayectoria de la luz de imagen. Ajuste el ángulo de la cabeza hasta que solo se produzca una expansión o contracción de la luz desenfocada al cambiar el plano focal, minimizando las distorsiones X-Y.
Luego, apague el iluminador de epifluorescencia y cierre el obturador del iluminador. Para imágenes de dos fotones, siga todos los protocolos institucionales de seguridad láser. Apague y cubra toda la luz ambiental, y cambie la ruta de la luz de excitación al láser y la ruta de la luz de emisión a los PMT.
En el software de adquisición de imágenes, establezca el tamaño del fotograma en 512 por 512 y el promedio del fotograma en tres. Configure el Z-stepping para comenzar en la parte superior de la pila y progresar hacia abajo, minimizando la activación láser de dos fotones de los fotorreceptores. Encienda y habilite los PMT, y ajuste el voltaje a 680 voltios.
Habilite las persianas de imagen y emisión. Comience una vista previa de la imagen en vivo del tejido objetivo, comenzando con una potencia láser del 1%, y ajuste automáticamente el brillo de la pantalla para visualizar las células o estructuras de interés. Si el tejido objetivo es tenue o poco claro, aumente el porcentaje de potencia del láser hasta que las estructuras se hagan visibles sin superar los 45 milivatios.
Maniobra la etapa del microscopio en la dirección X-Y para centrarse en un área de imagen deseada y navegar hasta el plano Z con las estructuras de interés enfocadas. Para un experimento de lapso de tiempo crónico, abra una imagen obtenida previamente para usarla como referencia para las células de interés, teniendo cuidado de que el ángulo de imagen en la imagen actual sea similar al de las imágenes anteriores. A continuación, navegue hasta los planos Z superior e inferior de interés para establecer los límites Z de la pila de imágenes y adquirir la imagen.
Cuando se hayan adquirido todas las imágenes, desactive los PMT y el obturador láser. Cambie la trayectoria de la luz de excitación a la iluminación de epifluorescencia y la trayectoria de la luz de emisión de vuelta al ocular. Luego, salga del software de adquisición de imágenes, apague el láser en la interfaz de la computadora y apague el hardware en orden de inicio inverso, con la excepción del equipo siempre encendido.
Al final del análisis, retire el mouse del soporte de la cabeza y use un pañuelo sin pelusa para quitar suavemente el gel para los ojos. Luego, aplique ungüento lubricante para los ojos en ambos ojos y coloque el mouse en una almohadilla térmica de circulación de agua tibia de 37 grados centígrados con monitoreo hasta la decúbito completa, antes de devolver el mouse a su carcasa. En ratones VGlut-2-Cre, los somas de células ganglionares de la retina son claramente discernibles y los fascículos axónicos son a menudo evidentes.
La trayectoria de los axones y la imagen negativa de la vasculatura facilita la identificación de la cabeza del nervio óptico en ratones VGlut-2-Cre, lo que es útil como punto de referencia en experimentos de imágenes crónicas. En contraste con las células ganglionares de la retina, las neuritas de células amacrinas se observan con mayor frecuencia en las capas plexiformes internas. Un día después de la inyección intraocular de NMDA, la microglía retiniana demuestra procesos cortos o morfología ameboide de acuerdo con informes anteriores.
La administración de colorante azul de Evans a través de una sola inyección intraperitoneal de 30 a 60 minutos antes de la obtención de imágenes induce un fuerte etiquetado de los vasos sanguíneos que emanan de la cabeza del nervio óptico que persiste durante al menos siete días. Después de la fijación, la distancia real entre pares de células dentro de montajes enteros de retina aplanados se puede medir en escaneos confocales y emparejarse con distancias de píxeles in vivo para determinar el tamaño promedio de píxeles de las imágenes in vivo. Las microesferas fluorescentes inyectadas en los ojos de ratones permiten medir el diámetro de la microesfera in vivo, dando una estimación de tamaño de píxel ligeramente mayor pero con más varianza.
Las imágenes in vivo se pueden combinar con análisis histológicos como inmunotinción e hibridación in situ. Estos métodos pueden identificar tipos específicos de células y examinar la expresión génica de las células fotografiadas.
